分子熒光分析法 (2)

1、關(guān)于分子熒光分析法 (2)現(xiàn)在學習的是第一頁，共44頁一、概述一、概述1 光致發(fā)光光致發(fā)光： 當某些物質(zhì)受到光的照射時，除吸收某種波長的光之外還發(fā)射波長相同或比吸收波長更長的光，這種現(xiàn)象叫光致發(fā)光。 熒光 fluorescence:物質(zhì)分子吸收光子能量而被激發(fā)，然后從激發(fā)態(tài)的最低振動能級返回至基態(tài)時發(fā)射出的光。 磷光 phosphorescence:吸收光子 激發(fā) 三線態(tài)最低 振動能級 基態(tài)現(xiàn)在學習的是第二頁，共44頁 2 2 熒光分析方法熒光分析方法 Fluorometry 根據(jù)物質(zhì)的熒光譜線位置及其強度進行 物質(zhì)鑒定和物質(zhì)含量測定的方法。 X射線熒光分析法 X-ray fluorometr

2、y 原子熒光分析法 atomic fluorometry 分子熒光分析法 molecular fluorometry 3. 3.優(yōu)點：優(yōu)點： 靈敏度高，選擇性好。mlgmlg/12101010/710熒光分析法檢出限為可見分光光度法檢出限紫外現(xiàn)在學習的是第三頁，共44頁 二二 基本原理基本原理 1 1 有關(guān)概念有關(guān)概念 單線態(tài)單線態(tài)： 大多數(shù)分子含偶數(shù)個電子，成對地填充 在能量最低的各軌道中，根據(jù)Pauli不相 容原理，軌道中的兩個電子具有相反方 向的自旋，即自旋量子數(shù)為+1/2和-1/2， 其總自旋量子數(shù)為0。用2S+1表示電子 能態(tài)的多重性，基態(tài)所處的電子能態(tài)為 單線態(tài)。現(xiàn)在學習的是第四頁

3、，共44頁 當基態(tài)分子的一個電子吸收光輻射被激發(fā)而躍遷至較高的電子能級時，電子不發(fā)生自旋方向的改變，此時分子處于激發(fā)的單線態(tài)。激發(fā)三線態(tài)激發(fā)三線態(tài)： 電子在躍遷過程中自旋方向改變，分子具有兩個自旋不配對的電子，總自旋量子數(shù)為1，處于激發(fā)的三線態(tài)（2S+1=3）。2 2 基態(tài)、激發(fā)單線態(tài)、激發(fā)三線態(tài)比較 如圖所示，激發(fā)三線態(tài)和激發(fā)單線態(tài)現(xiàn)在學習的是第五頁，共44頁 除電子自旋方向改變外，能量亦不相同。 E 基態(tài) 激發(fā)單線態(tài) 激發(fā)三線態(tài) 現(xiàn)在學習的是第六頁，共44頁3 熒光的產(chǎn)生 熒光的產(chǎn)生過程： 基態(tài)吸收輻射 激發(fā)單線態(tài) 內(nèi)轉(zhuǎn)換、振動馳豫 第一激發(fā)單線態(tài)的最低振動能級 發(fā)射熒光 基態(tài)的各振動能級

4、外轉(zhuǎn)換、振動馳豫 基態(tài)的最低振動能級現(xiàn)在學習的是第七頁，共44頁 熒光與磷光產(chǎn)生示意圖0V1V2V3V0V1V2V3V3V3V1V1V2V2V0V0V0S1S2S1T內(nèi)轉(zhuǎn)換體系間跨越現(xiàn)在學習的是第八頁，共44頁 發(fā)射熒光過程約為 ，返回基態(tài) 時，可停留在任一振動能級上，因此，可得幾個非?？拷臒晒夥遄V線。 有關(guān)概念：有關(guān)概念： 振動弛豫：vbrational relexation 物質(zhì)分子被激發(fā)后，其電子可能躍遷到第一電子激發(fā)態(tài)或更高的電子激發(fā)態(tài)的幾個振動能級上，在溶液中，激發(fā)態(tài)分子通過與溶劑分子碰撞而將部分振動能量傳遞給溶劑分子，其電子則返回到同一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級上，此過程稱為。S7

5、10910現(xiàn)在學習的是第九頁，共44頁 內(nèi)轉(zhuǎn)換：internal conversion 當兩電子激發(fā)態(tài)之間能量相差較小以致其振動能級有重疊時，受激分子將多余的能量轉(zhuǎn)變?yōu)闊崮芏S遷至較低電子能級。 熒光發(fā)射： 無論分子最初處于哪一個激發(fā)單線態(tài)，通過內(nèi)轉(zhuǎn)換及振動弛豫，均可返回至第一激發(fā)單線態(tài)的最低振動能級上，然后再以輻射形式發(fā)射光量子而返回到基態(tài)的任一振動能級上，所發(fā)射的光量子即 稱熒光熒光。現(xiàn)在學習的是第十頁，共44頁 熒光的波長總比激發(fā)光的波長要長? 外轉(zhuǎn)換：external conversion 如果分子在溶液中被激發(fā)，激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子及其它溶質(zhì)分子之間相互碰撞而失去能量，以熱能形式放出

6、，此過程稱為外轉(zhuǎn)換。 通常發(fā)生在第一激發(fā)單線態(tài)或第一激發(fā)三線態(tài)的最低振動能級向基態(tài)轉(zhuǎn)換的過程中，會降低熒光或磷光強度?，F(xiàn)在學習的是第十一頁，共44頁 體系間跨越：intersystem crossing 指處于激發(fā)態(tài)分子的電子發(fā)生自旋反轉(zhuǎn)而使分子的多重性發(fā)生變化的過程。如果第一激發(fā)單線態(tài)的最低振動能級同激發(fā)三線態(tài)的最高振動能級重疊，那么激發(fā)態(tài)分子的電子發(fā)生自旋反轉(zhuǎn)，分子由激發(fā)單線態(tài)跨越到激發(fā)三線態(tài)，熒光強度減弱或熄滅。 含有重原子如Br2、I2等的分子，體系間跨越最常見，因為電子的自旋與軌道運動之間的相互作用較大，有利于電子自反轉(zhuǎn)的發(fā)生。溶液中存在的氧分子等順磁性物質(zhì)也容易發(fā)生體系間跨越，從而

7、使熒光減弱?，F(xiàn)在學習的是第十二頁，共44頁 磷光發(fā)射： 激發(fā)單線態(tài)最低振動能級體系間跨越激發(fā) 三線態(tài)高振動能級 振動馳豫 激發(fā)三線態(tài) 最低振動能級（存活） 發(fā)射磷光 基態(tài) 各振動能級振動馳豫、外轉(zhuǎn)換基態(tài)最低振動能級 與熒光比較：過程比熒光長（ ） 磷光波長較熒光長?S10104現(xiàn)在學習的是第十三頁，共44頁 綜上所述的能量釋放方式中： 輻射躍遷：熒光、磷光的發(fā)射。 無輻射躍遷：振動弛豫、內(nèi)轉(zhuǎn)換、 外轉(zhuǎn)換、體系間跨越?，F(xiàn)在學習的是第十四頁，共44頁三、激發(fā)光譜與發(fā)射光譜三、激發(fā)光譜與發(fā)射光譜1激發(fā)光譜激發(fā)光譜：excitaton spectrum 不同激發(fā)波長的輻射引起物質(zhì)發(fā)射某一波長熒光的相對

8、效率。即固定熒光波長，以熒光強度（F）為縱坐標，激發(fā)波長（ex）為橫坐標作圖可得。2 發(fā)射光譜發(fā)射光譜：fluorescence spectrum 即熒光光譜，使激發(fā)光的波長和強度保持不變，通過發(fā)射單色器掃描以檢測各種波長下相應(yīng)的熒光強度，記錄熒光強度（F）對發(fā)射波長（em）的關(guān)系曲線。現(xiàn)在學習的是第十五頁，共44頁 作用：鑒別熒光物質(zhì)； 選擇適當?shù)臒晒鉁y定波長。 激發(fā)光譜和熒光光譜類似“鏡像對稱”關(guān)系 硫酸奎寧的激發(fā)光譜（虛線）及熒光光譜（實線）度強光熒nm300nm400nm500現(xiàn)在學習的是第十六頁，共44頁 3 溶液熒光光譜的特征A 斯托克斯位移：Stokes shift 1852年，

9、Stokes首先觀察到：溶液熒光光譜中，熒光波長總是大于激發(fā)光波長。 原因原因：內(nèi)轉(zhuǎn)換、振動馳豫達到第一激發(fā)單線態(tài)的最低振動能級；激發(fā)態(tài)分子與溶劑相互作用；激發(fā)態(tài)分子返回到基態(tài)的各不同振動能級，進一步損失能量。B 熒光光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)：熒光發(fā)射通常發(fā)生于第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級；而與激發(fā)到哪一個電子激發(fā)態(tài)無關(guān)?，F(xiàn)在學習的是第十七頁，共44頁四四 分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系 物質(zhì)能否產(chǎn)生熒光，主要取決于物質(zhì)結(jié)構(gòu)及環(huán)境條件。1 物質(zhì)產(chǎn)生熒光的必要條件 物質(zhì)分子必須有強的紫外-可見吸收。 物質(zhì)必須具有較高的熒光效率。 熒光效率（fluorescence efficiency

10、）又稱熒光量子產(chǎn)率（fluorescence quantum yield） 吸收激發(fā)光的光子數(shù)發(fā)射熒光的光子數(shù)現(xiàn)在學習的是第十八頁，共44頁 任何物質(zhì)的 在01之間，如熒光素在水中 =0.65，蒽在乙醇中 =0.30，菲在乙醇中 =0.10。 熒光效率低的物質(zhì)雖有較強的紫外吸收，但所吸收的能量都以無輻射躍遷形式釋放，所以沒有熒光發(fā)射。 2 與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系 A A 長共軛結(jié)構(gòu)長共軛結(jié)構(gòu)： 芳香環(huán)或雜環(huán)具有長共軛的躍 *躍 遷，電子共軛程度越大，熒光強度越大，熒光波長長移?，F(xiàn)在學習的是第十九頁，共44頁例：苯、萘、蒽的熒光強度比較。 205nm 286nm 356nm 278nm 321nm 4

11、04nm 0.11 0.29 0.36 B 分子的剛性和共平面性分子的剛性和共平面性 剛性：指分子自由旋轉(zhuǎn)程度的大小，若分子不能旋轉(zhuǎn)，則為剛性分子。 共平面性:指共扼電子的共平面程度。在長共軛分子中，剛性和共平面性越大，熒光效率越大，熒光波長長移。exem現(xiàn)在學習的是第二十頁，共44頁 聯(lián)苯 芴C 取代基取代基： 增加分子的電子共軛程度的取代基,增強熒光，并使波長長移；減弱分子的電子共軛程度的取代基，使熒光減弱或熄滅。 第一類基團：-NH2、-OH、-OCH3、-CN等，屬于給電子基團，增強熒光。 2 . 00 . 12Hc現(xiàn)在學習的是第二十一頁，共44頁 第二類基團：-COOH、-NO2、-

12、NO、-Cl -Br、 - I等，減弱分子的電子共軛性，使熒光減弱甚至熄滅。 第三類基團：-R、-SO3H等 對熒光的影響不明顯。五 影響熒光強度的外部因素影響熒光強度的外部因素1 溫度： 溫度越高，熒光效率及熒光強度越低。因為溫度升高，分子運動速度加快，分子間碰撞幾率增加，使無輻射躍遷增加，降低了熒光效率?，F(xiàn)在學習的是第二十二頁，共44頁 2 溶劑： 一般情況下，熒光波長隨溶劑極性增大而長移，強度也有所增加。 熒光強度隨溶劑粘度的減小而減弱。溶劑粘度減小時，可增加分子間碰撞機會，使無輻射躍遷增加而使熒光減弱。 若溶劑與熒光物質(zhì)形成化合物或溶劑使熒光物質(zhì)的電離狀態(tài)改變，那么，熒光峰的波長和熒光

13、強度將發(fā)生變化。 3 pH的影響： 每種熒光物質(zhì)都有最適宜的pH范圍現(xiàn)在學習的是第二十三頁，共44頁 如：苯胺在不同的pH下的熒光效率不同。 pH 2 pH712 pH13 無熒光 藍色熒光 無熒光4 熒光熄滅劑的影響： 熒光熄滅：指熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或溶質(zhì)分子相互作用引起熒光強度降低的現(xiàn)象。 熒光熄滅劑：能夠引起熒光熄滅的物質(zhì)。3NH2NHNHOHOHHH現(xiàn)在學習的是第二十四頁，共44頁 如： X離子、重金屬離子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物和羧基化合物。 五種形式: 熒光物質(zhì)的分子和熄滅劑分子發(fā)生碰撞而損失能量。 熒光物質(zhì)的分子與熄滅劑分子作用生成本身不發(fā)光的配位化合物。 熒光物質(zhì)

14、分子中引入溴或碘后易發(fā)生體系間跨越而轉(zhuǎn)變至三線態(tài)。現(xiàn)在學習的是第二十五頁，共44頁 溶解氧的存在使熒光物質(zhì)氧化或由于氧分子的順磁性促進了體系間跨越，使激發(fā)單線態(tài)的熒光分子轉(zhuǎn)變至三線態(tài)，從而引起熒光熄滅現(xiàn)象。 熒光自熄滅現(xiàn)象：當熒光物質(zhì)濃度較高時，由于熒光分子間碰撞幾率增加而損失能量，使熒光熄滅。 熒光熄滅法： 利用一個熒光物質(zhì)在加入某種熄滅劑后，熒光強度的減小和熒光熄滅劑的濃度呈線性關(guān)系，可以測定熒光熄滅劑的含量?，F(xiàn)在學習的是第二十六頁，共44頁 6 散射光的干擾 散射光主要有瑞利光和拉曼光兩種：瑞利光：光子和物質(zhì)分子發(fā)生彈性碰撞時，不發(fā)生能量的交換，僅是光子運動方向發(fā)生改變。其波長與入射光波

15、長相同。拉曼光：光子和物質(zhì)分子發(fā)生非彈性碰撞時, 光子運動方向發(fā)生改變，能量交換，發(fā)射光比入射光波長稍長或稍短的光。 散射光對熒光測定有干擾，尤其是波長比入射光波長更長的拉曼光，因其波長與熒光波長接近，對熒光測定的干擾更大?，F(xiàn)在學習的是第二十七頁，共44頁 硫酸奎寧在不同波長激發(fā)下的熒光與散射光譜360350448硫酸奎寧激發(fā)nm35035040042/1 . 0350SOLHmolnm激發(fā)320448硫酸奎寧激發(fā)nm320a度強32036042/1 . 0320SOLHmolnm激發(fā)b度強現(xiàn)在學習的是第二十八頁，共44頁 無論選擇320或350nm為激發(fā)光，熒光峰總在448nm，拉曼光波長分

16、別為360和400nm，其中，400nm的拉曼光對熒光的測定有干擾。 現(xiàn)在學習的是第二十九頁，共44頁 六 熒光分析儀器 用于測定熒光強度有濾光片熒光計、濾光片-單色器熒光計及熒光分光光度計三種類型。 第一種類型儀器不能測定光譜，可進行定量分析； 第二種類型儀器不能測定激發(fā)光譜，但可測定熒光光譜； 第三種類型儀器既可測定激發(fā)光譜，又可測定熒光光譜?，F(xiàn)在學習的是第三十頁，共44頁 1 熒光分光光度計 主要構(gòu)造：激發(fā)光源 單色器 樣品池 檢測器系統(tǒng)光源激發(fā)單色器樣品池質(zhì)物光吸面表發(fā)射單色器檢測器放大器指示器記錄器熒光分光光度計結(jié)構(gòu)示意圖現(xiàn)在學習的是第三十一頁，共44頁 2 熒光分析儀器的校正 靈敏

17、度校正 影響熒光分光光度計靈敏度的因素很多，與儀器的光源強度、單色器性能、光電管的靈敏度及放大系統(tǒng)的特征有關(guān)；與波長、狹縫寬度有關(guān)；還與被測定的容器、溶劑等的雜散光有關(guān)。 因此，同一型號的儀器，甚至同一臺儀器在不同時間操作，所測得的結(jié)果也不盡相同。故使用前需進行靈敏度校正?，F(xiàn)在學習的是第三十二頁，共44頁 一般地，在每次測定時，在選定波長及狹縫寬度的條件下，先用一種穩(wěn)定的熒光物質(zhì)配成濃度一定的標準溶液進行校正，將每次測得的熒光強度調(diào)節(jié)到相同數(shù)值（50%或100%）。 通常在紫外-可見光范圍內(nèi)用1ug/ml的硫酸奎寧標準溶液（0.05mol/L的硫酸中）進行校正，因其產(chǎn)生的熒光十分穩(wěn)定。 波長校

18、正 若儀器的光學系統(tǒng)或檢測器有變動，或在較長使用時間之后，或在重要部件更換之后，可用汞燈的標準譜線對單色器波長刻度重新校正?，F(xiàn)在學習的是第三十三頁，共44頁 激發(fā)光譜和熒光光譜的校正 測得的激發(fā)光譜和熒光光譜往往是表觀的，其原因較多，最主要原因是光源的強度隨波長而變及每個檢測器對不同波長的光的接受敏感程度不同，及檢測器的感應(yīng)與波長不呈線性。故應(yīng)用儀器上的校正裝置將每一波長的光源強度調(diào)整一致。現(xiàn)在學習的是第三十四頁，共44頁 七 定量分析方法 1 熒光強度和熒光物質(zhì)濃度的關(guān)系 熒光強度正比于被熒光物質(zhì)吸收的光強度 即：F（ ） F= 代入上式后，展開得：0IIF0IIK（ ）0IIElCIIBe

19、er100定律：根據(jù)現(xiàn)在學習的是第三十五頁，共44頁 由此可見：熒光強度與溶液中熒光物質(zhì)濃度呈線性關(guān)系。 熒光強度的靈敏度取決于檢測器的靈敏度，即只要改進光電倍增管和放大系統(tǒng)，極微弱的熒光也能被檢測到，所以熒光分析法的靈敏度很高。KCElCIKFElCCElCElCElCIKF03203 . 205. 033 . 223 . 23 . 2時，上式可變?yōu)椋汉苄?，當若濃度?。ǎ。ìF(xiàn)在學習的是第三十六頁，共44頁 而紫外-可見分光光度法依據(jù)的是吸光度與吸光物質(zhì)濃度的線性關(guān)系，所測定的是透射光強度和入射光強度的比值，即 ，因此，即使將光強信號放大，由于透射光強和入射光強都被放大，對提高檢測靈敏度不

20、起作用。 故紫外-可見分光光度法的靈敏度不如熒 光分析法高。 2 定量分析方法 與紫外-可見光度法基本相同。0II現(xiàn)在學習的是第三十七頁，共44頁 標準曲線法 即用已知量的標準物質(zhì)經(jīng)過和試樣相同的處理之后，配成一系列標準溶液，測定這些溶液的熒光強度，以熒光強度為縱坐標，標準濃度為橫坐標，繪制標準曲線，然后在相同條件下測定試樣溶液的熒光強度，由標準曲線求出熒光物質(zhì)的含量。 直接比較法 若標準曲線過原點，可采用此法?，F(xiàn)在學習的是第三十八頁，共44頁 在相同條件下測定標準品和樣品的熒光強度，由熒光強度比及標準品的濃度可求出待測物質(zhì)的濃度。若空白溶液的熒光強度不為零，應(yīng)扣除空白溶液的熒光強度。SXSXXSXSXXSSCFFFFCCCFFFFkkCFFkCFF00000