第十六章 細(xì)胞因子與黏附分子檢測(cè)

1、第一章第一章 血液標(biāo)本采集與處理血液標(biāo)本采集與處理臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第十六章第十六章 細(xì)胞因子與黏附分子檢測(cè)細(xì)胞因子與黏附分子檢測(cè)目 錄第一節(jié) 概述第二節(jié) 臨床常用的測(cè)定方法第三節(jié) 細(xì)胞因子與黏附分子測(cè)定的臨床應(yīng)用第一節(jié)第一節(jié) 概述概述重點(diǎn)提示細(xì)胞因子與黏附分子概念細(xì)胞因子的作用特點(diǎn)細(xì)胞因子的生物學(xué)功能黏附分子的生物學(xué)功能概念細(xì)胞因子（細(xì)胞因子（cytokinecytokine）是由免疫細(xì)胞及組織細(xì)胞表達(dá)并分泌的，在細(xì)胞間發(fā)揮相互調(diào)控作用的一類小分子蛋白質(zhì)或多肽，通過與細(xì)胞表面相應(yīng)受體的結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。概念黏附分子（黏附分子（adhesion moleculesadhesion molec

2、ules，AMAM）是由細(xì)胞產(chǎn)生、介導(dǎo)細(xì)胞間或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間相互結(jié)合的分子，以受體-配體結(jié)合的形式發(fā)揮作用。一、細(xì)胞因子及其受體的特性與功能細(xì)胞因子及其受體的特性與功能白細(xì)胞介素（interleukin，IL）干擾素（interferon，IFN）集落刺激因子（colony stimulating factor，CSF）腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）生長(zhǎng)因子（growth factor，GF)趨化因子（chemokine）細(xì)胞因子的種類細(xì)胞因子的種類一、細(xì)胞因子及其受體的特性與功能細(xì)胞因子及其受體的特性與功能低分子量的多肽或糖蛋白，大部分為單體，半衰期短

3、。具有高效性、多效性、重疊性、網(wǎng)絡(luò)性、協(xié)同性和拮抗性。細(xì)胞因子的特性細(xì)胞因子的特性一、細(xì)胞因子及其受體的特性與功能細(xì)胞因子及其受體的特性與功能參與調(diào)控免疫細(xì)胞的發(fā)育、分化和功能。參與調(diào)控機(jī)體的免疫應(yīng)答。參與體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)等作用。細(xì)胞因子生物學(xué)功能細(xì)胞因子生物學(xué)功能一、細(xì)胞因子及其受體的特性與功能細(xì)胞因子及其受體的特性與功能細(xì)胞因子與相應(yīng)受體結(jié)合后發(fā)揮效應(yīng)。由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)三部分構(gòu)成。組織反應(yīng)性：受體的分布及密度。膜型受體與可溶型受體。細(xì)胞因子受體的共同特性細(xì)胞因子受體的共同特性二、黏附分子的特性與功能二、黏附分子的特性與功能選擇素家族(selectin family )鈣黏素家族(c

4、adherin family)整合素家族（integrin family)免疫球蛋白超家族（Immunogolobulin superfamily,IgSF) 分分 類類二、黏附分子的特性與功能二、黏附分子的特性與功能缺少跨膜和胞內(nèi)部分，分子量小。可直接分泌到血液和其他體液。具有黏附分子的結(jié)合活性。其水平的增高程度與疾病相關(guān)：膿毒血癥：可溶性E-選擇素，升高20倍23倍。HIV感染：可溶性L-選擇素，升高2倍3倍。 可溶型黏附分子可溶型黏附分子二、黏附分子的特性與功能二、黏附分子的特性與功能參與免疫細(xì)胞的分化和發(fā)育參與免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)參與傷口愈合、血栓形成淋巴細(xì)胞的歸巢參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡 生物

5、學(xué)功能生物學(xué)功能第二節(jié)第二節(jié) 臨床常用的測(cè)定方法臨床常用的測(cè)定方法重點(diǎn)提示基本方法方法學(xué)評(píng)價(jià)注意事項(xiàng) 檢測(cè)水平檢測(cè)水平基因水平：分子生物學(xué)法蛋白水平活性：生物學(xué)方法含量：免疫學(xué)測(cè)定法一、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)一、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)夾心法ELISA：一步法和兩步法單克隆抗體或多克隆抗體用于細(xì)胞因子檢測(cè)可溶型細(xì)胞因子受體或黏附分子檢測(cè)首選方法 基本方法基本方法一、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)一、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)特異、簡(jiǎn)便成本低、易于推廣可大批量同時(shí)檢測(cè)且廢棄物便于處理敏感性偏低不能判斷細(xì)胞因子的生物學(xué)活性 優(yōu)優(yōu) 點(diǎn)點(diǎn) 缺缺 點(diǎn)點(diǎn)一、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)一、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)標(biāo)本：建議采用血漿（肝素或EDTA抗凝血）檢測(cè)

6、條件：適時(shí)、適當(dāng)刺激劑、檢測(cè)時(shí)點(diǎn)干擾因素：標(biāo)本嚴(yán)重溶血、污染、分泌與降解 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)二、二、化學(xué)發(fā)光酶免疫試驗(yàn)CLEIA：雙抗體夾心法自動(dòng)化分析體液中細(xì)胞因子或可溶型細(xì)胞因子受體的定量 基本方法基本方法二、二、化學(xué)發(fā)光酶免疫試驗(yàn)特異性好、靈敏度高、線性范圍寬試劑穩(wěn)定，可自動(dòng)化檢測(cè)缺點(diǎn)是不能區(qū)分細(xì)胞因子的生物學(xué)活性 方法學(xué)評(píng)價(jià)方法學(xué)評(píng)價(jià)三、三、流式細(xì)胞術(shù)基于熒光抗體染色技術(shù)并利用流式細(xì)胞儀高分辨力所建立的方法。單個(gè)細(xì)胞水平的檢測(cè)。用于細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子、細(xì)胞表面黏附分子和細(xì)胞因子受體的檢測(cè)。 基本方法基本方法三、三、流式細(xì)胞術(shù) 基本步驟基本步驟1分離和培養(yǎng)待檢細(xì)胞 2細(xì)胞破膜與固定 3封閉非特

7、異性結(jié)合位點(diǎn) 4染色與分析 三、三、流式細(xì)胞術(shù)區(qū)分不同分泌特性的細(xì)胞亞群：區(qū)分不同分泌特性的細(xì)胞亞群： Th1細(xì)胞 IFN-Th2細(xì)胞 IL-4細(xì)胞表面的黏附分子或細(xì)胞因子受體：細(xì)胞表面的黏附分子或細(xì)胞因子受體：直接或間接熒光抗體染色無需作細(xì)胞固定和非特異性結(jié)合位點(diǎn)的封閉 三、三、流式細(xì)胞術(shù)具有特異、高效、靈敏等特點(diǎn)，進(jìn)行多參數(shù)相關(guān)分析接近生物體的分析條件，更準(zhǔn)確反映體內(nèi)狀況。缺點(diǎn)是流式細(xì)胞儀較昂貴，不易普及使用。方法學(xué)評(píng)價(jià)方法學(xué)評(píng)價(jià)三、三、流式細(xì)胞術(shù)標(biāo)本處理：活細(xì)胞，保持良好狀態(tài)對(duì)照選擇：未刺激對(duì)照、激活對(duì)照、同型對(duì)照熒光素選擇：低表達(dá)-PE、APC高表達(dá)-FITC 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)四、四、

8、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn) 基本方法基本方法ELISPOT每個(gè)斑點(diǎn)代表單個(gè)分泌待測(cè)細(xì)胞因子的細(xì)胞。斑點(diǎn)顏色深淺與細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的含量相關(guān)。四、四、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)優(yōu)于傳統(tǒng)分泌細(xì)胞的檢測(cè)類似于體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)環(huán)境比常規(guī)ELISA 法的靈敏度高200 倍引入生物素與親合素放大系統(tǒng)，可大大提高靈敏度方法學(xué)評(píng)價(jià)方法學(xué)評(píng)價(jià)四、四、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)選用的底物應(yīng)在反應(yīng)后形成不溶性產(chǎn)物抗體：高親和力、高特異性、低內(nèi)毒素的特點(diǎn)同時(shí)檢測(cè)兩種細(xì)胞因子，如IL-2 和IL-4結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn) 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)五、免疫學(xué)測(cè)定方法學(xué)評(píng)價(jià)五、免疫學(xué)測(cè)定方法學(xué)評(píng)價(jià)影響因素較少，特異性高操作簡(jiǎn)便、快速，易于推廣大部分細(xì)胞因子均有商品化

9、試劑盒，方便檢測(cè)重復(fù)性好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定 優(yōu)優(yōu) 點(diǎn)點(diǎn)五、免疫學(xué)測(cè)定方法學(xué)評(píng)價(jià)五、免疫學(xué)測(cè)定方法學(xué)評(píng)價(jià)所測(cè)定的只是蛋白含量，與其生物活性不一定呈正比。結(jié)果與所用的抗體來源及親和力有很大的關(guān)系。敏感性相對(duì)較低，不如生物學(xué)測(cè)定法。干擾測(cè)定：標(biāo)本中可溶性受體，某些細(xì)胞因子結(jié)合蛋白或載體蛋白。 缺缺 點(diǎn)點(diǎn)第三節(jié)第三節(jié)細(xì)胞因子與黏附分子測(cè)定的臨床應(yīng)用細(xì)胞因子與黏附分子測(cè)定的臨床應(yīng)用重點(diǎn)提示臨床應(yīng)用原則特定疾病的輔助診斷一、臨床應(yīng)用原則一、臨床應(yīng)用原則全身免疫或炎癥狀態(tài)：血漿或血清細(xì)胞分泌細(xì)胞因子特性：外周血單個(gè)核細(xì)胞或相應(yīng)細(xì)胞炎癥局部細(xì)胞因子的水平：局部分泌液細(xì)胞內(nèi)定位檢測(cè)：相應(yīng)細(xì)胞基因表達(dá)水平：相應(yīng)細(xì)胞療

10、效觀察和預(yù)后判斷：急性期和恢復(fù)期雙份標(biāo)本細(xì)胞表面細(xì)胞因子受體或黏附分子：細(xì)胞活性或狀態(tài)標(biāo)本的適當(dāng)選取標(biāo)本的適當(dāng)選取一、臨床應(yīng)用原則一、臨床應(yīng)用原則不同的檢測(cè)目的，選擇適宜的檢測(cè)方法。聯(lián)合應(yīng)用不同的檢測(cè)方法，綜合分析檢驗(yàn)結(jié)果。 生物活性：生物學(xué)方法 基因水平：實(shí)時(shí)RT-PCR 細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子：FCM方法的聯(lián)合應(yīng)用方法的聯(lián)合應(yīng)用一、臨床應(yīng)用原則一、臨床應(yīng)用原則復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)或效應(yīng)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)單一檢測(cè)：不能提供有效的疾病信息聯(lián)合檢測(cè)，綜合分析項(xiàng)目的聯(lián)合檢測(cè)項(xiàng)目的聯(lián)合檢測(cè)二、特定疾病的輔助診斷二、特定疾病的輔助診斷細(xì)胞因子風(fēng)暴變態(tài)反應(yīng)性疾病自身免疫病免疫缺陷病器官移植排斥反應(yīng)惡性腫瘤細(xì)胞因子與疾病細(xì)胞因子與疾病二、特定疾病的輔助診斷二、特定疾病的輔助診斷動(dòng)脈粥樣硬化腎臟疾病肝臟疾病自身免疫病黏附分子與疾病黏附分子與疾病三、評(píng)估機(jī)體的免疫狀態(tài)三、評(píng)估機(jī)體的免疫狀態(tài)機(jī)體免疫應(yīng)答的強(qiáng)弱，可通過細(xì)胞因子或黏附分子的表達(dá)水平來反映。當(dāng)疾病好轉(zhuǎn)或恢復(fù)時(shí)，其免疫狀態(tài)調(diào)整，細(xì)胞因子或黏附分子也恢復(fù)正常。四、疾病療效監(jiān)測(cè)及指導(dǎo)用藥四、疾病療效監(jiān)測(cè)及指導(dǎo)用藥人工重組細(xì)胞因子的應(yīng)用選擇細(xì)胞因子的種類及劑量疾病療效監(jiān)測(cè)細(xì)胞因子拮抗劑或抗體應(yīng)用本章小結(jié)細(xì)胞因子與黏附分子是構(gòu)成免疫應(yīng)答的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，檢測(cè)這些分子可反映機(jī)體的免疫狀態(tài)。免疫學(xué)測(cè)定法是細(xì)胞因子與黏附分子常用的檢測(cè)方法，包括酶