實(shí)驗(yàn)七 蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Western Blotting）

1、實(shí)驗(yàn)七實(shí)驗(yàn)七 蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Western BlottingWestern Blotting）一一 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 n Western Blotting 是用來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)的一種技術(shù)。n首先將含有待測(cè)蛋白的蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行凝膠電泳分離，然后將已經(jīng)分離的蛋白質(zhì)通過(guò)電泳技術(shù)從凝膠轉(zhuǎn)移到固體支持物上，這一固體支持物目前常為硝酸纖維素薄膜。隨后以待測(cè)蛋白質(zhì)上抗原決定簇特異性的抗體（稱為第一抗體）為探針，與固體支持物上的蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫反應(yīng)，最后用偶聯(lián)有辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酯酶的抗第一抗體的抗體（第二抗體）與第一抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)，只有與第一抗體特異性結(jié)合的待測(cè)蛋白才能與第二抗體

2、發(fā)生免疫反應(yīng)。在有辣根過(guò)氧化物酶的底物用顯色劑存在時(shí)就會(huì)出現(xiàn)顏色反應(yīng)，結(jié)合有第一抗體、第二抗體的待測(cè)蛋白，通過(guò)顏色反應(yīng)即能顯現(xiàn)出來(lái)。一一 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 n電泳將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到固體支持物上是通過(guò)電轉(zhuǎn)移儀器完成的。它是將固體支持物面對(duì)陽(yáng)極、凝膠面對(duì)陰極，二者結(jié)合在一起，然后將外面二側(cè)用Whatman 3MM濾紙結(jié)合，形成“三明治”結(jié)構(gòu)，放入電轉(zhuǎn)移儀器上，加入電泳緩沖液，通上電源后，蛋白質(zhì)即可從凝膠上轉(zhuǎn)移到固體支持物上。一一 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 其定量關(guān)系符合以下公式：nVe=Vo+KV1nVe：某一溶質(zhì)的洗脫體積nVo：層析柱的外水體積nVi：層析柱的內(nèi)水體積nK：某一溶質(zhì)的分配系數(shù)1試劑電

3、轉(zhuǎn)移緩沖液 pH8.3n39mM甘氨酸n4.8mM Tris堿n0.037% SDSn20% 甲醇n混合2.9克甘氨酸，5.8克Tris,0.37克SDS,加200ml甲醇，定容到1000ml.封閉緩沖液：5%（W/V）脫脂奶粉溶于PBS中二試劑和器材二試劑和器材1試劑nPBS: NaCl 8g,KCl 0.2g,Na2HPO4 1.44g,KH2PO4 0.24g 加雙蒸水800ml,用HCl調(diào)pH到pH7.4,再加水到1000ml,分裝后，15磅20分鐘滅菌。n4-氯萘酚顯色液：用30mg 4-氯萘酚（簡(jiǎn)稱4-CN）溶于1ml無(wú)水乙醇中制成母液。將5014-CN對(duì)母液和5130%的H2O2

4、加入到5ml 0.05M/L Tris-Cl(pH7.6)中。n 氨基黑染色液：0.1%氨基黑10-B、45%甲醇、10%冰乙酸n氨基黑脫色液：90%甲醇、2%冰乙酸、8%水二試劑和器材二試劑和器材 2器材n電轉(zhuǎn)移儀器n恒溫?fù)u床n硝酸纖維素薄膜nWhatman 3MM濾紙n電泳儀 裁紙刀 n25cm培養(yǎng)皿 玻璃棒二試劑和器材二試劑和器材n1蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移n戴上手套，取下SDS-PAGE凝膠，小心剝離凝膠。裁剪與凝膠同樣大的硝酸纖維素薄膜和六層Whatman 3MM濾紙，在硝酸纖維素薄膜左下角剪去一角作為標(biāo)記。將硝酸纖維素薄膜漂浮于去離子水的表面，使水從膜的下部浸透以去除其間氣泡，將Whatman

5、 3MM濾紙?jiān)陔娹D(zhuǎn)移緩沖液中浸濕，用蒸餾水淋洗石墨電極，先將三層浸濕的濾紙放在陽(yáng)極上，在濾紙表面滾動(dòng)玻璃棒以除去其間的氣泡，再將浸濕的硝酸纖維素薄膜小心平鋪在濾紙上，用玻璃棒小心去除氣泡。隨后將12%SDS-PAGE凝膠舒展平鋪在硝酸纖維素薄膜上，用玻璃棒小心去除氣泡，再將三層浸濕的濾紙平鋪在凝膠上，沁心去除氣泡，最后加上石墨電極板，接通電源進(jìn)行電轉(zhuǎn)移，電流的大小由凝膠的大小決定，為0.65mA/平方厘米。電轉(zhuǎn)移2小時(shí)后，停止通電，卸掉電轉(zhuǎn)移裝置，取下凝膠進(jìn)行考馬斯亮蘭染色，以檢測(cè)電轉(zhuǎn)移是否完全。小心取下硝酸纖維素薄膜，放在一張干濾紙上，吸干30-60分鐘后，開始進(jìn)顯色反應(yīng)。三三 操作步驟操作

6、步驟 n2顯色反應(yīng)n首先進(jìn)行分子量標(biāo)記的氨基黑染色。切下轉(zhuǎn)有分子量標(biāo)記的硝酸纖維素薄膜，用含有0.3%吐溫20的PBS緩沖液漂洗三次后（每次15分鐘），再將其浸入氨基黑染液中，室溫染色5分鐘，然后置于氨基黑脫色液中脫去背景，水中漂洗后景干備用。三三 操作步驟操作步驟 n轉(zhuǎn)有樣品的硝酸纖維素薄膜用含有5%脫脂牛奶的PBS緩沖液在室溫下封閉2小時(shí)，同時(shí)1：100加入兔抗GST第一抗體，平緩搖動(dòng)，室溫保溫1小時(shí)。然后用PBS緩沖液將硝酸纖維素薄膜漂洗4次，每次 30分鐘。將辣根過(guò)氧分物酶標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白第二抗 體用封閉液稀釋50倍后，加入吐溫20至終濃度為0.05%，然后與上述漂洗的硝酸纖維素薄膜進(jìn)行反應(yīng)，將膜浸于其中，平放在平緩搖動(dòng)的搖床平臺(tái)上，室溫溫育 1小時(shí)后，用PBS緩沖液將硝酸纖維素薄膜漂洗4次，每次5分鐘，再加入4-氯萘酚顯色液，加入 51 的30%H2O2，將硝酸纖維素薄膜置于其中緩慢搖動(dòng)，待所檢測(cè)的蛋白帶顯色達(dá)到最深程度后，將硝酸纖維素薄膜轉(zhuǎn)入 PBS 溶液中停止顯色反應(yīng)。取出硝酸纖維素薄膜，自然晾干后拍照保存結(jié)果。三三 操作步驟操作步驟 n1. 為什么裁剪的濾紙必須與凝膠大小完