葛根素注射液—葛根素的測定—高效液相色譜法

1、方法名稱：葛根素注射液葛根素的測定高效液相色譜法應(yīng)用范圍：本方法采用高效液相色譜法測定葛根素注射液中葛根素（C21H20O9)的含量。本方法適用于葛根素注射液。方法原理：供試品制成流動相溶液，進入高效液相色譜儀進行色譜分離，用紫外吸收檢測器，于波長250nm處檢測葛根素吸收值，計算出其含量。試劑：1. 0.1%枸櫞酸溶液2. 甲醇儀器設(shè)備：1. 儀器 1.1 高效液相色譜儀1.2 色譜柱十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，理論塔板數(shù)按葛根素峰計算不低于2500，葛根素峰與相鄰雜質(zhì)峰間的分離度應(yīng)符合要求。1.3 紫外吸收檢測器2. 色譜條件 2.1 流動相：0.1%枸櫞酸溶液 甲醇=75 25。2.2

2、 檢測波長：250nm2.3 柱溫：室溫 試樣制備：1. 量取供試品精密量取本品適量。2. 對照品溶液的制備精密稱取適量，加流動相溶液溶解并制成每1mL含50g的溶液，搖勻，即得。3. 供試品溶液的制備將供試品加流動相溶液溶解并制成每1mL含50g的溶液，搖勻，即得。注：“精密稱取”系指稱取重量應(yīng)準(zhǔn)確至所取重量的千分之一。“精密量取”系指量取體積的準(zhǔn)確度應(yīng)符合國家標(biāo)準(zhǔn)中對該體積移液管的精度要求。操作步驟：分別精密吸取上述對照品溶液與供試品溶液各20L 注入高效液相色譜儀，用紫外吸收檢測器，于波長250nm處測定葛根素的吸收值，計算出其含量。參考文獻：中華人民共和國藥典，國家藥典委員會編，化學(xué)工

3、業(yè)出版社，2005年版，二部，p.689。山東省藥品檢驗所250012葛根素注射液為新型血管擴張藥，用于冠心病、心肌梗塞、心絞痛的治療，其主成分葛根素為豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.)Ohwi的干燥根中提取、分離得到的以葛根素為主的異黃酮苷類，其含量測定方法，衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)(試行)1為紫外分光光度法。在生產(chǎn)和檢驗過程中發(fā)現(xiàn)，按100 %投料，紫外法測定其含量可達標(biāo)示量的103 %左右，經(jīng)薄層檢查，其原料葛根素含雜質(zhì)，易導(dǎo)致注射液測定含量偏高。本文采用高效液相色譜法，使葛根素與雜質(zhì)得到良好分離后，測定葛根素的含量，其方法準(zhǔn)確，結(jié)果可靠。1儀器與試藥TSP高效液相色譜儀(

4、包括P 2000泵，AS 3000自動進樣器，UV 2000檢測器，IBM 350450 DX2數(shù)據(jù)站)。葛根素對照品(中國藥品生物制品檢定所提供)；對-羥基苯甲醛內(nèi)標(biāo)物(山東省藥物研究所精制，色譜純)。乙醇(優(yōu)級純)，重蒸餾水，丙二醇(分析純)，葛根素注射液(煙臺中策藥業(yè)有限公司提供)。2色譜條件色譜柱：Turner C18H37，5 m 4.6 mm×150 mm；流動相：乙醇水(43207)；流速：1 mL/min；柱溫：30 ；檢測波長：250 nm；理論板數(shù)按葛根素計，不低于3000，與內(nèi)標(biāo)峰分離度大于5。3線性關(guān)系試驗取對-羥基苯甲醛適量，加流動相制成0.5 mg/mL的

5、內(nèi)標(biāo)溶液。取105 干燥至恒重的葛根素對照品適量，精密稱定，用流動相溶解，制成0.3 mg/mL的溶液，精密取該溶液1、3、5、10、20 mL，分別精密加入內(nèi)標(biāo)溶液10 mL，搖勻，取各溶液10 L進樣，記錄色譜圖(見圖1)。以葛根素峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積之比Y與濃度X(mg/mL)做線性回歸，得回歸方程為：Y11.98X+5.673×10-3r=0.9991即葛根素在0.0270.2 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。圖1色譜圖1.葛根素2.內(nèi)標(biāo)36.雜質(zhì)4校正因子的測定取在105 干燥至恒重的葛根素對照品約20 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，精密取

6、該溶液與內(nèi)標(biāo)溶液各10 mL混勻，取10 L進樣，記錄色譜圖，按對照品與內(nèi)標(biāo)的峰面積比計算校正因子。5回收率試驗根據(jù)葛根素注射液處方精密稱取葛根素對照品并配制成模擬溶液(每2 mL的50 %丙二醇水溶液含葛根素100 mg)，精密取該模擬溶液1 mL，置250 mL量瓶中，加流動相至刻度，搖勻，精密取該溶液與內(nèi)標(biāo)溶液各10 mL，混勻，取10 L進樣，以內(nèi)標(biāo)法計算，平均回收率為99.6 %(n=5)，RSD為0.42 %。6樣品測定精密取本品，按回收率項下方法依法測定、計算，結(jié)果與紫外法1比較，見表1。表1含量測定結(jié)果(標(biāo)示量%，n=4)批號HPLC法紫外法950702198.0101.695

7、0702298.2101.6950702398.3101.87討論葛根素注射液的含量測定，紫外法1測得的含量為在250 nm波長處有紫外吸收的總黃酮的總量(將有紫外吸收的雜質(zhì)一并計算入含量)，如葛根素提取純度不好，引起實驗誤差較大；在本文色譜條件下，HPLC法能很好地將葛根素與其它雜質(zhì)分離后定量，輔料對測定無任何干擾，正確反映了注射液中葛根素含量。參考文獻1衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)(試行).WS257(X207)92· 葛根素注射液-藥物手冊【其他名稱】【藥物名稱】葛根素注射液 【英文名】Puerarin Injection 【漢語拼音】【主要成分】【性狀】無色或微黃色的澄明液體。 【藥理作用

8、】主要藥效學(xué)實驗，進行了靜脈注射對犬急性心肌梗塞范圍影響的研究，結(jié)果表明：可明顯限制實驗性心肌梗塞范圍，此結(jié)果系經(jīng)心外膜電圖、酶、心肌核素及心肌NBT病理染色所證實。一般藥理學(xué)研究結(jié)果表明，臨床等效量靜脈注射對實驗動物（犬）呼吸、心血管和神經(jīng)系統(tǒng)無明顯影響。 小鼠靜脈注射LD50為634.3mg/Kg，其95%可信限為583.8689.2mg/Kg；腹腔注射LD50為1412.2mg/Kg，其95%可信限為1377.81448.1mg/Kg。大鼠長期毒性實驗結(jié)果表明，150、100、50mg/Kg腹腔注射5周無積蓄性毒性，對心、肝、肺、脾、腎、腎上腺及腸等臟器無明顯毒性。犬長期毒性實驗結(jié)果表明

9、，15、30、50mg/Kg/日靜脈注射，連續(xù)35天，再觀察70天，對大小便常規(guī)、血常規(guī)、SGPT、BUN、血糖均無明顯影響，但高劑量組病理檢查肝腎組織有不同程度受損，給藥部位結(jié)締組織增生、管壁增厚。致突變實驗結(jié)果顯示，無任何致突變活性，說明沒有潛在性的致癌和致突變危險性。致畸實驗結(jié)果表明，對雌性大鼠胚胎及雄性大鼠生殖細(xì)胞均無致畸作用。 【藥代動力學(xué)】關(guān)于藥代動力學(xué)的研究，采用放射性氚標(biāo)記的葛根素觀察了靜脈給藥后的血藥濃度變化及其在10種臟器中的藥物濃度變化，基于開放型二室模型，計算了葛根素藥代動力學(xué)參數(shù)，并對高、中、低三個劑量組的動力學(xué)參數(shù)進行了比較，結(jié)果表明，小鼠靜脈注射葛根素后，隨著給藥劑量的增加，藥物的消除半衰期（t1/2）依次降低（11.80，10.37，4.65hr），分布半衰期（t1/2）依次增加（0.53，0.64，0.67hr）；藥物在各組織的分布以肝、腎、心臟及血漿中較高；睪丸、肌肉和脾臟次之；并可通過血腦屏障進入腦內(nèi)，但含量較低。通過對各種參數(shù)分析結(jié)果說明，在體內(nèi)以分布廣，消除快，不易積蓄為特點。 【適應(yīng)癥】用于冠心病、心肌梗塞、心絞痛。 【用法與用量】稀釋后靜脈滴注。一日400600m