生物物質(zhì)分離與純化

1、9.1概述概述生物物質(zhì)分離（生物物質(zhì)分離（Bioseparation)是生物化工的一個重要的組是生物化工的一個重要的組成部分，常稱之為下游過程（成部分，常稱之為下游過程（Downstream processing）。）。其與上中游同樣重要，在某種程度上，甚至大于它們。前者解其與上中游同樣重要，在某種程度上，甚至大于它們。前者解決豐產(chǎn)問題，而下游分離過程解決豐收問題。決豐產(chǎn)問題，而下游分離過程解決豐收問題。生物物質(zhì)的分離區(qū)別于其它物質(zhì)的分離在于生物物質(zhì)的分離區(qū)別于其它物質(zhì)的分離在于A: 目的產(chǎn)物濃度很低。因此耗能、費用增高和產(chǎn)物的價格也目的產(chǎn)物濃度很低。因此耗能、費用增高和產(chǎn)物的價格也相應(yīng)的增加

2、。相應(yīng)的增加。B: 生物物質(zhì)易受環(huán)境因素如溫度、生物物質(zhì)易受環(huán)境因素如溫度、pH、金屬離子和微生物等、金屬離子和微生物等的影響，增加了分離的難度。的影響，增加了分離的難度。C: 對終產(chǎn)品的質(zhì)量要求極高。特別是醫(yī)藥產(chǎn)品或作為生物制對終產(chǎn)品的質(zhì)量要求極高。特別是醫(yī)藥產(chǎn)品或作為生物制劑的產(chǎn)品。劑的產(chǎn)品。因此它是一項十分艱巨和耗資巨大的工作。對于傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)因此它是一項十分艱巨和耗資巨大的工作。對于傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)來說，（如抗生素、乙醇、檸檬酸等生產(chǎn)來說，（如抗生素、乙醇、檸檬酸等生產(chǎn)), 分離和提純部分離和提純部分費用占總投資的分費用占總投資的60%，而對基因工程菌的發(fā)酵占到，而對基因工程菌的發(fā)酵占到9

3、0%，對其下功夫研究和設(shè)計是一項十分重要和有意義的，對其下功夫研究和設(shè)計是一項十分重要和有意義的工作。工作。表表 9-1 9-1 幾種典型產(chǎn)品發(fā)酵液的濃度幾種典型產(chǎn)品發(fā)酵液的濃度發(fā)酵液發(fā)酵液細(xì)胞分離細(xì)胞分離提取、分離提取、分離純化、精制純化、精制產(chǎn)物產(chǎn)物胞外產(chǎn)物胞外產(chǎn)物胞內(nèi)產(chǎn)物胞內(nèi)產(chǎn)物離心或過濾離心或過濾細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎整體細(xì)胞萃取整體細(xì)胞萃取離心或過濾離心或過濾離心或過濾離心或過濾干燥干燥含產(chǎn)物的清液含產(chǎn)物的清液廢物廢物離心或過濾離心或過濾干燥干燥產(chǎn)物產(chǎn)物板框過濾機(jī)平板過濾機(jī)真空旋轉(zhuǎn)過濾機(jī)管式過濾機(jī)蜂窩式過濾機(jī)深層過濾機(jī)主要離心設(shè)備主要離心設(shè)備高速冷凍離心機(jī)碟片式離心機(jī)管式離心機(jī)傾析式離心機(jī)

4、框式離心機(jī)Disc-CentrifugesSolids-retainingcentrifugeNozzle with pressurizeddischarge of concentrateNozzle with peripheralnozzlesPeriodicallysolids-ejectingcentrifugePeriodicallysolids-ejectingcentrifuge withaxial channelsCentrifuges三、細(xì)胞破碎三、細(xì)胞破碎破碎方法破碎方法機(jī)械方法機(jī)械方法非機(jī)械方法非機(jī)械方法固體剪切力固體剪切力流體剪切力流體剪切力干燥處理干燥處理溶胞處理溶胞處

5、理球球磨磨法法壓壓榨榨法法高高壓壓勻勻漿漿超超聲聲法法酶酶溶溶法法化化學(xué)學(xué)法法物物理理法法壓力破碎法：利用壓力釋放時的固液剪切進(jìn)行破碎。操作簡單，可連續(xù)操作，壓力破碎法：利用壓力釋放時的固液剪切進(jìn)行破碎。操作簡單，可連續(xù)操作，適用面廣，但操作會產(chǎn)生熱，需有冷卻系統(tǒng)，同時破碎率低。適用面廣，但操作會產(chǎn)生熱，需有冷卻系統(tǒng)，同時破碎率低。珠磨破碎法：利用固體的剪切進(jìn)行破碎。操作簡單，可連續(xù)珠磨破碎法：利用固體的剪切進(jìn)行破碎。操作簡單，可連續(xù)/批式操作，適批式操作，適用面廣，但操作會產(chǎn)生熱，需有冷卻系統(tǒng)，不同細(xì)胞的破碎條件差異大。用面廣，但操作會產(chǎn)生熱，需有冷卻系統(tǒng)，不同細(xì)胞的破碎條件差異大。超聲破碎

6、法：利用超聲波形成空穴產(chǎn)生壓力沖擊進(jìn)行破碎。操作簡單，可連超聲破碎法：利用超聲波形成空穴產(chǎn)生壓力沖擊進(jìn)行破碎。操作簡單，可連續(xù)續(xù)/批式操作，但操作會產(chǎn)生熱，需有冷卻系統(tǒng)，破碎率低，適應(yīng)性差。批式操作，但操作會產(chǎn)生熱，需有冷卻系統(tǒng)，破碎率低，適應(yīng)性差。滲透壓法：利用滲透壓的突變，造成細(xì)胞內(nèi)壓力差而引起細(xì)胞的破碎。破碎滲透壓法：利用滲透壓的突變，造成細(xì)胞內(nèi)壓力差而引起細(xì)胞的破碎。破碎率低，產(chǎn)物釋放較好，操作復(fù)雜，條件要求苛刻，適用于少量樣品的處理，率低，產(chǎn)物釋放較好，操作復(fù)雜，條件要求苛刻，適用于少量樣品的處理，費用高。費用高。有機(jī)溶劑法：利用有機(jī)溶劑或表面活性劑改變細(xì)胞壁有機(jī)溶劑法：利用有機(jī)溶劑

7、或表面活性劑改變細(xì)胞壁/膜的通透性，使包內(nèi)膜的通透性，使包內(nèi)產(chǎn)物釋放的方法。該法簡單，內(nèi)含物釋放少，產(chǎn)物較純，可規(guī)?；a(chǎn)，但產(chǎn)物釋放的方法。該法簡單，內(nèi)含物釋放少，產(chǎn)物較純，可規(guī)模化生產(chǎn)，但適用面窄。適用面窄。堿或酶處理法：利用堿或酶的處理是細(xì)胞壁或膜破壞，產(chǎn)物得以釋放。該法堿或酶處理法：利用堿或酶的處理是細(xì)胞壁或膜破壞，產(chǎn)物得以釋放。該法簡單，可規(guī)模化生產(chǎn)，但適用面窄。簡單，可規(guī)模化生產(chǎn)，但適用面窄。選擇破碎法的依據(jù)：選擇破碎法的依據(jù)：細(xì)胞的處理量：細(xì)胞的處理量： 大規(guī)模，則一般采用機(jī)械法，而實驗室規(guī)模的，則選擇非機(jī)械法。大規(guī)模，則一般采用機(jī)械法，而實驗室規(guī)模的，則選擇非機(jī)械法。細(xì)胞壁的強(qiáng)

8、度和結(jié)構(gòu)：細(xì)胞壁的強(qiáng)度和結(jié)構(gòu)：酵母和真菌，含有纖維素和幾丁質(zhì)，比細(xì)菌的胞壁強(qiáng)度大，應(yīng)選擇酵母和真菌，含有纖維素和幾丁質(zhì)，比細(xì)菌的胞壁強(qiáng)度大，應(yīng)選擇高壓勻漿法。而對于有高度分之的微生物，會阻塞勻漿氣閥而不能高壓勻漿法。而對于有高度分之的微生物，會阻塞勻漿氣閥而不能應(yīng)用。應(yīng)用。目的產(chǎn)物對破碎條件的敏感性：目的產(chǎn)物對破碎條件的敏感性：破碎程度：由于破碎會使細(xì)胞碎片細(xì)小，使固液分離困難，破碎程度：由于破碎會使細(xì)胞碎片細(xì)小，使固液分離困難，所以，適宜的操作條件是高的產(chǎn)物釋放率，低能耗和便于后續(xù)提取所以，適宜的操作條件是高的產(chǎn)物釋放率，低能耗和便于后續(xù)提取三個方面權(quán)衡。三個方面權(quán)衡。四、分離和純化四、分離

9、和純化主要任務(wù)是提高溶液中的產(chǎn)品的濃度，同時也取出一些雜質(zhì)。傳統(tǒng)主要任務(wù)是提高溶液中的產(chǎn)品的濃度，同時也取出一些雜質(zhì)。傳統(tǒng)的方法包括沉淀法、吸附法、離子交換、萃取法，另外，含有超濾、的方法包括沉淀法、吸附法、離子交換、萃取法，另外，含有超濾、反滲透，電滲析、凝膠電泳等，常用的為蒸發(fā)、萃取和吸附。反滲透，電滲析、凝膠電泳等，常用的為蒸發(fā)、萃取和吸附。1. 液體蒸發(fā)：又稱濃縮，通過加熱是溶液中的部分水汽化并出去，液體蒸發(fā)：又稱濃縮，通過加熱是溶液中的部分水汽化并出去，以提高溶液的濃度。蒸發(fā)的持續(xù)進(jìn)行必須滿足而個條件：其一，保以提高溶液的濃度。蒸發(fā)的持續(xù)進(jìn)行必須滿足而個條件：其一，保證連續(xù)的提供不斷

10、汽化所需的熱量，同時不斷的移去二次蒸汽。證連續(xù)的提供不斷汽化所需的熱量，同時不斷的移去二次蒸汽。2. 液液-液萃?。菏且环N常用的方法。應(yīng)用于抗生素、有機(jī)酸、維生液萃?。菏且环N常用的方法。應(yīng)用于抗生素、有機(jī)酸、維生素、激素等發(fā)酵產(chǎn)物的分離和提取。特別是近素、激素等發(fā)酵產(chǎn)物的分離和提取。特別是近20年，與其它的技術(shù)年，與其它的技術(shù)性結(jié)合產(chǎn)生了新的分離技術(shù)，用于提取酶、蛋白質(zhì)、核酸、多肽和性結(jié)合產(chǎn)生了新的分離技術(shù)，用于提取酶、蛋白質(zhì)、核酸、多肽和氨基酸。氨基酸。 如：反膠囊萃取（如：反膠囊萃?。╮eversed micelle extraction), 超臨超臨界萃?。ń巛腿。╯upercritic

11、al fluid extraction )和液膜萃?。ê鸵耗ぽ腿。╨iquid membrane extraction)等適合等適合DNA重組技術(shù)和遺傳工程的發(fā)展重組技術(shù)和遺傳工程的發(fā)展溶質(zhì)在二個互不相容的溶劑的分配系數(shù)不同，溶質(zhì)在二個互不相容的溶劑的分配系數(shù)不同，所造成的溶質(zhì)的轉(zhuǎn)移。所造成的溶質(zhì)的轉(zhuǎn)移?；旌掀骱统吻迤骰旌掀骱统吻迤?. 雙水相萃?。浑p水相萃取； 二種互不溶的聚合物，這兩種的聚合物中的含水率很二種互不溶的聚合物，這兩種的聚合物中的含水率很高，一般在高，一般在70-90%，這樣就可以防止在有機(jī)相中的變性，同時這些，這樣就可以防止在有機(jī)相中的變性，同時這些高聚物含有保護(hù)和穩(wěn)定蛋白質(zhì)

12、等生物活性物質(zhì)的作用。高聚物含有保護(hù)和穩(wěn)定蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)的作用。4. 反膠團(tuán)萃??；反膠團(tuán)萃??； 在有機(jī)相中加入一定量的表面活性劑，形成大小為毫在有機(jī)相中加入一定量的表面活性劑，形成大小為毫微米級的微膠團(tuán)。當(dāng)此有機(jī)相與含有目的產(chǎn)物的水相形成液微米級的微膠團(tuán)。當(dāng)此有機(jī)相與含有目的產(chǎn)物的水相形成液-液萃取時，液萃取時，由于微膠團(tuán)中的表面活性劑帶有與水相中的蛋白質(zhì)相反的電荷，而將由于微膠團(tuán)中的表面活性劑帶有與水相中的蛋白質(zhì)相反的電荷，而將水相中的蛋白質(zhì)遷移入微團(tuán)內(nèi)水池中，實現(xiàn)物質(zhì)的提取。水相中的蛋白質(zhì)遷移入微團(tuán)內(nèi)水池中，實現(xiàn)物質(zhì)的提取。5. 超臨界萃取；超臨界萃取； 同樣為溶劑萃取。而此方法使用

13、的溶劑是在超臨界狀同樣為溶劑萃取。而此方法使用的溶劑是在超臨界狀態(tài)下的液態(tài)氣體，常用的為態(tài)下的液態(tài)氣體，常用的為CO2, 它具有液體的密度和氣體的高擴(kuò)散性，它具有液體的密度和氣體的高擴(kuò)散性，產(chǎn)品分離容易等特點。受到廣泛的關(guān)注。產(chǎn)品分離容易等特點。受到廣泛的關(guān)注。6; 固體吸附：固體吸附：是物質(zhì)從液相（發(fā)酵液）到固相（吸附劑）發(fā)生物質(zhì)的轉(zhuǎn)移。此法是物質(zhì)從液相（發(fā)酵液）到固相（吸附劑）發(fā)生物質(zhì)的轉(zhuǎn)移。此法用于蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、抗生素等物質(zhì)的分離和提取。用于蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、抗生素等物質(zhì)的分離和提取。按照吸附劑的作用原理：分為三大類。按照吸附劑的作用原理：分為三大類。A物理吸附：物理吸附：依

14、靠范德華力的作用。吸附劑可用活性炭、硅藻土、硅膠、分子篩依靠范德華力的作用。吸附劑可用活性炭、硅藻土、硅膠、分子篩和氧化鋁等。和氧化鋁等。B靜電吸附：靜電吸附：借助靜電引力吸附物質(zhì)。主要為合成的樹脂。借助靜電引力吸附物質(zhì)。主要為合成的樹脂。C: 親和吸附：親和吸附：在樹脂上嫁接一個能與要分離的物質(zhì)發(fā)生特異性反應(yīng)的配基。在樹脂上嫁接一個能與要分離的物質(zhì)發(fā)生特異性反應(yīng)的配基。五、提純五、提純1，層析法（，層析法（Elution Chromatography) 又稱洗脫法又稱洗脫法/色譜法。他們與吸色譜法。他們與吸附法本質(zhì)上是相同的。但在操作過程不同。造成了結(jié)果不同。附法本質(zhì)上是相同的。但在操作過程

15、不同。造成了結(jié)果不同。吸附法吸附和洗脫間斷進(jìn)行，收集洗脫液也為一次性、不分段。因此，只吸附法吸附和洗脫間斷進(jìn)行，收集洗脫液也為一次性、不分段。因此，只有濃縮而無分離。有濃縮而無分離。層析法則是吸附和洗脫同時進(jìn)行，分段收集洗脫液，因此分離和濃縮同時層析法則是吸附和洗脫同時進(jìn)行，分段收集洗脫液，因此分離和濃縮同時完成。完成。層析法又分為離子交換層析、凝膠過濾層析和親和層析層析法又分為離子交換層析、凝膠過濾層析和親和層析2：沉淀法：沉淀法適合大規(guī)模生產(chǎn)，通過采取不同的手段使發(fā)酵液中目的適合大規(guī)模生產(chǎn)，通過采取不同的手段使發(fā)酵液中目的物質(zhì)溶解度降低，使之發(fā)生沉淀，達(dá)到分離提純的目的。物質(zhì)溶解度降低，使之發(fā)生沉淀，達(dá)到分離提純的目的。常用等電點沉淀法、鹽析法、加熱沉淀法、有機(jī)溶劑沉常用等電點沉淀法、鹽析法、加熱沉淀法、有機(jī)溶劑沉淀法等淀法等3. 超濾法超濾法是一種半透膜，使溶液中的溶劑和小分子物質(zhì)通過，而是一種半透膜，使溶液中的溶劑和小分子物質(zhì)通過，而阻止截流大分子物質(zhì)的方法。阻止截流大分子物質(zhì)的方法。超濾區(qū)別于常規(guī)過濾主要采用了錯流