His蛋白純化原理、方法和問題分析

1、精選優(yōu)質文檔-傾情為你奉上組氨酸(His)標簽蛋白的純化 His-Tag融合蛋白是目前最常見的表達方式，而且很成熟，它的優(yōu)點是表達方便而且基本不影響蛋白的活性，無論是表達的蛋白是可溶性的或者包涵體都可以用固定金屬離子親和色譜（IMAC）純化。IMAC(Immobilized Metal-ion affinity chromatography)是Porath et al.1975年用固定IDA作為配基的填料螯合過渡金屬銅、鎳、鈷或鋅離子，可以吸附純化表面帶組氨酸、色氨酸或半胱氨酸殘基的蛋白，1987年Smith et al. 發(fā)現(xiàn)帶有幾個組氨酸或色氨酸小肽和螯合金屬離子的IDA-sephadex

2、 G-25作用力更強，此前在1986年他和他的合作者用Ni2+-IDA-sephadex G-25親和純化在氨基端帶組氨酸和色氨酸的胰島素原。同年1987年Hochuli et al.發(fā)現(xiàn)帶有相連組氨酸的多肽和Ni2+-NTA填料作用力更強于普通的肽，1988年他第一次用這樣的方法純化了帶六個組氨酸標簽的多肽，無論是在天然還是變性條件下一次親和純化都得到很好效果，此后表達帶六個組氨酸標簽的蛋白配合IMAC變得非常普遍，相對而言，不帶標簽的蛋白純化就非常困難，所以表達帶六個組氨酸標簽的蛋白配合IMAC純化變成最常用而且最有效的研究蛋白結構和功能的有力手段。1986年Porath et al.還發(fā)

3、現(xiàn)Fe3+-IDA-sephadex G-25可以用于磷酸化蛋白的純化，而后發(fā)現(xiàn)Ga3+-IDA也有同樣的效果，這樣螯合這兩種金屬離子的填料就有效用于磷酸化多肽的富集和純化，同時IMAC也可以用于純化各種和金屬離子結合的多肽，應用非常廣泛。Ni柱中的氯化鎳可以與有HIs（組蛋白）標簽的蛋白結合，也可以與咪唑結合。步驟是：過柱子前可以選擇Ni柱重生，也就是往柱子里倒氯化鎳，一個柱長體積就行了，然后平衡柱子，拿你自己的buffer，給蛋白提供最適的環(huán)境，我一般平衡4個柱長，然后蛋白上樣，你可以讓他自己掛，這樣掛柱子的效果好一些，如果流速太慢，可以加個恒流泵，但是一定不能太快，太快掛柱效果差，當然你

4、也可以選擇循環(huán)掛柱，就是恒流泵的一頭接你裝蛋白的燒杯，從柱子中留下來的液體還用同一個燒杯接回去。掛完之后，按理想來講，你的蛋白在Ni柱中與Ni就結合了，雜蛋白多數(shù)在燒杯里，留下來了，當然肯定有少量雜蛋白也掛上了，這時候你要，拿咪唑和你的buffer配，一般從0 20mM 40mM。100mM這樣洗脫（當你不知道你的蛋白大概在什么時候出來的時候）我指的是咪唑的終濃度。咪唑加入之后，會和蛋白爭奪與Ni的結合位點，雜蛋白、你的目的蛋白，會在不同的濃度被洗脫下來，洗完之后，你可以用400mM咪唑洗柱子，清理一切蛋白，然后平衡幾次，是否選擇重生你自己定咯然后放上20%乙醇保存柱子就可以咯過的蛋白用不同的

5、管子收下，然后SDS-page檢測在哪個管子里。 市面常見的商品化IMAC用于帶六個組氨酸標簽蛋白的配基有以下幾種：1、 組氨酸(His)標簽蛋白的純化步驟：大腸桿菌的破碎方法：1） 收集培養(yǎng)發(fā)酵液，4度7000-8000g離心10分鐘，收集沉淀的菌體(如果不是馬上破碎可以放-70度冷凍，但是最好能保存成小塊或者薄片，這樣好用。)2） 取1-2克菌體加10ml破碎緩沖液（pH7.4的50mM磷酸緩沖液含0.5M NaCl，0.5mg/ml溶菌酶，1mM PMSF，1mM MgCl2，1.7units/ml Benzonase,其中的菌酶，1mM PMSF，1.7units/ml Benzona

6、se現(xiàn)加）在冰上混合45分鐘，如果pH不在7-8，需要用0.5M NaOH一邊攪拌一邊滴加.如果溶菌酶10mg/ml混合時間可以縮短到10分鐘.3） 把混合菌體在冰水中用超聲探頭破碎20秒種,總共四次,中間間隔要保持2分鐘冷卻破碎液,檢測pH,如果不在7-8,還是用0.5M NaOH一邊攪拌一邊滴加去調(diào).如果菌體的為50-500克,可以高壓破碎的方法,緩沖液同上,體積為1升,破碎三次,壓力為800 bar.4） 破碎的液4度12000g離心10分鐘，如果要讓溶液更澄清，可以4度50000g離心30分鐘，這時候可以把上清和沉淀分別留樣，跑電泳，如果只沉淀中有目標蛋白，那就用變性條件下去提取。1.

7、 大腸桿菌的破碎離心的上清加2M咪唑溶液0.12ml使終濃度為20mM，樣品的總體積為10ml。2. 過柱子的樣品最好過0.45m的濾膜，避免堵柱。3.可溶性蛋白的純化：1） 平衡緩沖液：pH7.4的50mM磷酸緩沖液含0.5M NaCl，含20mM咪唑。2） 洗脫緩沖液：pH7.4的50mM磷酸緩沖液含0.5M NaCl，含500mM咪唑。3） 取1ml鎳瓊脂糖凝膠FF或鎳NTA瓊脂糖凝膠FF預裝柱，用10ml平衡緩沖液平衡，然后取破碎上清10ml樣品以0.5ml/min上樣，然后2ml/管分管收集。4） 用15ml平衡緩沖液洗去未吸附的樣品，流速1-2ml/min，2ml/管收集。5） 用

8、5 ml洗脫緩沖液洗去未吸附的樣品，流速1-2ml/min，2ml/管收集。6） 再用5ml平衡緩沖液平衡柱子，灌滿20%乙醇，封閉，以備下次使用。7） 此方法是通用的方法，但是未必能得到適合自己蛋白的滿意效果，所以優(yōu)化的辦法是洗脫可以用50mM，100mM，300mM，500mM分階段洗脫，各洗脫5個柱體積，這樣配合電泳檢測，得到適合自己的蛋白的條件。8） 收集的部分可以用紫外分光光度法、BCA法或用考瑪斯亮藍法測定蛋白的濃度，再取有蛋白的部分電泳檢測純度。二、常見問題及解決方法1.不溶解或沉淀在柱子上：要留意緩沖液體的pH，此外在樣品中添加一些表面活性劑甚至乙醇等有機溶劑可以增加疏水性蛋白

9、的溶解度，對于帶半胱氨酸多的蛋白很容易氧化聚集沉淀，所以需要加2-5mM巰基乙醇避免沉淀。2.白不吸附：這是最常見的，通常的原因有：1是標簽不暴露，被折疊在蛋白的結構內(nèi)，可以在變性的條件下去純化，如果用脲變性吸附不好，可以改用鹽酸胍，個人經(jīng)驗是這樣通?？梢允刮讲簧系牡鞍椎玫礁纳疲樌兓?。2可以選擇作用力更強，配基密度更高的填料，通常鎳瓊脂糖凝膠作用力最強，如果蛋白分子量大可以選擇手臂長的填料，如鎳NTA瓊脂糖凝膠，填料的好壞可以看填料的顏色，顏色越深那配基密度越高，作用力也相應要強。3樣品的pH過低或者沉淀導致不能吸附，所以樣品和緩沖液的pH要盡量一致，避免沉淀，通常再偏堿性條件下吸附更好

10、。3.難洗脫：如果穿透中目標蛋白明顯減少，而洗脫又沒有，取點填料加電泳緩沖液煮后離心跑電泳還是有目標蛋白，可以用更強的洗脫條件如500mM咪唑，如果還不能洗脫，可以直接用500mM咪唑加到6M鹽酸胍去洗脫。4. 電泳雜帶多：因為這種親和畢竟特異性要差點，原因在蛋白中帶組氨酸，色氨酸，半胱氨酸等很常見，特別是蛋白折疊會導致幾個這樣的氨基酸殘基臨近，這樣也會使它們和鎳柱的作用力增加，因此可以用不同濃度的咪唑階段洗脫，此外在咪唑洗脫前增加一步0.5M pH5的醋酸緩沖液洗脫，在平衡緩沖液中添加0.5%吐溫或Triton可以避免因為疏水相互作用導致非特異吸附，這樣可以電泳的雜帶明顯減少，但是如果用這樣

11、的方法還是雜帶多，那就地回頭去看看破碎的條件是不是太劇烈或者溫度控制不好導致蛋白短裂或者分解導致一些蛋白片段帶標簽，或者因為樣品長時間保存導致水解等，總之純化的好壞決定于每一個步驟，不僅僅是純化的問題。還有一個不容忽略的問題是有時候因為蛋白相互作用或者因為形成聚合體導致雜帶增加，而由于疏水相互作用或者因為離子作用可以通過添加表面活性劑或者增加離子強度得到改善，對于因為形成聚合體的可以在緩沖液和樣品中加1-2mM巰基乙醇避免，如果這樣的情況下最好是選擇鎳NTA瓊脂糖凝膠，因為它在還原劑下更穩(wěn)定。三、影響IMAC純化結果的因素1.填料的種類：不同填料廠家的填料有差別，所以使用過程最好能得到廠家的技術支持，因為不同的廠家填料不同，此外蛋白純化個性很強，沒有哪一個填料是能適合所有帶六個組氨酸標簽蛋白的純化，載量高和特異性好本身就是矛盾。2.填料的配基種類、密度、金屬離子種類填料最簡單的判斷是螯合好同樣的金屬離子，哪家產(chǎn)品的顏色越深就意味著和蛋白的作用力越強，適用范圍越廣，載量也越高，純化的好壞關鍵看純化的條件，僅有填料的特異性是不夠的，同樣配基密度下IDA填料的親和力要比NTA的強，所以NTA上不能吸附的樣品可以選擇IDA為配基的填料。3.螯合金屬離子和蛋白作用強弱為銅和鎳離子的強，而鋅和鈷離子的弱。因此如果一個蛋白作用力強，想得到好