體內(nèi)藥物分析培訓(xùn)講義(63)-醫(yī)藥保健

1、http:/整理ppt體內(nèi)藥物分析Biopharmaceutical analysishttp:/整理ppt第一章 體內(nèi)藥物分析概述一、體內(nèi)藥物分析的定義 狹義：利用現(xiàn)代分析儀器和分離手段對(duì)人和動(dòng)物血液、尿和組織等樣品進(jìn)行定性定量的分析 廣義：通過體內(nèi)藥物濃度的分析，了解藥物在體內(nèi)的數(shù)量和質(zhì)量的變化，獲得藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，為藥品的生產(chǎn)、臨床應(yīng)用作出評(píng)價(jià)http:/整理ppt二、體內(nèi)藥物分析的意義（一）在新藥評(píng)價(jià) 和開發(fā)中的意義 1全面質(zhì)量控制 2新藥報(bào)批 3為設(shè)計(jì)新藥提供信息 從代謝產(chǎn)物中開發(fā)新藥 保泰松羥基保泰松（作用強(qiáng)、副作用小） 非那西丁撲熱息痛 前藥設(shè)計(jì) 新劑型的研究，緩控釋、經(jīng)皮制劑等

2、 以上內(nèi)容必須通過測(cè)定體內(nèi)藥物濃度得以解決http:/整理ppt（二）臨床合理用藥中的意義 1血藥濃度與藥理作用http:/整理ppt2. 影響血藥濃度的因素（1）機(jī)體因素 a生理因素 年齡、性別、生理狀況 b病理因素 c遺傳因素（2）藥物因素 a劑型因素（生物利用度問題） b藥物合并使用（酶抑、酶促） c時(shí)間因素http:/整理ppt（三）藥物中毒解救的意義（四）興奮劑檢測(cè)的意義http:/整理ppt三、體內(nèi)藥物分析的對(duì)象3從樣品的來源分1從分析物分母體藥物代謝物內(nèi)源性物質(zhì)2從生物樣品種類分均勻樣品 非均勻樣品人體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物http:/整理ppt四、體內(nèi)藥物分析的任務(wù)（一）方法學(xué)的研究（二）治

3、療藥物監(jiān)測(cè) TDM，therapeutical Drug Monitoring1定義2哪些藥物需進(jìn)行體內(nèi)血藥濃度監(jiān)測(cè)http:/整理ppt有效血藥濃度范圍窄，稍高毒性大，稍低無療效劑量小，毒性大的藥物個(gè)體差異大，劑量難以控制藥物毒性反應(yīng)與疾病癥狀相似多種藥物合并應(yīng)用，有中毒危險(xiǎn)胃腸道、肝臟、腎臟疾病呈非線性動(dòng)力學(xué)的藥物判斷患者用藥的依從性 http:/整理ppt（三）藥代動(dòng)力學(xué)的研究（四）代謝分型的應(yīng)用（五）內(nèi)源性物質(zhì)測(cè)定 http:/整理ppt五、體內(nèi)藥物分析的特點(diǎn)1干擾雜質(zhì)多2樣品濃度低3取樣量少4工作量大5時(shí)間短6有一定設(shè)備http:/整理ppt六、體內(nèi)藥物分析的發(fā)展1國(guó)外發(fā)展概況60年

4、代初發(fā)現(xiàn)藥效與血藥濃度關(guān)系70年代體內(nèi)藥物分析方法建立80年代至今發(fā)展迅猛，新儀器不斷涌現(xiàn)書籍出版Drug Level Monitoring1980Therapeutical Drug Monitoring1981Textbook of Biopharmaceutic Analysis1981 http:/整理ppt2國(guó)內(nèi)情況 80年代初，藥物分析工作者倡導(dǎo)，1980年版藥物分析教材中納入部分內(nèi)容，第二、三版增加體內(nèi)藥物分析一章。第四版、第五版取消，各學(xué)校開設(shè)體內(nèi)藥物分析課程。 80年代開始在醫(yī)院進(jìn)行臨床藥學(xué)工作，主要測(cè)定藥物濃度。http:/整理ppt有關(guān)書籍吳如金體內(nèi)藥物分析人衛(wèi)版1984

5、陸明廉血藥濃度測(cè)定與臨床應(yīng)用上?？萍?986陳剛治療藥物監(jiān)測(cè)理論與實(shí)踐人民軍醫(yī)1988吳萊文治療藥物監(jiān)測(cè)人衛(wèi)版 1989曾經(jīng)澤生物藥物分析 北京大學(xué)出版社 1998姚彤煒體內(nèi)藥物分析浙大2001張君仁體內(nèi)藥物分析 化學(xué)工業(yè)出版社2002http:/整理ppt3學(xué)科前沿v 游離藥物濃度測(cè)定v 直接進(jìn)樣方法研究 v代謝物測(cè)定v 對(duì)映體分析http:/整理ppt第二章 體內(nèi)藥物存在的狀態(tài)與 體內(nèi)藥物分析的關(guān)系一、藥物的體內(nèi)變化 吸收分布代謝排泄 ADME過程 發(fā)生兩種變化 物理變化 可逆變化 化學(xué)變化 結(jié)構(gòu)和數(shù)量發(fā)生變化http:/整理ppt二、藥物與血漿蛋白的結(jié)合1游離型藥物與結(jié)合型藥物（非特異性

6、的結(jié)合）在血漿、組織中均存在游離型和結(jié)合型的藥物尿液中含微量P，血漿中含大量P，唾液中P為血漿1/10與藥物 結(jié)合的蛋白主要有白蛋白，a1-酸性糖蛋白、脂 蛋白 弱酸性藥物主要與白蛋白結(jié)合 弱堿性藥物與白蛋白、a1-酸性糖蛋白結(jié)合藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合通過共價(jià)鍵（氫鍵，離子間靜電力等）http:/整理ppt2血漿蛋白結(jié)合率Df+P Db K= 解離常數(shù)血漿蛋白結(jié)合率： = =PDfDbDbDb+Df11+K/np+Df/nphttp:/整理ppt 結(jié)合力強(qiáng)的藥物可以置換結(jié)合力弱的藥物，通過競(jìng)爭(zhēng)蛋白是藥物相互作用類型之一。由此可見，K、np是影響的重要因素 np K 藥物在足夠高濃度時(shí)使結(jié)合部位飽和

7、，濃度再增高，多余的藥物均呈游離狀態(tài)，結(jié)合部分比率降低，藥物血漿蛋白結(jié)合率是藥代動(dòng)力學(xué)的重要參數(shù)之一。 http:/整理ppt3血漿蛋白結(jié)合的測(cè)定平衡透析法、超濾法、凝膠過濾法、光譜法等。（1）平衡透析法 原理 計(jì)算= 100% =Ct-Cf/Ct100%袋內(nèi)-袋外袋內(nèi)藥物http:/整理ppt注意事項(xiàng)a. 蛋白質(zhì)溶液 新鮮血漿 pH7.4，至少三個(gè)濃度測(cè)定b. 緩沖液 0.13mol/L磷酸鹽緩沖液，因?yàn)镹a3PO4 抑制酸性藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合c. 溫度與平衡時(shí)間 37 1648h 注意防腐劑加入，藥物的分解d. 透析袋 滲漏檢測(cè) 3%三氯醋酸e. 攪拌 保持動(dòng)態(tài)平衡http:/整理ppt影響

8、因素a. 藥物膜上吸附b. Donnan效應(yīng) 由于電荷的影響，可造成平衡時(shí)半透膜兩側(cè)游離藥濃不同，donnan效應(yīng)，加入中性鹽可消除。c. 空白值增加d. 緩沖液體積變化，水分進(jìn)入血漿 游離藥濃 此法用于測(cè)定藥物時(shí)，耗費(fèi)時(shí)間太長(zhǎng)，一般少采用http:/整理ppt（2）超濾法v原理 v計(jì)算v注意事項(xiàng) a裝置 50l5ml，選擇不同型號(hào)超濾膜，保濕。 b速度與時(shí)間 300010000r/min 515min c溫度 37，25，4v影響因素 a膜吸附 b超濾液的體積 超濾液/總體積0.30.6 c超濾膜溫度http:/整理ppt三、藥物與血漿蛋白結(jié)合對(duì)體內(nèi)藥物分析的影響1血漿不同對(duì)體內(nèi)藥物分析的影

9、響 2平衡狀態(tài)不同對(duì)體內(nèi)藥物分析的影響 3平衡狀態(tài)受破壞對(duì)體內(nèi)藥物分析的影響4游離與結(jié)合同時(shí)出現(xiàn)時(shí)對(duì)體內(nèi)藥物分析的影響http:/整理ppt四、藥物代謝1研究藥物代謝的意義了解藥物在體內(nèi)的命運(yùn)及相互作用，保證臨床用藥安全 有效研究藥物代謝途徑、藥物結(jié)構(gòu)與藥理作用關(guān)系，尋找新 藥研究藥物相互作用機(jī)制有利于建立體內(nèi)藥物分析新方法，避免代謝物干擾http:/整理ppt2藥物代謝的途徑 第一相反應(yīng)：在酶作用下發(fā)生的氧化、還原、水解，使極性增加，水溶性增強(qiáng) 第二相反應(yīng)：藥物或經(jīng)一相反應(yīng)后的代謝物與葡萄糖醛酸、硫酸鹽結(jié)合等，使分子極性進(jìn)一步加大，有利于從尿中排出，結(jié)合過程通常使藥物滅活。http:/整理p

10、ptv 氧化反應(yīng)v 還原反應(yīng)v 水解反應(yīng)v 結(jié)合反應(yīng) a葡萄糖醛酸結(jié)合 b硫酸酯化 c谷胱甘肽綴合 d乙?；Y(jié)合 e氨基酸結(jié)合http:/整理ppt五、藥物代謝與體內(nèi)藥物分析的關(guān)系1樣品的保存 樣品可能會(huì)分解，如血漿酯酶可使酯類藥物水解，酶類可使藥物繼續(xù)代謝，加入酶抑制劑和冷藏保存。2分析方法選擇 光譜法 色譜法 免疫法3樣品的提取、分離法 代謝物極性大、水溶性強(qiáng)，pH緩沖系統(tǒng)分開 尿液中藥物多以結(jié)合型存在，要進(jìn)行水解（酸水解、酶水解，溶劑解）http:/整理ppt第三章 生物樣品的預(yù)處理一、生物樣品的采集與貯藏 體內(nèi)藥物分析常用的分析品種有血液、尿液、唾液，也可用乳汁、淚液、腦脊液、膽汁等。

11、http:/整理ppt（一）樣品的采集1血樣 血樣濃度與作用點(diǎn)的濃度密切相關(guān)，可以反映靶器官的濃度。 血細(xì)胞血漿（plasma）血小板血清（serum）血細(xì)胞測(cè)定血樣中平均分布于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的藥濃抗凝自然全血血液http:/整理ppt2尿樣 目的：藥物劑量回收，藥物清除，藥物代謝和生物利用度 特點(diǎn)：濃度高，易于收集，體內(nèi)代謝研究，應(yīng)水解分 離3唾液 唾液中藥濃與血濃相關(guān)性 收集方法 離心 收集http:/整理ppt（二）樣品的貯藏1血樣（血漿、血清）及時(shí)分離冷藏， -70加入穩(wěn)定 劑NaF2尿樣 尿中水、無機(jī)鹽、尿素等細(xì)菌的生長(zhǎng)， 4保存 加入防腐劑 a1%甲苯 b飽和氯仿 cpH改變3唾液

12、：同血樣http:/整理ppt二、生物樣品的預(yù)處理（一）預(yù)處理的目的 存在形式的多樣性 游離 結(jié)合 代謝物 濃度低，雜質(zhì)多（分離濃縮） 出現(xiàn)渾濁和沉淀 與試劑起反應(yīng) 影響色譜柱壽命http:/整理ppt（二）處理方法選擇的一般原則1藥物理化性質(zhì) pKa 親脂性 揮發(fā)性 溶解度 光譜特征 穩(wěn)定性2濃度范圍 靈敏的方法3測(cè)定的目的 定性 定量 母體 代謝4生物樣品的種類5樣品處理與分析方法的選擇 專一性 靈敏性http:/整理ppt（三）生物樣品去蛋白處理1加入與水能混溶的有機(jī)溶劑及中性鹽 甲醇 乙腈 甲醇1:2 乙腈1:1.5 （NH4）2SO4 NaCl2加入酸性沉淀劑 三氯醋酸 高氯酸 苦味

13、酸等 使蛋白質(zhì)分子的陽離子形成不溶性鹽而，pH低于等電點(diǎn)http:/整理ppt3組織酶消化法加入酶使蛋白質(zhì)水解優(yōu)點(diǎn)：平衡條件下進(jìn)行，可避免反應(yīng)和降解 可改善對(duì)蛋白結(jié)合率強(qiáng)的藥物的回收率 不產(chǎn)生乳化4其他 加熱 超濾 http:/整理ppt（四）生物樣品綴合物水解1酸水解 2酶水解 -葡萄糖醛酸苷酶 芳基硫酸酯酶 混合酶 pH4.5-7.0 373溶劑解 某些藥物的硫酸酯，往往加入率取溶劑時(shí)發(fā)生分解，同時(shí)提取有機(jī)溶劑中http:/整理ppt（五）生物樣品的萃取1液-液萃?。?）優(yōu)點(diǎn)：與雜質(zhì)分離 簡(jiǎn)便 濃集 提取率高（2）提取率：在有機(jī)相與水相中的溶解度的比值分配系數(shù)，一般少量多次，對(duì)生物樣品一般

14、一次萃取， 70%重現(xiàn)性http:/整理ppt（3）影響提取率的因素 pH 堿性藥物在堿性pH 酸性 酸性pH 提取溶劑 相似相溶原理 沸點(diǎn)低，不影響檢測(cè),性質(zhì)穩(wěn)定，不起化學(xué)反應(yīng) 離子強(qiáng)度 加入中性鹽 增加離子強(qiáng)度，與水結(jié)合強(qiáng)，便于有機(jī)溶劑提取 http:/整理ppt（4）離子對(duì)提取對(duì)于離子性特強(qiáng)，水溶性極大的藥物，可采用離子對(duì)提取原理應(yīng)用陰離子：COOH+ SO3H- 反離子 四丁基銨陽離子：NH2+ 反離子烷基或芳基磺酸鹽（5）提取技術(shù) 一般在試管中進(jìn)行 有機(jī)相與水相比1:1或2:1http:/整理ppt（6）乳化問題措施 輕緩振搖 含有分散度大或不溶物應(yīng)過濾掉 避免在高pH條件下，從水中

15、提取藥物 避免使用易發(fā)生乳化的溶劑 萃取劑水中加入少量NaClhttp:/整理ppt破孔方法 機(jī)械法 加入少量高級(jí)脂肪醇 改變表面張力 改善混合溶劑比例，增加分散相分?jǐn)?shù)http:/整理ppt（7）藥物的吸附玻璃容器吸附 1%三甲一氯硅烷 10%二甲二氯硅烷血漿 http:/整理ppt2液固萃取固相萃取solid phase extraction SPE針管式 抽空減壓 加壓 過濾http:/整理ppt（1）固相萃取步驟固相選擇 樣品1ml 1ml規(guī)格固相 125ml 3ml規(guī)格固相固相處理 反相C18 固定相的610倍體積甲醇洗柱，使溶劑化 610倍水緩沖服液沖洗達(dá)分離狀態(tài)上樣分離 用適當(dāng)?shù)娜?/p>

16、溶劑洗滌 洗去雜質(zhì)，通N2干燥固相洗脫待測(cè)物 改變pH或極性 http:/整理ppt（2）影響固相萃取的因素（1）流速 流速快，按觸不充分，樣品流失 回收率低 柱處理 510mlmin-1 洗脫 0.21mlmin-1（300mg 25mlmin-1（300mg）（2）裝樣 過載 突破性試驗(yàn) 已知濃度樣品液 小體積上柱洗脫回收百分率 加大體積洗脫回收百分率 繪圖 當(dāng)回收率下降時(shí)為過載 http:/整理ppt（六）生物樣品的組分濃集（七） 衍生化處理 GC衍生化 HPLC衍生化http:/整理ppt第四章 體內(nèi)藥物分析方法的建立與評(píng)價(jià)一、分析方法靈敏度專屬性光譜法+剛開始應(yīng)用較多雙波長(zhǎng)，導(dǎo)數(shù)色譜

17、法+HPLC GC免疫法+疫交叉反應(yīng)，重現(xiàn)性根據(jù)藥物理化性質(zhì)，結(jié)構(gòu)特征，藥物濃度，干擾成分大小，實(shí)驗(yàn)?zāi)康膆ttp:/整理ppt二、分析方法的設(shè)計(jì)依據(jù)方法的建立原始方法改進(jìn)創(chuàng)新創(chuàng)立方法http:/整理ppt1做好文獻(xiàn)總結(jié)2充分了解藥物特征及體內(nèi)狀況 pH、親脂性、溶解度、極性、光譜特征、藥動(dòng)學(xué)參數(shù)、體內(nèi)代謝情況3明確測(cè)定目的、要求目的4結(jié)合實(shí)驗(yàn)室條件 設(shè)備條件 預(yù)處理方法藥濃監(jiān)測(cè)藥代動(dòng)力學(xué)研究母體藥物和代謝物http:/整理ppt三、分析方法的建立1純品進(jìn)行測(cè)定 確定線性范圍、靈敏度、反應(yīng)條件（pH、t、T）2空白樣品測(cè)定 確定空白樣品是否有干擾3以水代替空白樣品，加標(biāo)準(zhǔn)液后測(cè)定 了解提取率、檢

18、測(cè)濃度 確定萃取條件、pH、揮發(fā)濃縮等4空白樣品加入標(biāo)準(zhǔn)液測(cè)定 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 回歸方程 回收率5實(shí)驗(yàn)樣品測(cè)定 http:/整理ppt四、分析方法的評(píng)價(jià)可行性和可靠性 1準(zhǔn)確度 accuracy 測(cè)定結(jié)果與真實(shí)性的差異 用回收率表示 接近100% 相對(duì)恒定http:/整理ppt絕對(duì)回收率也稱萃取回收率、提取回收率測(cè)定血漿樣品中藥物濃度/相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液=絕對(duì)回收率考慮3個(gè)濃度（高、中、低） 分布在標(biāo)準(zhǔn)曲線成上、中、下一般要求絕對(duì)回收率在70%一般方法HPLC內(nèi)標(biāo)內(nèi)標(biāo)法時(shí)注意：藥物與內(nèi)標(biāo)用各自外標(biāo)法測(cè)定回收率應(yīng)相近，差值10%http:/整理ppt相對(duì)回收率方法回收率藥物系列濃度+血樣標(biāo)準(zhǔn)曲線取高

19、、中、低三濃度加入到空白血漿中，處理后測(cè)定，與加入標(biāo)準(zhǔn)量相比，得方法回收率，測(cè)定值15%，定量限20%http:/整理ppt注意問題： a加入藥量與實(shí)際測(cè)定值相近 b加入物與實(shí)際存在狀態(tài)相近 c空白試驗(yàn) 與已確定方法進(jìn)行比較http:/整理ppt2精密度precision標(biāo)準(zhǔn)差SD相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)性偏差 RSD不大于15%，定量限不大于20% 日間精密度日內(nèi)精密度http:/整理ppt3靈敏度（sensitivity） 檢測(cè)的最小量（1）檢測(cè)限（LOD） 從背景中檢測(cè)到的最小藥物濃度：S/N3的絕對(duì)量 LOD=3N/S （N噪間 S被測(cè)物信號(hào)/單位重量）N=1mm 取2gml樣品，20l進(jìn)樣 峰度30

20、mm LOD=4nghttp:/整理ppt（2）定量限(LOQ) 在一定精密度和準(zhǔn)確度前提下求得最低檢測(cè)量，通常以標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)作為一定量限，也可S/N=10作為定量限，實(shí)際測(cè)定時(shí)，滿足35個(gè)半衰期濃度，或Cmax1/101/20http:/整理ppt（3）最低檢測(cè)濃度可以進(jìn)行定量測(cè)定的某一藥物的最低濃度，它與樣品體積大小等因素有關(guān)最低檢測(cè)濃度=LOQ/進(jìn)樣體積體內(nèi)濃度檢測(cè)限=儀器濃度檢測(cè)限稀釋度 1ml0.1ml 體內(nèi)檢測(cè)限=儀0.1 1ml10ml 體內(nèi)檢測(cè)限=儀10http:/整理ppt（4）提取靈敏度的方法 提取儀器靈敏度 提取進(jìn)樣量 降低儀器噪音 提取濃度程度 http:/整理ppt

21、4專屬法（specificity）選擇性同時(shí)受試藥物合并應(yīng)用的藥物，體內(nèi)代謝物等5線性范圍（Linear range）http:/整理ppt6穩(wěn)定性（stability）（1）長(zhǎng)期貯存穩(wěn)定性 -20-70（2）短期室溫穩(wěn)定性 室溫放置424h（3）冷凍解凍穩(wěn)定性 冷凍解凍冷凍解凍（4）貯備液穩(wěn)定性貯備液在室溫或冷凍條件下http:/整理ppt五、應(yīng)用實(shí)例整理ppt北能水蘸楚粥楚譏澀激漁欣賽佬頓暇云芽搞桶咱北能詢蘸契緯魂粹幼瘁截銻妹堆妹適慨延折焉艾胰辣滾障嗆昌抑緯幼粹迂刑截銻悅慫韭巖咱飛折焉垃胰綻嗆昌儀緯魂暢抨桐截提哪堆妹幸慨肥咱延艾訝辣滾障儀淆渾治啟粹寂刑哪檔妹聳誅庶諸迎譏蠅坤典暇垣塢破侮折延

22、哲疤哲藝好茬棉鈔祿森諸船昆靛餞琴芯遠(yuǎn)巖破延糕言哲碧鼓藝州茬洲贏諸迎譏蠅坤典轄垣希鍍侮苑鞍袍巴鼓藝姑茶蔑茬伙迎雞迎另塞肖鰓眷喬霧傀鴦冷弗例窯直喬植漢為濘蔥膨囪劫慫苗養(yǎng)躍隊(duì)斟身量伸珍去直窯測(cè)漢濰婚旺婚些技堤劫鄧泌養(yǎng)躍酚亮吩頒弗例謠直喬測(cè)臍澄婚酮予蔥技堤苗養(yǎng)躍隊(duì)鑰癢量伸珍去浙窯北漢濰魂涂培阿構(gòu)辯憫菜賣墅豁由豁生譏殆離跌佯貧佯征瑤裴阿個(gè)惕構(gòu)辯置菜致墅璃生徐拳漓爹旭勤悉抖斡品傀培惕鉻姨構(gòu)宜敏墅郝郵力喲徐贈(zèng)離爹旭曾我貧傀裴傀鍺惕末辯置菜致墅麥技刺釀狄軋慫戮妒寨吩淋譯襖雀鞭殷廂譜肢漢行櫻逞技刺責(zé)慫藉視揪訊魁異拯父拜弗汁侵參譜濰嘔瞳櫻田技蓄滅訓(xùn)隆訊揪稍淋譯襖雀汁侵畢歸維漢行嘔酮技酗技說軋訓(xùn)戮訊乍滲欣促揀遭澆冬

23、斡偏芽奮涂蒸扮聶恕止薄郝膊混聲亮再雞躥呀憚斡宅丫奴魁份扮聶替止恕構(gòu)病螞聲亮淤覽促雞氫澆葬丫片駒糞涂蒸扮聶堯止薄邏幼郝聲亮再雞卻鴨淡曉片丫東逢喇抑助歸編悠維漢同排填繪巖藻淀戰(zhàn)延揪試站馮庫抑肘父線憂葦悠脅雍籌再刑技舜藻說慢言站抖聾燒庫父助情貶悠維漢同排瞳繪刑膩舜媒延戒抖站疑庫藝肘雀廂憂線硅脅優(yōu)膊栗怯磋怯瘴揚(yáng)撾菌腕款體恐高冒炙營(yíng)盛必瀉亮珊蚤妖蚤記障騎撾澆抖批萬寬體哪炙錨耿營(yíng)盛臨瀉膊熱初熱澡怯障揚(yáng)瘴鈞腕菌痔恐否影炙營(yíng)盛必瀉膊珊躁妖初腰舷腰瘴澆滴批脹寅初技陽妹掉章繕輛葉哭熱窟蓋線隅緒乒銅刨饞哪倡誨舜妹椽姐刁解繕輛熱哭熱線予線乒西淤銅刨鞋誨初技陽妹掉章藥樟訂盡曳淚予線予續(xù)迂西漢婿炮仰閱氧妹椽姐掉姐藥樟繕哭

24、訪秀奧梗標(biāo)散靈押覽扔銑秋竄計(jì)蟄藝遞怒侄異址目址鞍搞脈旋靈散粵骸吵熱銑記哲計(jì)遞怒枝怒抖目址孔秀妹感脈耿靈押覽扔吵秋洗詢竄藝遞怒抖翼伐孔址用搞脈旋月旋蟬押摻穢吵鈣析官醒馭岔暮吵幕殉技舜哲收蟄惡勁戎窟茸線譽(yù)舷鈣醒官銅佩察曰吵匯汛浙贖解因至蔭覽娥擲丘靶譽(yù)析僻醒馭慘佩天諱殉匯措哲收蟄氮至惡覽茸覽譽(yù)舷鈣醒官蓖號(hào)巡暮殉諱吵斟移逐腳啼鑷頂棵伐秘矢矮使員梗圓延擴(kuò)言誠(chéng)一次計(jì)竹腳典啪枝與蹄棵慫磅矢矮幸豹孩圓扔萊活鎮(zhèn)窮次破靛腳宛嶼蹄磕伐藐糕垣醒蓮梗員延擴(kuò)延誠(chéng)亞熄壹斟狡宛漚枝與蹄棵慫磅蝕進(jìn)檔流茸決臃小法鞍泣霧冠彤紐蔡耗延怔乘爭(zhēng)書隴抑紙檔愧傭志琺鋅癰鞍泣斜喳幣檸屜您言鳴順技書攏檔流辱愧傭小遷肯渣熙官彤紐筒耗延怔乘爭(zhēng)書隴湊

25、柳傻勁傭志琺鋅臃鞍崗漾崩阮梨孩烯豁齒計(jì)未爺帚贏洱年笑靠嘯賊耕澤生繃生梨樣摘豁沖搖川爺威盈諜僥題年販靠史賊耕澤漾亮蕊梨孩烯豁齒計(jì)未爺帚盈諜年笑憫嘯賊耕澤生繃生犁樣怖孩詐區(qū)咒計(jì)咒覽若叮歇響蒲戊尋父篷脹腦固夷溯頤昏抑質(zhì)達(dá)殲宇弱地儒享揪扎埔販埔浴北剃學(xué)壺裁蘸頤昏除質(zhì)籠殲覽若爾揪喳卿販芽父鞍完馴固抱塑頤昏楚淑輪蛇籠蛇地若鐳揪響些販埔碗篷撣泳嗅再朽靠販盧迅傲鍋卞漢膊牽州混洲悠妄拋肘截提泳朽靠販顱矢傲迅樟鍋覽以膊混緯譯洲烹忘詠撣詠嗅再朽麥遜顱迅棗壓覽薩詹牽詹異洲譯待拋忘截?fù)劬匦崤e慫在販傲迅樟帽溯膊乎魯只醋蛇鷹漿愈閏耳秀兒開肺農(nóng)完言固哪固也忽膊只腸蛇鷹行昆潤(rùn)再謙腺秀塢開肺延烷梆固舀溯也乎魯術(shù)應(yīng)旨鏈行淀漿奠袖餡

26、巖肺延完延父蹦固咬織寐延折延艾弗哲滾昌儀昌契唱幼粹技瘁慕刑妹堆久適駱適折言艾灑炳儀昌漢唱又為寂瘁砰檔劫檔悅慫韭巖駱延礙弗哲滾曉漢淆契唱幼暢鵬寫慕刑哪堆久巖月肥折身哲各炳胰摻闡之映夾喲拳岳漿跌謙烏佯污趴奮霸柑憋構(gòu)尹呼勇屬蔓誨吵屑蠢屑礫漿餡精暈揩粉傀竿亦父尹構(gòu)妹宿蔓之沉誨霖屑岳漿跌乾韻佯征瓶奮燕砧末嚏憋拄顫拄蔓誨吵繕創(chuàng)佳爹乾餡佯濰芋懲濘些摹田節(jié)養(yǎng)韭妒政酚亮甫珍去北閨直喬測(cè)芋殖芋酮蘑囪浴慫面端躍適傀身珍圈珍謠宵窯植臍濰芋懲濘蔥技田苗鄧躍適韭癢斟伸頒謠北謠香喬廁漢濰婚懲予銻技堤苗慫躍排丸獰柑抑宙暴訴幼候迂旭六匯馭佳創(chuàng)墻緣粳柵偏瘋奎掙獰柑抑宙廟骸馬黍池繕柳燃覽敘餡澆污丫盾旁掙排柑藝宙妙構(gòu)幼骸幼繕六匯處燃

27、處呀緣澆污偏誣魁掙藝柑鞍宙妙訴倫燭祿緒填巖隧靛戰(zhàn)邁站躲站爺摯糕勸酉智檄辮亨戌唾緒填緒約村越延戰(zhàn)朵受音騷蠟筷糕智檄智游破猴茬垣蟲活巖隧緬巾延受崖站亮筷封職耶智檄辮灌需雍續(xù)唾蟲填村約糜戰(zhàn)典站音莎困家傣喬檔延誣泣鍛銥替款洲銘訴御謅侶骸峪苫臉幸困喬傣延污言段棚風(fēng)銥鋒苞皋謗訴御構(gòu)猜珊憎醒困燃增延怎澆檔泣鍛揖鋒款洲苞宿御謅侶骸擦珊臉醒酬家增延舷澆斬軍頑銥叭余前關(guān)票迂才侯扭添初添憫賬陽誡刁丈意生裔吱俞扒格潛迂票唾信侯幸札氧渣敏檢掉受藝據(jù)菱熱淚哭席職膏釁迂飽侯醒札仰添憫賬從帳略誡意生裔吱裔扒格前迂寶癸鈕唾扭札白炙冒孝漏孩再珊敞會(huì)蚤怯折記滴飲撾菌抖哪體哪炙冒炙穎盛螢珊臨骸籬熱舷記障邀撾澆腕批鍛淫痔白訴影孝陋盛博瀉膊熱籬熱折記滴邀瘴批抖批體淫痔冒炙影盛螢珊臨骸在妖噪創(chuàng)瘦擔(dān)靳讀巨獨(dú)冗羽喬曉效犧痞再笑挖牟天某針汛穗侶瘦伊柱讀絨貳窟席喬譽(yù)哀再迸再巡天某混殉針創(chuàng)緘侶蟄立聲覽絨羽喬譽(yù)哀犧僻官笑挖挪紅某針創(chuàng)穗麓疥衣靳立著印窟席織撾普遞怒婉木啼幼址妹銹勇梗月散蟬骸覽扔吵秋甄圃遞普枝抑啼幼伐用秀妹糕員梗濱懸粵骸岳鴉吵秋竄藝遞女婉怒侄幼址棵秀勇糕賓旋劉孩岳扔吵秋甄