蔬菜中有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量快速檢測—酶抑制率法(分光光度法)

1、 有機磷和氨基甲酸酯類有機磷和氨基甲酸酯類 農(nóng)藥殘留量快速檢測農(nóng)藥殘留量快速檢測 酶抑制率法酶抑制率法(分光光度法分光光度法) 分光光度法的原理簡介酶抑制率法(分光光度法)吸光光度法吸光光度法: 基于物質(zhì)對光的選擇性吸收而建立的分析方法, 包括目測比色法和分光光度法。不同物質(zhì)由于結(jié)構(gòu)不同,所吸收光的波長及吸收程度不同,這就是物質(zhì)對光的選擇性吸收當(dāng)一束強度為I0的平行單色光通過一均勻的吸收介質(zhì)時，由于吸光物質(zhì)分子與光子的作用，一部分光子被吸收，一部分光子透過介質(zhì)。設(shè)透過的光強度為It，則透光率T定義為 T=It /I0，而lgT稱為吸光度A，即 lgT=lgI0/It 入射光入射光 I0透射光透

2、射光 It測量某物質(zhì)對不同波長單色光的吸收程度，以波長（測量某物質(zhì)對不同波長單色光的吸收程度，以波長（ ）為橫為橫坐標(biāo)，吸光度（坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制吸光度隨波長的變化可得）為縱坐標(biāo)，繪制吸光度隨波長的變化可得一曲線，此曲線即為一曲線，此曲線即為吸收光譜吸收光譜。不同濃度的同一物質(zhì)，它的最大吸收波長是不變的，但吸光不同濃度的同一物質(zhì)，它的最大吸收波長是不變的，但吸光度隨濃度增大而增大。度隨濃度增大而增大。 在最大吸收波長處測量吸光度，其靈敏度最高。在最大吸收波長處測量吸光度，其靈敏度最高。有色溶液對某一波長光吸收的強度與有色物質(zhì)的濃度c及吸光溶液的液層厚度b成正比，稱為光吸收定律或朗

3、伯比爾定律，其數(shù)學(xué)表達式為A=bc1.00.50ACA100500T %T式中：b為液層厚度，單位為cm；c為濃度，單位為mol.L-1；為摩爾吸光系數(shù)，單位為L.mol-1.cm-1。光電比色法光電比色法分光光度法（紫外分光光度法（紫外-可見分光光度法）可見分光光度法）UV-VISUltraviolet Visual Spectroscopy0.575光源光源單色器單色器吸收池吸收池檢測器檢測器顯示顯示I0It參比參比樣品樣品bCTIIAtlglg0入射光入射光 I0透射光透射光 It原理 在一定條件下，有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對膽堿酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率與農(nóng)藥的濃度呈正比。正常情

4、況下，酶催化神經(jīng)傳導(dǎo)代謝產(chǎn)物（乙酰膽堿）水解，其水解產(chǎn)物與顯色劑反應(yīng)，產(chǎn)生黃色物質(zhì)，用分光光度計在412nm處測定吸光度隨時間的變化值，計算出抑制率，通過抑制率可以判斷出樣品中是否有高劑量有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的存在。原理試劑試劑lpH8.0緩沖溶液 分別取11.9g無水磷酸氫二鉀與.g磷酸二氫鉀，用1000mL蒸餾水溶解。l顯色劑 分別取160mg二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）和15.6mg碳酸氫鈉，用20mL緩沖溶液溶解，4冰箱中保存。試劑試劑l底物：取25.0mg硫代乙酰膽堿，加3.0mL蒸餾水溶解，搖勻后置4冰箱中保存?zhèn)溆?。l乙酰膽堿酯酶 根據(jù)酶的活性情況，用緩沖溶液溶解，3min的

5、吸光度變化A0值應(yīng)控制在0.3以上。搖勻后置4冰箱中保存?zhèn)溆谩７治霾襟E樣品處理：選取有代表性的蔬菜樣品，沖洗掉表面泥土，剪成1cm左右見方碎片，取樣品1g，放入燒杯或提取瓶中，加入5mL緩沖溶液，振蕩12min，倒出提取液,靜置35min,待用。對照溶液測試： 先于試管中加入2.5mL緩沖溶液，再加入0.lmL酶液、0.1mL顯色劑，搖勻后于37放置15min以上（每批樣品的控制時間應(yīng)一致）。加入0.lmL底物搖勻，此時檢液開始顯色反應(yīng)，應(yīng)立即放入儀器比色池中，記錄反應(yīng)3 min的吸光度變化值A(chǔ)0樣品溶液測試：先于試管中加入2.5mL樣品提取液，其它操作與對照溶液測試相同，記錄反應(yīng)3min的吸

6、光度變化值A(chǔ)t結(jié)果計算 抑制率(%)=(A0-At)/ A0100式中： A0對照溶液反應(yīng)3min吸光度的變化值； At樣品溶液反應(yīng)3min吸光度的變化值； 結(jié)果判定 l結(jié)果以酶被抑制的程度（抑制率）表示。l當(dāng)蔬菜樣品提取液對酶的抑制率50%時,表示蔬菜中有高劑量有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥存在，樣品為陽性結(jié)果。l陽性結(jié)果的樣品需要重復(fù)檢驗2次以上。酶抑制率法對部分農(nóng)藥的檢出限農(nóng)藥名稱檢出限mg/kg農(nóng)藥名稱檢出限mg/kg敵敵畏0.1氧化樂果0.8對硫磷1甲基異柳磷5辛硫磷0.3滅多威0.1甲胺磷2丁硫克百威0.05馬拉硫磷4敵百蟲0.2樂果3呋南丹0.05說明 l蔥、蒜、蘿卜、韭菜、芹菜、香菜

7、、茭白、蘑菇及番茄汁液中，含有對酶有影響的植物次生物質(zhì)，容易產(chǎn)生假陽性。處理這類樣品時，可采取整株（體）蔬菜浸提。對一些含葉綠素較高的蔬菜，也可采取整株（體）蔬菜浸提的方法，減少色素的干擾。 l當(dāng)溫度條件低于37 C，酶反應(yīng)的速度隨之放慢，加入酶液和顯色劑后放置反應(yīng)的時間應(yīng)相對延長，延長時間的確定，應(yīng)以膽堿酯酶空白對照測試3min的吸光度變化D A0值在0.3以上，即可往下操作。注意樣品放置時間應(yīng)與空白對照溶液放置時間一致才有可比性。膽堿酯酶空白對照溶液3min的吸光度變化D A0值0.3 的原因：一是酶的活性不夠，二是溫度太低。人有了知識，就會具備各種分析能力，明辨是非的能力。所以我們要勤懇讀書，廣泛閱讀，古人說“書中自有黃金屋?！蓖ㄟ^