PCR擴(kuò)增結(jié)果分析和膠回收切膠的一點(diǎn)注意事項(xiàng)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上討論1.假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有模板核酸的制備，引物的質(zhì)量與特異性，酶的質(zhì)量，PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。模板：模板中含有Taq酶抑制劑，在提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多，或吸入酚。模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，有可能是模板核酸提取過(guò)程出了毛病，可使用陽(yáng)性對(duì)照的DNA模板配合檢查模板質(zhì)量。酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱(chēng)，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見(jiàn)原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題，兩條

2、引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱(chēng)擴(kuò)增，對(duì)策為：選定一個(gè)好的引物合成單位。引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無(wú)條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不夠，引物之間形成二聚體等。Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過(guò)高可降低PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過(guò)低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR

3、擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul、或100ul，應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。物理原因：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來(lái)說(shuō)相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過(guò)低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率，退火溫度過(guò)高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性

4、結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。2.假陽(yáng)性出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。需重新設(shè)計(jì)引物。靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，

5、在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線(xiàn)照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來(lái)減輕或消除。3.出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低，及PCR循環(huán)次數(shù)過(guò)多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來(lái)源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來(lái)源的酶則不出現(xiàn)，酶量過(guò)多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有：

6、必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物。減低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的酶。降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93變性，65左右退火與延伸)。4.出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過(guò)高，Mg2+濃度過(guò)高，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數(shù)過(guò)多引起。其對(duì)策有：減少酶量，或調(diào)換另一來(lái)源的酶。減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2+濃度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)膠回收DNA注意事項(xiàng)切膠回收DNA片段是要把整個(gè)目的片斷所在位置的膠全部回收。所以為了減少膠的體積，我們 就可以用相對(duì)比較薄的膠來(lái)跑電泳，通常只要夠點(diǎn)樣即可，或是采用

7、薄而寬的梳子來(lái)跑膠。這樣可減少回收試劑引起的一些后續(xù)麻煩。主要還是DNA的濃度, 如果DNA濃度不夠, 想膠小點(diǎn)也不可能。紫外燈下切下含待回收DNA的凝膠時(shí)，要襯以干凈的塑料薄膜，使用無(wú)DNA污染的新刀片， 其目的在于防止外源DNA的污染。利用凝膠回收試劑盒DNA回收效率較低或者未回收到目的片段可能有以下幾個(gè)原因：膠塊未完 全溶解，可適當(dāng)延長(zhǎng)水浴時(shí)間，并增加上下顛倒次數(shù)輔助溶解；膠塊體積太大，應(yīng)先將其切為小塊，分多次回收；電泳緩沖液pH太高，硅基質(zhì)膜在高鹽低pH結(jié)合 DNA，如pH太高，應(yīng)作適當(dāng)調(diào)整；漂洗液中未加入無(wú)水乙醇?？梢愿挠萌ルx子水洗脫。但是實(shí)驗(yàn)室所用純水一般pH偏低，可利用NaOH適

8、當(dāng)調(diào)高其pH 值，以增加洗脫得率。洗脫產(chǎn)物含有殘留的乙醇會(huì)影響后續(xù)酶切實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)確保徹底去除漂洗緩沖液，具體方法參見(jiàn)回收 效率低的解決方案。不可以使用更小洗脫體積（小于說(shuō)明書(shū)提供的最小洗脫體積）進(jìn)行洗脫以提高濃度，因?yàn)檎f(shuō)明書(shū) 提供的最少洗脫體積是能完全覆蓋吸附膜的最小體積，若減少體積則不能將DNA完全洗脫下來(lái)。電泳檢測(cè)只有一條目的帶，可以選用凝膠回收試劑盒。如果后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)片段純度要求較高，建議 即使只有一條帶，也可以切膠純化，其回收得到片段的純度可能要比直接回收高一些。瓊脂糖凝膠膠塊不溶可能是下述原因：瓊脂糖質(zhì)量不好；含目的片段的凝膠再空氣中放置過(guò)久， 使膠塊失水、干燥，建議切膠后立即進(jìn)行回收或

9、將膠塊保存在4或-20；制膠的電泳緩沖液濃度過(guò)高或陳舊。關(guān)于膠回收切膠的一點(diǎn)注意事項(xiàng)1. 電泳的buffer和gel都是新制的，切膠的臺(tái)子清理干凈，刀片最好洗凈滅菌，總之一句話(huà)就是保證切下的帶沒(méi)有外源污染。2. 切膠是要把整個(gè)目的片斷所在位置的膠全部回收。為了減少膠的體積，可以用相對(duì)比較薄的膠來(lái)做，只要夠點(diǎn)樣即可，也可采用薄而寬的梳子來(lái)跑膠。3. 關(guān)于防護(hù)，在一般有機(jī)玻璃后就足夠了，戴上防護(hù)面具以保護(hù)眼睛，如果戴樹(shù)脂眼鏡就可以了。要是非常害怕紫外照射，或者對(duì)于膠有特殊要求，例如要求不含 EB，可以采用點(diǎn)marker和帶刻度的尺子一起照相的方法來(lái)確定目的條帶在膠上的位置進(jìn)行切膠。4. 按照正常程

10、序點(diǎn)marker跑膠，然后切下有marker的膠，EB染色，紫外燈下與帶刻度的尺子一起照相。由于要回收的帶與marker間的相對(duì)位置已 知，根據(jù)尺子來(lái)衡量未染色膠上目的帶的位置即可。如果覺(jué)得很難判斷，可以直接在marker邊點(diǎn)少量的樣，這樣位置就容易確定了。  膠回收一. 提高膠回收量的辦法：1) 增加電泳時(shí)的上樣量。2) 電泳緩沖液用新鮮配制的。3) 切膠時(shí)盡量只切有條帶的膠，減小切膠體積：含目的片斷很少的膠就不要要了，不然影響回收率。4) 把切的兩塊或多塊膠融化后，無(wú)論多大的體積都用一個(gè)管子，轉(zhuǎn)移到同一個(gè)柱子上。5) 溶膠時(shí)所加的溶液可多一點(diǎn)，這樣更有利于DNA與膜的結(jié)合，不過(guò)一

11、般不要多余750ul。6) 膠回收的關(guān)鍵是通過(guò)柱子的溶液的鹽濃度、酸堿性（電荷）和疏水性使DNA與柱子結(jié)合，因此，若電泳緩沖液的PH偏高，可在溶膠液中加入10ul（PH 5.0，3mol/L的 NaAC）；為了使DNA更好 的攔截在膜上，可以添加30異丙醇在加熱溶解膠后的液體里。7) 加洗脫液之前，將柱子在室溫放置幾分鐘（大約需10分鐘），以使乙醇充分揮發(fā)。最后少加些洗脫液，盡量減少回收體積，一般用30-50l洗脫液洗脫（不能太少，否則無(wú)法浸濕膜反而不利于洗脫）；洗脫液滴在膜中央，以充分洗脫結(jié)合在 膜上的DNA。9) 可以在加入洗脫液之后，可以在55度水浴5分鐘或放在50度水浴10分鐘以上再洗

12、脫，或用封口膜密封4度過(guò)夜，第二天再離心回收，效果不錯(cuò)。10) 將離心后的洗脫液加回吸附柱，再次離心。二. 幾種PCR 產(chǎn)物回收的詳方法和步驟1) 普通膠回收如果要膠回收，最好還是用試劑盒，方便，回收率也略高，實(shí)在要手工回收，可以切膠后加入3倍體積TE，水浴熔化后，酚、酚氯仿抽提干凈，乙醇沉淀 即可。另外好像還有冷凍法，沒(méi)作過(guò)，不是很清楚。2) 從低熔點(diǎn)凝膠回收DNA純化DNA片段 加與凝膠體積相等的TE（10mmol/l Tris-HCl pH8.0，0.1mmol/l EDTA），置65水浴5分鐘保溫，使凝膠完全溶解。待放至室溫，加等量酚（TE飽和，TE封在上層，取下層酚），輕輕混勻（不用

13、混 勻），12000rpm，3分鐘離心。反復(fù)1-2次。取上層液，加0.1體積3mol/L醋酸鈉（pH5.2）和2.5倍體積無(wú)水乙醇，進(jìn)行乙醇沉淀。將 純化的DNA加適量TE溶解，測(cè)定含量，備用（可用于目的基因結(jié)構(gòu)分析，探針制備等）。3) 擴(kuò)增特異性好的PCR回收如果PCR擴(kuò)增特異性好，只是簡(jiǎn)單的PCR產(chǎn)物純化回收，可以在PCR產(chǎn)物中加入50ugml 的蛋白酶K，37度1h，酚氯仿抽提一次，氯仿抽提一次，上清加入0.1體積的醋酸鈉，2.5體積的無(wú)水乙醇沉淀回收。三. 不需膠回收就可直接連接的方法1) 低溫冷凍析出法跑電泳時(shí)用低熔點(diǎn)的agarose膠，跑到一定時(shí)候，將目的條帶所在的那一段膠切下，盡

14、量切干凈，讓核酸直接暴露在膠的表面，并且，把底下沒(méi)有脫氧 核酸的那點(diǎn)膠也盡量切掉，然后放入1.5ml EP管中，然后放在負(fù)75度冰箱中1030分鐘，接著1，300rpm離心510分鐘，取10ul上清，加入連接體系中。將其余的液體也吸出，儲(chǔ)存在 另一個(gè)管子中，做好標(biāo)記，放在20度備用。2) 酶切后的直接連接在你酶切后可以直接的加入連接酶和另外的片斷進(jìn)行連接是可以篩選出連接好的片斷的.四、一些注意事項(xiàng)1.電泳的buffer和gel都是新制的，切膠的臺(tái)子清理干凈，刀片最好洗凈滅菌，總之一句話(huà)就是保證切下的帶沒(méi)有外源DNA污染。2.切膠是要把整個(gè)目的片斷所在位置的膠全部回收。為了減少膠的體積，可以用相

15、對(duì)比較薄的膠來(lái)做，只要夠點(diǎn)樣即可，也可采用薄而寬的梳子來(lái)跑膠。3.關(guān)于防護(hù)，在一般有機(jī)玻璃后就足夠了，戴上防護(hù)面具以保護(hù)眼睛，如果你戴樹(shù)脂眼鏡就可以了。4.瓊脂糖對(duì)回收率有一定影響，如果瓊脂糖較多，可以增加溶膠液，保證體系鹽濃度。影響回收率的因素主要是柱子填料必須在適宜的緩沖環(huán)境中（如果用 柱子的話(huà)）。對(duì)于小于的片段回收，可加至30%異丙醇。5.如果是用PAGE回收，用水或TE溶解，槍頭搗碎，過(guò)夜浸泡，即可。當(dāng)然你要將100bp在膠中位置定好切下。已標(biāo)記的探針用X片，未標(biāo)記的用 EB。6.選用回收效率較高的柱子，比如進(jìn)口的Qiaquick spin column。7.參照克隆 用低熔點(diǎn)膠回收。

16、除低熔點(diǎn)凝膠回收法外，如用一般凝膠可用透析帶短暫電泳，離心管低部加玻璃棉，高速離心等方法回收DNA片段。附注：1影響DNA在瓊脂糖凝膠中遷移速率的因素：1)DNA大小 遷移速率U與logN成反比（N為堿基對(duì)數(shù)目）。分子大小相等，電荷基本相等（DNA結(jié)構(gòu)重復(fù)性）。分子越大，遷移越慢。等量的空間結(jié)構(gòu)緊密的電泳快（超 螺旋>線(xiàn)性DNA）2) 瓊脂糖濃度：logU=logU0 Krt 膠濃度，U為遷移率，U0 為DNA的自由電泳遷移率，t為膠濃度，Kr為介質(zhì)阻滯系數(shù)。不同的凝膠濃度，分辨不同范圍的DNAAgarose： 0.5%： 1-30 kb； 0.7%： 0.8-12 kb1.2%： 0.4-7 kb； 1.5%： 0.2-3 kb.3)DNA構(gòu)象：一般遷移速率超螺旋環(huán)狀>線(xiàn)狀DNA>單鏈開(kāi)環(huán)。當(dāng)條件變化時(shí)，情況會(huì)相反，還與瓊脂糖的濃度、電流強(qiáng)度、離子強(qiáng)度及 EB含量有關(guān)。4)所加電壓：低電壓時(shí)，線(xiàn)狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。使分辨效果好，凝膠上所加電壓不應(yīng)超過(guò)5V/cm5)堿基組成與溫度：一般影響不大4 -30 6)嵌入染料的存在：降低線(xiàn)性DNA遷移率，(不提倡加在電泳液中)7)電泳緩沖液 （0.5&