濕熱滅菌工藝的微生物學(xué)驗證

1、2012年年9月月2 cGMP的誕生與發(fā)展的誕生與發(fā)展 藥害事件中的產(chǎn)品特點藥害事件中的產(chǎn)品特點成分復(fù)雜成分復(fù)雜對質(zhì)量要求高對質(zhì)量要求高劣質(zhì)產(chǎn)品具有致命性劣質(zhì)產(chǎn)品具有致命性患者在使用前無法確定藥品的質(zhì)量患者在使用前無法確定藥品的質(zhì)量3 1972年，英國，德旺波特事故年，英國，德旺波特事故 英國德旺波特醫(yī)院輸液滅菌過程不力而導(dǎo)致污染，造成英國德旺波特醫(yī)院輸液滅菌過程不力而導(dǎo)致污染，造成至少至少5例敗血癥患者死亡的事故。例敗血癥患者死亡的事故。 消毒柜的排氣閥已被碎玻璃和紙團(tuán)堵塞，導(dǎo)致在滅菌時消毒柜的排氣閥已被碎玻璃和紙團(tuán)堵塞，導(dǎo)致在滅菌時，消毒柜內(nèi)的空氣無法順利排出，局部空間達(dá)不到預(yù)定，消毒柜內(nèi)

2、的空氣無法順利排出，局部空間達(dá)不到預(yù)定滅菌溫度滅菌溫度 溫度記錄儀損壞溫度記錄儀損壞 在取樣和檢測方法上存在失誤在取樣和檢測方法上存在失誤 未按照書面規(guī)程操作滅菌釜未按照書面規(guī)程操作滅菌釜 設(shè)備維修保養(yǎng)存在缺陷設(shè)備維修保養(yǎng)存在缺陷41907鼠疫疫苗破傷風(fēng)梭菌1943熒光素滴眼液銅綠假單胞菌1946免疫血清疫苗金色葡萄球菌1948滑石粉破傷風(fēng)梭菌1966抗生素眼藥膏銅綠假單胞菌1970洗必泰消毒劑洋蔥假單胞菌1972靜脈注射劑假單細(xì)菌、歐文菌、腸桿菌屬亞種1977隱形眼鏡護(hù)理水黏質(zhì)沙雷菌、腸道細(xì)菌屬亞種1981外科敷藥梭菌屬亞種5藥效迅速，作用可靠藥效迅速，作用可靠可用于不宜口服給藥的患者，發(fā)揮

3、局部定位作用可用于不宜口服給藥的患者，發(fā)揮局部定位作用注射給藥不方便，注射時有疼痛注射給藥不方便，注射時有疼痛制造過程復(fù)雜，生產(chǎn)成本高制造過程復(fù)雜，生產(chǎn)成本高直接入血制劑，質(zhì)量要求比其它劑型更嚴(yán)格，使用不直接入血制劑，質(zhì)量要求比其它劑型更嚴(yán)格，使用不當(dāng)更易發(fā)生危險當(dāng)更易發(fā)生危險6無菌，成品中不得含有活的微生物無菌，成品中不得含有活的微生物無熱原無熱原澄明度，不得有肉眼可見的渾濁或異物澄明度，不得有肉眼可見的渾濁或異物安全性，不得引起對組織的刺激性或發(fā)生毒性反應(yīng)安全性，不得引起對組織的刺激性或發(fā)生毒性反應(yīng)滲透壓、滲透壓、pH、必要的物理和化學(xué)穩(wěn)定性、必要的物理和化學(xué)穩(wěn)定性7 防止微生物污染防止微

4、生物污染 防止熱原或細(xì)菌內(nèi)毒素的污染防止熱原或細(xì)菌內(nèi)毒素的污染 防止產(chǎn)品中有異物防止產(chǎn)品中有異物 裝量準(zhǔn)確裝量準(zhǔn)確8最終滅菌工藝最終滅菌工藝在高潔凈環(huán)境下進(jìn)行灌裝和密封在高潔凈環(huán)境下進(jìn)行灌裝和密封通常，產(chǎn)品、容器和密封件的微生物污染水平很低通常，產(chǎn)品、容器和密封件的微生物污染水平很低在密封容器中進(jìn)行最終滅菌在密封容器中進(jìn)行最終滅菌無菌生產(chǎn)工藝無菌生產(chǎn)工藝產(chǎn)品、容器和密封件分別進(jìn)行滅菌，然后進(jìn)行灌封產(chǎn)品、容器和密封件分別進(jìn)行滅菌，然后進(jìn)行灌封在極高潔凈環(huán)境下進(jìn)行灌裝和密封在極高潔凈環(huán)境下進(jìn)行灌裝和密封產(chǎn)品在最終容器中不再做進(jìn)一步的滅菌處理產(chǎn)品在最終容器中不再做進(jìn)一步的滅菌處理對各個組成部分的滅菌

5、工藝需要進(jìn)行嚴(yán)格驗證和監(jiān)控對各個組成部分的滅菌工藝需要進(jìn)行嚴(yán)格驗證和監(jiān)控在灌封前和灌封過程中的操作會帶來污染風(fēng)險在灌封前和灌封過程中的操作會帶來污染風(fēng)險9無菌生產(chǎn)工藝的局限無菌生產(chǎn)工藝的局限 通常的無菌保證水平通常的無菌保證水平 (10-3至至10-6) 影響因素多影響因素多最終滅菌工藝的優(yōu)點最終滅菌工藝的優(yōu)點 賦予產(chǎn)品更高的無菌保證水平賦予產(chǎn)品更高的無菌保證水平 生產(chǎn)中可變因素少，出現(xiàn)偏差的概率低生產(chǎn)中可變因素少，出現(xiàn)偏差的概率低 幾乎能殺滅產(chǎn)品中的所有微生物幾乎能殺滅產(chǎn)品中的所有微生物10包材熱穩(wěn)定差不得成為采用無菌工藝的唯一理由。企包材熱穩(wěn)定差不得成為采用無菌工藝的唯一理由。企業(yè)應(yīng)當(dāng)將選

6、擇適用于某個處方的最佳滅菌方法放在首業(yè)應(yīng)當(dāng)將選擇適用于某個處方的最佳滅菌方法放在首位，然后再考慮相應(yīng)的包裝材料。產(chǎn)品包材的選擇可位，然后再考慮相應(yīng)的包裝材料。產(chǎn)品包材的選擇可能必須考慮許多其它因素能必須考慮許多其它因素。此情況下，應(yīng)。此情況下，應(yīng)在注冊在注冊申請資料中作出科學(xué)合理的解釋。申請資料中作出科學(xué)合理的解釋。，如容器類型、，如容器類型、給藥途徑給藥途徑（如某些眼科用藥），而該容器無法經(jīng)受（如某些眼科用藥），而該容器無法經(jīng)受最終熱力滅菌，最終熱力滅菌，一般是可以接受的。一般是可以接受的。此條件此條件下，下，企業(yè)有責(zé)任繼續(xù)尋找可接受的替代容器，以便盡早采企業(yè)有責(zé)任繼續(xù)尋找可接受的替代容器，

7、以便盡早采用首選的最終滅菌法。用首選的最終滅菌法。由于最終滅菌具有最高的無菌保證水平，因此，不得由于最終滅菌具有最高的無菌保證水平，因此，不得因商業(yè)原因取消最終滅菌法。因商業(yè)原因取消最終滅菌法。11產(chǎn)品的無菌保證滅菌前微生物污染包裝密封性滅菌工藝滅菌設(shè)備滅菌工藝驗證二次污染原料設(shè)備和生產(chǎn)過程生產(chǎn)環(huán)境生產(chǎn)時限12產(chǎn)品的無菌保證非無菌生產(chǎn)過程（控制微生物污染）包裝密封性設(shè)備材料藥液的滅菌原料設(shè)備和生產(chǎn)過程生產(chǎn)環(huán)境生產(chǎn)時限工藝設(shè)計人員防護(hù)操作模式環(huán)境監(jiān)測與評價無菌生產(chǎn)工藝驗證質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、微生物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、微生物學(xué)檢驗方法及驗證、學(xué)檢驗方法及驗證、設(shè)備與工藝驗證、設(shè)備與工藝驗證、環(huán)境監(jiān)測、工藝與環(huán)境監(jiān)測、

8、工藝與過程控制、更衣、過程控制、更衣、人員培訓(xùn)人員培訓(xùn)無菌生產(chǎn)過程(防止微生物污染)13 最終滅菌產(chǎn)品最終滅菌產(chǎn)品 灌裝在容器中的藥品灌裝在容器中的藥品必要時，產(chǎn)品溶液或粉末、內(nèi)包裝材料、設(shè)備、管路必要時，產(chǎn)品溶液或粉末、內(nèi)包裝材料、設(shè)備、管路必要時，用具、人員防護(hù)裝備等必要時，用具、人員防護(hù)裝備等 無菌工藝產(chǎn)品無菌工藝產(chǎn)品 產(chǎn)品的組分、內(nèi)包裝材料和直接接觸設(shè)備產(chǎn)品的組分、內(nèi)包裝材料和直接接觸設(shè)備A級（或級（或ISO 5級）內(nèi)，任何接近產(chǎn)品的材料、人員級）內(nèi)，任何接近產(chǎn)品的材料、人員 防護(hù)裝備、用具等防護(hù)裝備、用具等14 殺滅或除去所有微生物繁殖體和芽胞殺滅或除去所有微生物繁殖體和芽胞 最大限

9、度地提高藥物制劑的安全性最大限度地提高藥物制劑的安全性 保護(hù)制劑的穩(wěn)定性保護(hù)制劑的穩(wěn)定性 保證制劑的臨床療效保證制劑的臨床療效 研究、選擇有效的滅菌方法，對保證產(chǎn)品質(zhì)量具有研究、選擇有效的滅菌方法，對保證產(chǎn)品質(zhì)量具有重要意義重要意義15 最終滅菌藥品最終滅菌藥品 濕熱滅菌法、干熱滅菌法、輻射滅菌法無菌工藝藥品無菌工藝藥品 除菌過濾法（如產(chǎn)品、工藝氣體等） 濕熱滅菌法、干熱滅菌法 輻照滅菌法（如防護(hù)裝備、濾器、一次性用具等） 液體滅菌法（如某些生物制品、器械） 氣體滅菌法（如防護(hù)裝備、濾器等） 低溫蒸汽滅菌法（進(jìn)入隔離器的包裝材料等）16產(chǎn)品特定性滅菌工藝過度殺滅法滅菌工藝驗證時和日常滅菌前微生

10、物監(jiān)控所需要的信息量預(yù)計效期供熱量上升上升下降17Bioburden-based process含菌量控制工藝StabilityStabilityStabilitySterilitySterilitySterilityOverkill process過度殺滅工藝相同溫度下時間遞增相同溫度下時間遞增滅菌前含菌量和耐熱性監(jiān)控信息需求遞增（滅菌前含菌量和耐熱性監(jiān)控信息需求遞增（USP）Biological indicator/bioburden combined process生物指示劑/含菌量聯(lián)合控制工藝18 又稱為又稱為Moist heat sterilization under pressur

11、e 細(xì)胞內(nèi)起關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)和酶發(fā)生熱變性或凝固。細(xì)胞內(nèi)起關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)和酶發(fā)生熱變性或凝固。濕度對該破壞性過程起促進(jìn)作用。只要可能，通常取濕度對該破壞性過程起促進(jìn)作用。只要可能，通常取121（2個大氣壓）個大氣壓） 優(yōu)點：優(yōu)點：無殘留，不污染環(huán)境，不破壞產(chǎn)品表面，容易無殘留，不污染環(huán)境，不破壞產(chǎn)品表面，容易控制和重現(xiàn)性好控制和重現(xiàn)性好 包括脈動真空滅菌器（或稱預(yù)真空滅菌器）、蒸汽包括脈動真空滅菌器（或稱預(yù)真空滅菌器）、蒸汽-空空氣混合物滅菌器、過熱水滅菌器等氣混合物滅菌器、過熱水滅菌器等19 國外法規(guī)和指南國外法規(guī)和指南 USP ISO 17665 ISO 11138-BI, ISO 11

12、140-CI HTM 2010 EN 554, 285 PDA Technical Report No. 1脈動真空滅菌器示意圖20 原理：使微生物氧化而不是蛋白質(zhì)變性，因此溫度要高原理：使微生物氧化而不是蛋白質(zhì)變性，因此溫度要高得多，時間也相應(yīng)延長得多，時間也相應(yīng)延長 利用干熱滅菌工藝滅菌溫度高、時間長的特點，可使干利用干熱滅菌工藝滅菌溫度高、時間長的特點，可使干熱滅菌同時具備除熱原的功用。熱滅菌同時具備除熱原的功用。 干熱滅菌適用于耐高溫但不適于濕熱或可被濕熱破壞的干熱滅菌適用于耐高溫但不適于濕熱或可被濕熱破壞的物品，如玻璃、金屬設(shè)備、器具，不需濕氣穿透的油脂物品，如玻璃、金屬設(shè)備、器具，

13、不需濕氣穿透的油脂類，耐高溫的粉末化學(xué)藥品等類，耐高溫的粉末化學(xué)藥品等 干熱滅菌不適用于橡膠、塑料及大部分藥品。干熱滅菌不適用于橡膠、塑料及大部分藥品。21 國外法規(guī)和指南國外法規(guī)和指南 USP ISO 11138-BI, ISO 11140-CI ISO 20857 PDA Technical Report No. 3 PDA Technical Report No. 722滅菌劑的種類滅菌劑的種類 環(huán)氧乙烷（環(huán)氧乙烷（ETO，C2H4O） 臭氧（臭氧（Ozone，O3） 二氧化氯（二氧化氯（Chlorine Dioxide - ClO2）氣體滅菌不同于低溫蒸汽滅菌氣體滅菌不同于低溫蒸汽滅菌

14、23輻射類型輻射類型 射線，穿透力差射線，穿透力差 射線，穿透力略強于射線，穿透力略強于射線射線 射線，穿透力很強射線，穿透力很強 X射線，人工產(chǎn)生的電磁輻射射線，人工產(chǎn)生的電磁輻射 電子束，可用于表面消毒（低能量）或內(nèi)部消毒（高能電子束，可用于表面消毒（低能量）或內(nèi)部消毒（高能量）量）電離輻射殺滅微生物的作用，可以分為直接作用和間電離輻射殺滅微生物的作用，可以分為直接作用和間接作用兩種接作用兩種 國外法規(guī)和指南國外法規(guī)和指南 ISO 11737 PDA Technical Report No. 11 PDA Technical Report No. 1625定義：定義： 除菌過濾是指除去流體

15、中微生物的工藝過程，該過程不應(yīng)除菌過濾是指除去流體中微生物的工藝過程，該過程不應(yīng)對產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)生不良影響。對產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)生不良影響。 包括液體和氣體除菌過濾。藥品生產(chǎn)中采用的除菌過濾膜包括液體和氣體除菌過濾。藥品生產(chǎn)中采用的除菌過濾膜的孔徑一般不超過的孔徑一般不超過0.22um（或者（或者0.2um，這兩種標(biāo)稱沒有，這兩種標(biāo)稱沒有區(qū)別）區(qū)別）除菌級過濾器可以有不同的大小、形式和膜材，過濾除菌級過濾器可以有不同的大小、形式和膜材，過濾器的使用者應(yīng)當(dāng)根據(jù)使用需要選擇不同的過濾器。器的使用者應(yīng)當(dāng)根據(jù)使用需要選擇不同的過濾器。26除菌級過濾器是指在工藝條件下每除菌級過濾器是指在工藝條件下每cm2 有效過濾

16、面積可有效過濾面積可以截留以截留107 CFU的缺陷假單胞菌（的缺陷假單胞菌（Brevundimonas diminuta, ATCC 19146）的過濾器。）的過濾器。影響細(xì)菌截留效果的因素影響細(xì)菌截留效果的因素 過濾器源的因素，如過濾器類型、結(jié)構(gòu)、基礎(chǔ)聚合物、過濾器源的因素，如過濾器類型、結(jié)構(gòu)、基礎(chǔ)聚合物、表面改性化學(xué)、孔徑分布和過濾膜的厚度等表面改性化學(xué)、孔徑分布和過濾膜的厚度等 工藝源的因素，如流體組分、流體性質(zhì)、工藝條件，產(chǎn)工藝源的因素，如流體組分、流體性質(zhì)、工藝條件，產(chǎn)品、料液和生產(chǎn)環(huán)境中實際微生物污染的特點和水平等品、料液和生產(chǎn)環(huán)境中實際微生物污染的特點和水平等27 國外指南性文

17、件國外指南性文件 PDA Technical Report No. 15 PDA Technical Report No. 26 PDA Technical Report No. 40 PDA Technical Report No. 4128氣體滅菌與低溫蒸汽滅菌的區(qū)別氣體滅菌與低溫蒸汽滅菌的區(qū)別 氣體滅菌穿透性好，分布均勻，不易受到溫濕度影響氣體滅菌穿透性好，分布均勻，不易受到溫濕度影響 低溫蒸汽滅菌，兩個階段的濃度不同，條件不易控制低溫蒸汽滅菌，兩個階段的濃度不同，條件不易控制來自來自PDA Sterilization Technology29滅菌劑的種類滅菌劑的種類 過氧化氫（過氧化氫

18、（Hydrogen Peroxide，H2O2） 過氧乙酸（過氧乙酸（Peracetic Acid - C2H4O3 ） 甲醛（甲醛（Formaldehyde - CH2O）低溫蒸汽滅菌的特點低溫蒸汽滅菌的特點 室溫殘留，穿透性低，環(huán)境中的溫濕度會有差異，工藝室溫殘留，穿透性低，環(huán)境中的溫濕度會有差異，工藝的均一性不好的均一性不好30 無菌無菌(Sterility)：是指產(chǎn)品中不存在任何活的微生物。這是指產(chǎn)品中不存在任何活的微生物。這個絕對的概念，無法用實驗來證明，不能成為工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)個絕對的概念，無法用實驗來證明，不能成為工業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 滅菌工藝滅菌工藝(Sterilization)： 通過適當(dāng)?shù)奈锢?/p>

19、或化學(xué)手段，將一定數(shù)量的活性微生通過適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)手段，將一定數(shù)量的活性微生物完全殺滅，并且使其生命活動產(chǎn)生了不可逆轉(zhuǎn)的過物完全殺滅，并且使其生命活動產(chǎn)生了不可逆轉(zhuǎn)的過程。最終滅菌是最常采用的工藝，新版程。最終滅菌是最常采用的工藝，新版GMP附錄已明附錄已明確，不包括流通蒸汽滅菌確，不包括流通蒸汽滅菌 無菌保證值（無菌保證值（SAL）：）：指經(jīng)滅菌后非無菌品的概率。通指經(jīng)滅菌后非無菌品的概率。通常為常為10-6或或10-3（來自（來自ISO 11139）31濕熱滅菌通常指一定壓力下的蒸汽滅菌，盡管有時濕熱滅菌通常指一定壓力下的蒸汽滅菌，盡管有時也采用過熱水滅菌，如水浴式或噴淋式也采用過熱水滅

20、菌，如水浴式或噴淋式。蒸汽滅菌是一個高效的熱傳遞方式，因為蒸汽接觸蒸汽滅菌是一個高效的熱傳遞方式，因為蒸汽接觸溫度較低的物體時，會釋放潛熱，生成冷凝水，直溫度較低的物體時，會釋放潛熱，生成冷凝水，直到物體溫度與蒸汽溫度相等。到物體溫度與蒸汽溫度相等。32水140120100806040200-20508Joules2707Joules水和蒸汽飽和蒸汽2199以恒定速率加熱在2個大氣壓下的水加熱曲線160過熱蒸汽33濕熱滅菌工藝的無菌標(biāo)準(zhǔn)濕熱滅菌工藝的無菌標(biāo)準(zhǔn)原則標(biāo)準(zhǔn)原則標(biāo)準(zhǔn)-定義定義通過物理通過物理/生物學(xué)方法證明，單位產(chǎn)品內(nèi)微生物存在的生物學(xué)方法證明，單位產(chǎn)品內(nèi)微生物存在的概率不得超過百萬分

21、之一，即批產(chǎn)品的污染概率不得概率不得超過百萬分之一，即批產(chǎn)品的污染概率不得超過百萬分之一超過百萬分之一實際控制標(biāo)準(zhǔn)實際控制標(biāo)準(zhǔn)過度殺滅法（過度殺滅法（F012）殘存概率法（殘存概率法（F08）Fo8最早在出現(xiàn)在最早在出現(xiàn)在USPXIX P709、BP1980 A196中。中。不應(yīng)當(dāng)將不應(yīng)當(dāng)將Fo8簡單地等同于無菌標(biāo)準(zhǔn)簡單地等同于無菌標(biāo)準(zhǔn) 34SALlgN6543210-1-2-3-4-5-602468101235實驗表明，在恒定的滅菌溫度下，同一種微生物的實驗表明，在恒定的滅菌溫度下，同一種微生物的死亡遵循一級動力學(xué)規(guī)則，其死亡速率是微生物的死亡遵循一級動力學(xué)規(guī)則，其死亡速率是微生物的耐熱參數(shù)

22、耐熱參數(shù)D和殺滅時間的函數(shù)，與滅菌程序中微生和殺滅時間的函數(shù)，與滅菌程序中微生物的數(shù)量無關(guān)?？捎孟旅娴陌雽?shù)一級動力模式表物的數(shù)量無關(guān)?？捎孟旅娴陌雽?shù)一級動力模式表示：示：Lg NF= Lg N0 - F(T,z)/DT 等式等式1NF滅菌滅菌F分鐘后，微生物存活的數(shù)量分鐘后，微生物存活的數(shù)量F(T,z)滅菌程序在滅菌程序在T和溫度系數(shù)和溫度系數(shù)z下的等效滅菌時間下的等效滅菌時間DT微生物在微生物在T下，下降一對數(shù)單位所需的時間。說明：該特定下，下降一對數(shù)單位所需的時間。說明：該特定溫度必須與溫度必須與F值計算中所采用的溫度相一致值計算中所采用的溫度相一致N0初始微生物的數(shù)量初始微生物的數(shù)量

23、36無菌檢查實驗的局限性無菌檢查實驗的局限性 實驗本身存在統(tǒng)計學(xué)局限性實驗本身存在統(tǒng)計學(xué)局限性p, 批產(chǎn)品的污染率；批產(chǎn)品的污染率；n，取樣量，取樣量批檢驗不合格的可能性批檢驗不合格的可能性 = 1-(1-p)n 取樣量實際污染率0.1151015100.010.090.400.660.80200.020.180.650.890.96500.050.340.920.991000.090.630.993000.260.953,0000.9537是熱不穩(wěn)定材料嗎？按產(chǎn)品特性設(shè)計法采用過度殺滅設(shè)計法被滅菌品的形式？需考慮抽真空？現(xiàn)抽真空滅菌器？脈動真空程序重力置換程序否是多孔固體物品密封液體產(chǎn)品要過

24、熱水或SAMSAM程序任何濕熱程序有無可不可可用過熱水程序？要不要需加壓嗎？SAM：表示蒸汽及空氣的混合物不要38藥典要求藥典要求EP 對過度殺滅法的工藝要求：對過度殺滅法的工藝要求： 對溶液的滅菌條件至少為對溶液的滅菌條件至少為121oC 15分鐘；也可采分鐘；也可采用其它組合條件，但滅菌效果須與上述相等效。用其它組合條件，但滅菌效果須與上述相等效。目標(biāo)：目標(biāo)： SAL= 10-6或更低或更低39藥典要求藥典要求EP 對過度殺滅法的工藝要求：對過度殺滅法的工藝要求： 對溶液的滅菌條件至少為對溶液的滅菌條件至少為121oC 15分鐘；也可采分鐘；也可采用其它組合條件，但滅菌效果須與上述相等效。

25、用其它組合條件，但滅菌效果須與上述相等效。目標(biāo)：目標(biāo)： SAL= 10-6或更低或更低USP 對過度殺滅法的工藝要求：對過度殺滅法的工藝要求： 對溶液的滅菌條件需達(dá)到對溶液的滅菌條件需達(dá)到12D，至少為，至少為12 分鐘分鐘目標(biāo)：使目標(biāo)：使D121=1分鐘，數(shù)量為分鐘，數(shù)量為106的微生物經(jīng)過滅的微生物經(jīng)過滅菌后達(dá)到菌后達(dá)到SAL= 10-6。40滅菌工藝的開發(fā)與設(shè)計滅菌工藝的開發(fā)與設(shè)計根據(jù)滅菌前帶菌量進(jìn)行設(shè)計（產(chǎn)品特性設(shè)計法）根據(jù)滅菌前帶菌量進(jìn)行設(shè)計（產(chǎn)品特性設(shè)計法） 基于對滅菌前產(chǎn)品所含微生物的耐熱特性和數(shù)量基于對滅菌前產(chǎn)品所含微生物的耐熱特性和數(shù)量以及產(chǎn)品的熱穩(wěn)定性以及產(chǎn)品的熱穩(wěn)定性 滅

26、菌后產(chǎn)品的污染概率須小于滅菌后產(chǎn)品的污染概率須小于10-6。過度殺滅法過度殺滅法 基于工藝程序能殺滅更加耐熱微生物，并且再加基于工藝程序能殺滅更加耐熱微生物，并且再加上一定的安全系數(shù)；上一定的安全系數(shù)； 理論上對生物指示劑孢子的殺滅能力達(dá)到理論上對生物指示劑孢子的殺滅能力達(dá)到10-12。將兩者相結(jié)合將兩者相結(jié)合 兼顧產(chǎn)品的熱穩(wěn)定性和無菌要求。兼顧產(chǎn)品的熱穩(wěn)定性和無菌要求。41EMEAEMEA滅菌工藝決策樹（適用于液體制劑）滅菌工藝決策樹（適用于液體制劑）能否耐受12115分鐘的濕熱滅菌條件選擇121 15分鐘濕熱滅菌工藝是否能否耐受F08的濕熱滅菌條件，以達(dá)到SAL10-6選擇F08的濕熱滅菌

27、工藝，以達(dá)到SAL10-6是否使用無菌過濾加無菌灌封方式是否能否經(jīng)可截留微生物的過濾器對藥液進(jìn)行除菌過濾對原料預(yù)先滅菌，進(jìn)行無菌配制和無菌灌封42確認(rèn)（確認(rèn)（IQ、OQ） 滅菌設(shè)備的安裝、運行符合設(shè)定的要求滅菌設(shè)備的安裝、運行符合設(shè)定的要求驗證（驗證（PQ） 產(chǎn)品滅菌程序的有效性和重現(xiàn)性產(chǎn)品滅菌程序的有效性和重現(xiàn)性評估評估 滅菌過程中可能發(fā)生的各種變化給滅菌效果帶來的滅菌過程中可能發(fā)生的各種變化給滅菌效果帶來的影響，產(chǎn)品是否能達(dá)到藥典規(guī)定的無菌保證水平影響，產(chǎn)品是否能達(dá)到藥典規(guī)定的無菌保證水平43檢查設(shè)備構(gòu)造、控制檢查設(shè)備構(gòu)造、控制/監(jiān)測系統(tǒng)、運行系統(tǒng)、安全系監(jiān)測系統(tǒng)、運行系統(tǒng)、安全系統(tǒng)及所有

28、零部件均與采購技術(shù)要求（統(tǒng)及所有零部件均與采購技術(shù)要求（URS）相符；）相符；控制控制/監(jiān)測儀表的校驗，包括程序控制器、溫度、壓監(jiān)測儀表的校驗，包括程序控制器、溫度、壓力和時間控制設(shè)備，以及計時器、記錄測量儀等；力和時間控制設(shè)備，以及計時器、記錄測量儀等；試車試車 空載熱分布試驗（來自空載熱分布試驗（來自PDA技術(shù)報告草案）技術(shù)報告草案） 溫度探頭溫度探頭 10-20支；探頭精確度支；探頭精確度 0.5; 須有探頭與腔室原探頭并列放置須有探頭與腔室原探頭并列放置; 檢測報警和安全系統(tǒng)的可靠性檢測報警和安全系統(tǒng)的可靠性; 真空系統(tǒng)的可靠性真空系統(tǒng)的可靠性 (起的作用、保持時間等起的作用、保持時間

29、等); 滅菌溫度下，各點間最大溫差滅菌溫度下，各點間最大溫差(腔室內(nèi)腔室內(nèi))2 ；同；同一點的最大溫差一點的最大溫差 1.0 ; 重復(fù)試驗至少重復(fù)試驗至少 3次以證明具有重現(xiàn)性。次以證明具有重現(xiàn)性。44每種裝載方式下的熱穿透試驗每種裝載方式下的熱穿透試驗 證明特定滅菌程序殺滅微生物的均一性和有效性證明特定滅菌程序殺滅微生物的均一性和有效性; 證明滅菌程序的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性證明滅菌程序的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性; 證明滅菌程序?qū)Ρ粶缇锲返倪m用性。證明滅菌程序?qū)Ρ粶缇锲返倪m用性。容器內(nèi)部產(chǎn)品的熱穿透試驗容器內(nèi)部產(chǎn)品的熱穿透試驗 證明在每種裝載方式下：證明在每種裝載方式下： 各點溫度分布的均一性、各點溫度分

30、布的均一性、 滅菌結(jié)果的重現(xiàn)性滅菌結(jié)果的重現(xiàn)性; 證明最冷點達(dá)到了設(shè)定效果。證明最冷點達(dá)到了設(shè)定效果。高高中中低低45生物指示劑試驗生物指示劑試驗 結(jié)果與熱穿透試驗保持一致結(jié)果與熱穿透試驗保持一致 所有測試點均應(yīng)確保所有測試點均應(yīng)確保 SAL不低于不低于 10-6 試驗次數(shù)足以符合統(tǒng)計學(xué)要求（至少重復(fù)試驗次數(shù)足以符合統(tǒng)計學(xué)要求（至少重復(fù)3次試次試驗，試樣數(shù)為驗，試樣數(shù)為 10 20支支/次）次）46空載熱分布和滿載熱分布試驗（供參考）空載熱分布和滿載熱分布試驗（供參考） 溫度探頭溫度探頭 10-20支；探頭精確度支；探頭精確度 0.5 ; 必須有探頭與腔室原探頭并列放置必須有探頭與腔室原探頭并

31、列放置; 檢測報警和安全系統(tǒng)的可靠性檢測報警和安全系統(tǒng)的可靠性; 真空系統(tǒng)的可靠性真空系統(tǒng)的可靠性 (產(chǎn)生的效率、維持時間等產(chǎn)生的效率、維持時間等); 滅菌程序一般選擇滅菌程序一般選擇12120分鐘；分鐘； 針對蒸汽透過型物品，在滅菌恒溫段內(nèi)，所有探頭溫度都在針對蒸汽透過型物品，在滅菌恒溫段內(nèi)，所有探頭溫度都在平均溫度的平均溫度的1.5以內(nèi)；在任何時間各點最大溫差不超過以內(nèi)；在任何時間各點最大溫差不超過2 ；實際滅菌時間控制在期望值的實際滅菌時間控制在期望值的1%以內(nèi)；實際滅菌壓力以內(nèi)；實際滅菌壓力控制在期望值的控制在期望值的1.6%以內(nèi)；冷點位置固定以內(nèi)；冷點位置固定 ; 針對蒸汽不可透過型

32、物品，在滅菌恒溫段內(nèi)，所有探頭溫度針對蒸汽不可透過型物品，在滅菌恒溫段內(nèi)，所有探頭溫度都在平均溫度的都在平均溫度的1以內(nèi)；在任何時間各點最大溫差不超過以內(nèi)；在任何時間各點最大溫差不超過1.5 ；實際滅菌時間控制在期望值的實際滅菌時間控制在期望值的1%以內(nèi)；其它各項以內(nèi)；其它各項性能指標(biāo)均一性能指標(biāo)均一 ; 重復(fù)試驗至少重復(fù)試驗至少 3次以證明重現(xiàn)性次以證明重現(xiàn)性.47無菌保證值（無菌保證值（SAL）：指經(jīng)滅菌后非無菌品的概率。）：指經(jīng)滅菌后非無菌品的概率。最終滅菌產(chǎn)品非無菌品的概率不超過百萬分之一，即最終滅菌產(chǎn)品非無菌品的概率不超過百萬分之一，即SAL10-6D值：在一定溫度下將微生物數(shù)量殺滅

33、值：在一定溫度下將微生物數(shù)量殺滅90%或下降一或下降一個對數(shù)單位所需要的時間（分鐘）個對數(shù)單位所需要的時間（分鐘）FT：指：指T下的滅菌時間下的滅菌時間F0：指標(biāo)準(zhǔn)滅菌時間。將：指標(biāo)準(zhǔn)滅菌時間。將121 作為標(biāo)準(zhǔn)滅菌溫度，作為標(biāo)準(zhǔn)滅菌溫度，當(dāng)當(dāng)Z設(shè)定為設(shè)定為10 時，滅菌程序賦予被滅菌品時，滅菌程序賦予被滅菌品121 下下的等效滅菌時間。的等效滅菌時間。48滅菌率（滅菌率（L，Lethal Rate）公式：公式：L(Tref,z)=10(T-Tref)/zT被加熱的物體的實際溫度Tref參照溫度，通常取121 z微生物的z值（可取10），指使微生物的D變更一個對數(shù)單位滅菌溫度所需調(diào)節(jié)的度數(shù) 用

34、用121和和z取取10代入，得代入，得L=1，即一個標(biāo)準(zhǔn)單位，其它，即一個標(biāo)準(zhǔn)單位，其它溫度下，可代入計算溫度下，可代入計算 L公式推導(dǎo)：詳見藥品生產(chǎn)管理規(guī)范與質(zhì)量保證（南京公式推導(dǎo)：詳見藥品生產(chǎn)管理規(guī)范與質(zhì)量保證（南京大學(xué)出版社大學(xué)出版社 1989年）附錄三：濕熱滅菌和無菌保證。年）附錄三：濕熱滅菌和無菌保證。49 從從L的公式推導(dǎo)，可得：的公式推導(dǎo)，可得：Fo/FT=D121/DT=LFo = D121 ( logN0 - logNt ) 從滅菌率的公式，可求得不同溫度下的滅菌率（詳見下從滅菌率的公式，可求得不同溫度下的滅菌率（詳見下頁），當(dāng)?shù)陀陧摚?，?dāng)?shù)陀?00時時，L可忽略不計。可忽略

35、不計。F0 = 10(T 121)/Z dt tnt0將介紹三個示例將介紹三個示例50T/() Z7Z8Z9Z10Z11Z121000.0010.0020.0060.0080.0120.0181150.1390.1780.2150.2510.2850.3161160.1930.2370.2780.3160.3510.3831170.2680.3160.3590.3980.4330.4641180.3730.4220.4640.5010.5340.562118.50.4390.4890.5270.5620.5930.6191190.5180.5620.5990.6310.6580.6811200

36、.7200.7500.7740.7940.8110.8251211.001.001.001.001.001.001221.391.331.291.251.231.2151 芽孢是休眠體芽孢是休眠體Endospore與與Exospore 形成芽孢的細(xì)菌種類形成芽孢的細(xì)菌種類 芽孢的特性芽孢的特性 常用芽孢常用芽孢 嗜熱脂肪芽孢桿菌的內(nèi)生孢子嗜熱脂肪芽孢桿菌的內(nèi)生孢子 梭狀芽孢桿菌梭狀芽孢桿菌 成熟芽孢的成熟芽孢的電鏡照片電鏡照片52濕熱滅菌法驗證用生物指示劑，詳見后述濕熱滅菌法驗證用生物指示劑，詳見后述干熱滅菌法驗證用生物指示劑干熱滅菌法驗證用生物指示劑 枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌(Bacillu

37、s subtilis v. niger)孢子，現(xiàn)稱為孢子，現(xiàn)稱為萎縮芽孢桿菌萎縮芽孢桿菌(Bacillus atropheus)孢子孢子 內(nèi)毒素挑戰(zhàn)去熱原工藝驗證替代生物指示劑驗證內(nèi)毒素挑戰(zhàn)去熱原工藝驗證替代生物指示劑驗證 化學(xué)滅菌法驗證用生物指示劑化學(xué)滅菌法驗證用生物指示劑 嗜熱脂肪芽孢桿菌嗜熱脂肪芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus) 孢子孢子53輻射滅菌法驗證用生物指示劑輻射滅菌法驗證用生物指示劑 短小芽孢桿菌短小芽孢桿菌(Bacillus pumillus)孢子孢子 環(huán)氧乙烷滅菌用生物指示劑環(huán)氧乙烷滅菌用生物指示劑 枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌(Bacil

38、lus subtilis v. niger)孢子，現(xiàn)稱為孢子，現(xiàn)稱為萎縮芽孢桿菌萎縮芽孢桿菌(Bacillus atropheus)孢子孢子汽態(tài)過氧化氫（汽態(tài)過氧化氫（VPHP）滅菌用生物指示劑）滅菌用生物指示劑 嗜熱脂肪芽孢桿菌嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)孢子孢子 梭狀芽孢桿菌梭狀芽孢桿菌(Clostridium sporogenes)孢子孢子 枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)孢子孢子54在過度殺滅程序的確認(rèn)中，最常采用在過度殺滅程序的確認(rèn)中，最常采用BI： 嗜熱脂肪芽孢桿菌嗜熱脂肪芽孢桿菌/Geobacillus

39、stearothermophilus，前，前稱稱 Bacillus stearothermophilus； 也可采用其他對濕熱滅菌耐熱性強的微生物。也可采用其他對濕熱滅菌耐熱性強的微生物。在采用在采用“殘存概率法殘存概率法”確認(rèn)中，典型的確認(rèn)中，典型的BI有：有： Clostridum sporogenes（生孢梭菌，梭狀芽孢桿菌（生孢梭菌，梭狀芽孢桿菌 ） Bacillus atrophaeus（萎縮芽孢桿菌）（萎縮芽孢桿菌） Bacillus smithii（史密氏桿菌，前稱凝結(jié)芽孢桿菌）（史密氏桿菌，前稱凝結(jié)芽孢桿菌） Bacillus subtilis（枯草芽孢桿菌（枯草芽孢桿菌523

40、0）55菌種名稱菌種名稱D121 值范圍值范圍 (min)嗜熱脂肪芽孢桿菌嗜熱脂肪芽孢桿菌Geobacillus stearothermophilus1.5-3.0枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis0.3-0.7凝結(jié)芽孢桿菌凝結(jié)芽孢桿菌Bacillus coagulans0.4-0.8梭狀芽孢桿菌梭狀芽孢桿菌Clostridum sporogenes0.4-1.056熱穩(wěn)定產(chǎn)品熱穩(wěn)定產(chǎn)品 適用的菌種有適用的菌種有G. stearothermuphlus或本或本ISO 11138其其它部分所要求同樣性能的微生物。它部分所要求同樣性能的微生物。 例如例如Geobacillu

41、s stearothermophilus ATCC7953 (5230) ，ATCC 12980 等等 注注 Bacillus stearothermophilus 已已 重新命名為重新命名為Geobacillus stearothermophilus.熱穩(wěn)定性較差的產(chǎn)品：熱穩(wěn)定性較差的產(chǎn)品： 低于低于121，如不用，如不用Geobacillus stearothermophilus ，可用可用Bacillus subtilis ATCC35021 (5230)，但需測試其，但需測試其耐熱性耐熱性57接種的載體及接種的載體及BI，活菌數(shù)應(yīng)，活菌數(shù)應(yīng)1.010E5耐熱性可以耐熱性可以121下的下

42、的D值表示。每批值表示。每批BI或其已接種的或其已接種的載體的載體的D值，應(yīng)以值，應(yīng)以121下下 的分鐘數(shù)表示，至少應(yīng)至的分鐘數(shù)表示，至少應(yīng)至小數(shù)點后的一位。小數(shù)點后的一位。已接種懸浮液或載體的已接種懸浮液或載體的D121應(yīng)應(yīng)1.5分鐘。如果是其它分鐘。如果是其它菌種，則應(yīng)有菌種，則應(yīng)有D參數(shù)的相關(guān)技術(shù)。參數(shù)的相關(guān)技術(shù)。微生物的微生物的z應(yīng)有應(yīng)有3 個點，溫度范圍在個點，溫度范圍在110 130間，間，z值應(yīng)值應(yīng)6。58生物殺滅力（生物殺滅力（FBiological） 用以證明滅菌程序殺滅效果的標(biāo)準(zhǔn)用以證明滅菌程序殺滅效果的標(biāo)準(zhǔn)BI制劑制劑 試驗結(jié)果可直接反映滅菌效果試驗結(jié)果可直接反映滅菌效果

43、 有時可取代物理手段的不足有時可取代物理手段的不足(如探頭無法放入如探頭無法放入) 局限性：較難進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析局限性：較難進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析物理殺滅力（物理殺滅力（FPhysical） 長期的試驗確立了標(biāo)準(zhǔn)滅菌時間長期的試驗確立了標(biāo)準(zhǔn)滅菌時間Fo與微生物殺滅的效果與微生物殺滅的效果的相關(guān)性，因此，人們常將它作為評價標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)性，因此，人們常將它作為評價標(biāo)準(zhǔn) 精確測定熱分布和熱穿透狀況，用于計算不同滅菌程序精確測定熱分布和熱穿透狀況，用于計算不同滅菌程序的滅菌效果的滅菌效果 測量數(shù)據(jù)便于統(tǒng)計學(xué)分析測量數(shù)據(jù)便于統(tǒng)計學(xué)分析59 物理確認(rèn)的合格標(biāo)準(zhǔn)物理確認(rèn)的合格標(biāo)準(zhǔn)(示例示例)如下：如下： 用熱穿透探頭測

44、得超過設(shè)定溫度的最短及最長時間用熱穿透探頭測得超過設(shè)定溫度的最短及最長時間 F0的下限及上限；滅菌階段結(jié)束時的最低的下限及上限；滅菌階段結(jié)束時的最低F0值值 滅菌階段的最低和最高壓力滅菌階段的最低和最高壓力 飽和蒸汽溫度和壓力之間的關(guān)系飽和蒸汽溫度和壓力之間的關(guān)系 滅菌階段腔室的最低和最高溫度滅菌階段腔室的最低和最高溫度 熱穿透溫度探頭之間的最大溫差或熱穿透溫度探頭之間的最大溫差或F0的變化范圍的變化范圍 熱分布試驗中溫度探頭間的最大溫差熱分布試驗中溫度探頭間的最大溫差 最長平衡時間；最少正常運行的探頭數(shù)最長平衡時間；最少正常運行的探頭數(shù)60 生物確認(rèn)合格標(biāo)準(zhǔn)（示例）：生物確認(rèn)合格標(biāo)準(zhǔn)（示例）

45、： 微生物挑戰(zhàn)試驗中，孢子的對數(shù)下降值符合預(yù)期微生物挑戰(zhàn)試驗中，孢子的對數(shù)下降值符合預(yù)期標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn) 規(guī)定的陽性和陰性對照符合設(shè)定要求規(guī)定的陽性和陰性對照符合設(shè)定要求 應(yīng)在滅菌程序性能確認(rèn)中進(jìn)行必要的論證，證明應(yīng)在滅菌程序性能確認(rèn)中進(jìn)行必要的論證，證明FPHY和和FBIO間大體上一致（基本一致：間大體上一致（基本一致：F生物生物可能可能小些，小些，F(xiàn)物理物理可能大些）可能大些） 61 選擇與滅菌條件（工藝、對象及程序）相適應(yīng)的生選擇與滅菌條件（工藝、對象及程序）相適應(yīng)的生物指示劑，最常用的是（物指示劑，最常用的是（ B. stearothermophilus ATCC 7953，D121= 1.5

46、-2.0分，接種量分，接種量10E5 10E6個孢子）個孢子） 生物指示劑與溫度探頭并列在同一部位生物指示劑與溫度探頭并列在同一部位(10-20支支) 按規(guī)定條件培養(yǎng)生物指示劑，如按規(guī)定條件培養(yǎng)生物指示劑，如嗜熱脂肪芽孢桿菌嗜熱脂肪芽孢桿菌的培養(yǎng)溫度為的培養(yǎng)溫度為 55-60，培養(yǎng)，培養(yǎng) 7天，每天檢查。天，每天檢查。 對生物指示劑用培養(yǎng)基進(jìn)行促菌生長檢查對生物指示劑用培養(yǎng)基進(jìn)行促菌生長檢查 進(jìn)行陽性對照試驗進(jìn)行陽性對照試驗 所有經(jīng)挑戰(zhàn)試驗的樣品均呈陰性所有經(jīng)挑戰(zhàn)試驗的樣品均呈陰性62 殘存概率的滅菌工藝中，產(chǎn)品的污染水平及其耐熱性是殘存概率的滅菌工藝中，產(chǎn)品的污染水平及其耐熱性是滅菌終點的決

47、定性因素。滅菌終點的決定性因素。應(yīng)將防止產(chǎn)品被耐熱菌污染應(yīng)將防止產(chǎn)品被耐熱菌污染放在首位，而不是依賴最終滅菌去消除污染。放在首位，而不是依賴最終滅菌去消除污染。 選擇與滅菌條件（工藝、對象及程序）相適應(yīng)的選擇與滅菌條件（工藝、對象及程序）相適應(yīng)的BI 生物指示劑的耐熱性生物指示劑的耐熱性 不得低于孢子在相應(yīng)產(chǎn)品中的耐熱性不得低于孢子在相應(yīng)產(chǎn)品中的耐熱性 不得低于產(chǎn)品中污染菌的耐熱性不得低于產(chǎn)品中污染菌的耐熱性 用于每次挑戰(zhàn)試驗的所有用于每次挑戰(zhàn)試驗的所有BI批號必須相同批號必須相同. BI接種量的計算：接種量的計算：Fo = D121. ( lgN0 - lgNt ) 上式中，上式中，F(xiàn)o、D

48、121、 lgNt（藥典標(biāo)準(zhǔn)）均已知，只需計算（藥典標(biāo)準(zhǔn)）均已知，只需計算N063為了對液體裝載進(jìn)行為了對液體裝載進(jìn)行BI確認(rèn)，在密封的、灌封液體確認(rèn)，在密封的、灌封液體的容器和密封件上要接種適當(dāng)?shù)牡娜萜骱兔芊饧弦臃N適當(dāng)?shù)腂I。液體介質(zhì)可用。液體介質(zhì)可用產(chǎn)品或適當(dāng)?shù)拇闷?。產(chǎn)品或適當(dāng)?shù)拇闷?。如果液體產(chǎn)品含有防腐劑或其他抗生素成分，如果液體產(chǎn)品含有防腐劑或其他抗生素成分， ，可能有必要用液體替代品作為懸浮劑。使用何種產(chǎn)可能有必要用液體替代品作為懸浮劑。使用何種產(chǎn)品作為懸浮劑需要有試驗數(shù)據(jù)的支持，證明它們不品作為懸浮劑需要有試驗數(shù)據(jù)的支持，證明它們不抑制微生物的生長。抑制微生物的生長。BI通

49、常被隨機地或以幾何模式放置在整個裝載區(qū)的通常被隨機地或以幾何模式放置在整個裝載區(qū)的容器中，包括開發(fā)階段確定的冷點位置。熱穿透試容器中，包括開發(fā)階段確定的冷點位置。熱穿透試驗探頭應(yīng)放置在接種的容器或其旁側(cè)，以監(jiān)測滅菌驗探頭應(yīng)放置在接種的容器或其旁側(cè)，以監(jiān)測滅菌程序的熱輸入情況。程序的熱輸入情況。64多孔多孔/堅硬裝載生物指示劑確認(rèn)中所用的生物指示劑堅硬裝載生物指示劑確認(rèn)中所用的生物指示劑主要由市場購得，它們可以放置在紙上、不銹鋼、鋁主要由市場購得，它們可以放置在紙上、不銹鋼、鋁或其他基質(zhì)上。另一種可選的方式，是將孢子接種在或其他基質(zhì)上。另一種可選的方式，是將孢子接種在設(shè)計的試樣上。密封在安瓿中的

50、生物指示劑可能并不設(shè)計的試樣上。密封在安瓿中的生物指示劑可能并不能反映多孔能反映多孔/堅硬裝載的實際情況。堅硬裝載的實際情況。將將BI挑戰(zhàn)系統(tǒng)放置在物品加熱最慢的部位挑戰(zhàn)系統(tǒng)放置在物品加熱最慢的部位-最難滅菌最難滅菌的部位。例如，這些部位可能存在于筒式過濾器的褶的部位。例如，這些部位可能存在于筒式過濾器的褶皺中，或者在長軟管的中部（那里可能夾帶空氣），皺中，或者在長軟管的中部（那里可能夾帶空氣），或者在蒸汽難以穿透的橡膠塞與瓶的密封口上?；蛘咴谡羝y以穿透的橡膠塞與瓶的密封口上。65BI無出廠證或證書不符合要求無出廠證或證書不符合要求供貨商不提供每個單元中的供貨商不提供每個單元中的BI數(shù)量數(shù)量

51、無耐熱性數(shù)據(jù)無耐熱性數(shù)據(jù)BI驗證的實測結(jié)果與理論計算相差太大驗證的實測結(jié)果與理論計算相差太大市售市售BI的耐熱性高，產(chǎn)品不能經(jīng)受過度殺滅，的耐熱性高，產(chǎn)品不能經(jīng)受過度殺滅，企業(yè)不知道如何接種初始菌量企業(yè)不知道如何接種初始菌量許多人不知如何計算，如何評估許多人不知如何計算，如何評估66PDA TR No1 2007提出以下公式：提出以下公式： LgNF= LgN0-F(T,Z)/DT，即，即 LgN0=LgNFF/D（見第（見第52頁幻燈片中的等式頁幻燈片中的等式1）F滅菌程序設(shè)計期望獲得的殺滅力/滅菌時間D挑戰(zhàn)試驗中BI的耐熱性N0 挑戰(zhàn)菌的起始濃度（接種量）NF滅菌程序結(jié)束后，挑戰(zhàn)菌的存活數(shù)

52、量。為了方便計算，如果將挑戰(zhàn)菌全部殺滅，可以認(rèn)為存活數(shù)小于1，在此等式中，可取NF為10E0表示。67孢子在標(biāo)準(zhǔn)溶液中的耐熱性孢子在標(biāo)準(zhǔn)溶液中的耐熱性 孢子在產(chǎn)品溶液中的耐孢子在產(chǎn)品溶液中的耐熱性熱性孢子的耐熱性在標(biāo)準(zhǔn)溶液中比較穩(wěn)定孢子的耐熱性在標(biāo)準(zhǔn)溶液中比較穩(wěn)定有孢子在標(biāo)準(zhǔn)溶液中的耐熱性資料有孢子在標(biāo)準(zhǔn)溶液中的耐熱性資料標(biāo)準(zhǔn)溶液更方便于制備和檢測標(biāo)準(zhǔn)溶液更方便于制備和檢測適用于替代滅菌程序相近的不同產(chǎn)品的滅菌工藝驗證適用于替代滅菌程序相近的不同產(chǎn)品的滅菌工藝驗證生物指示劑的生物指示劑的D值測定方法（另文）值測定方法（另文）686970物理、化學(xué)條件、物理、化學(xué)條件、環(huán)境因素、濕度，如：環(huán)境因

53、素、濕度，如： 孢子所處的介質(zhì)、測試溫度、內(nèi)包裝材料孢子所處的介質(zhì)、測試溫度、內(nèi)包裝材料 滅菌時間（由加熱和冷卻滯后所致的影響）滅菌時間（由加熱和冷卻滯后所致的影響） 加熱和培養(yǎng)計數(shù)之間的溫度、時間和環(huán)境條件加熱和培養(yǎng)計數(shù)之間的溫度、時間和環(huán)境條件 用來培養(yǎng)計數(shù)滅菌后孢子的培養(yǎng)基等用來培養(yǎng)計數(shù)滅菌后孢子的培養(yǎng)基等芽孢是否處于被包裹狀態(tài)，此狀態(tài)會使其耐熱性大大芽孢是否處于被包裹狀態(tài)，此狀態(tài)會使其耐熱性大大增強增強微生物的耐熱性（或統(tǒng)稱對滅菌劑的耐受性）微生物的耐熱性（或統(tǒng)稱對滅菌劑的耐受性）71影響微生物的耐熱性因素還包括：影響微生物的耐熱性因素還包括： 在氯化鈉或氯化鉀存在條件下，在氯化鈉或氯

54、化鉀存在條件下，G.嗜熱脂肪桿菌的耐嗜熱脂肪桿菌的耐熱性會增強；熱性會增強； 在二價鈣離子和鎂離子存在時，在二價鈣離子和鎂離子存在時，B.凝結(jié)芽孢桿菌的耐凝結(jié)芽孢桿菌的耐熱性也會增強；熱性也會增強； 在鉀離子存在的情況下，在鉀離子存在的情況下，C.梭狀芽孢梭菌的耐熱性會梭狀芽孢梭菌的耐熱性會增強增強 鰲合劑的存在（如檸檬酸）也會影響耐熱性，強鰲合鰲合劑的存在（如檸檬酸）也會影響耐熱性，強鰲合劑可以競爭性作用周圍的離子，使包衣式芽孢的耐熱劑可以競爭性作用周圍的離子，使包衣式芽孢的耐熱性產(chǎn)生變化。性產(chǎn)生變化。 在接種的載體上（例如紙或橡膠），也可觀察到相似在接種的載體上（例如紙或橡膠），也可觀察到

55、相似的耐熱性差異。的耐熱性差異。DT值的確定方法值的確定方法 Direct Enumeration Method 直接計數(shù)法直接計數(shù)法 又稱又稱 Survival Curve Method 殘存曲線法殘存曲線法 Fraction Negative Method 陰性分?jǐn)?shù)法陰性分?jǐn)?shù)法 - Spearman-Karber Method 史丕曼史丕曼- 卡伯法卡伯法 - Stumbo, Murphy, and Cochran Method D值測定儀器值測定儀器Biological IndicatorEvaluator Resistometer (簡稱簡稱BIER/Vessel)油浴裝置油浴裝置 用

56、于殘存曲線法用于殘存曲線法 D值測定儀器的典型溫度曲線值測定儀器的典型溫度曲線Figure 11. Typical temperature curve for a BIER vesselTime (minutes)Temperature, 0C1351301251201151101051009590.5 1 1.51210C溫溫度度時間時間(分鐘分鐘)殘存曲線法測定殘存曲線法測定D值值 儀器及材料儀器及材料 油?。ㄟm宜的溫度范圍，精度，容量）油?。ㄟm宜的溫度范圍，精度，容量） 毛細(xì)管與支架毛細(xì)管與支架 試驗用芽孢懸浮液準(zhǔn)備試驗用芽孢懸浮液準(zhǔn)備 工作懸浮液占試驗懸浮液比例不超過工作懸浮液占試驗懸浮液比例不超過10% 每每0.05ml試驗懸浮液中中的芽孢為試驗懸浮液中中的芽孢為106 - 108 確定試驗參數(shù)確定試驗參數(shù) 數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析 線性回歸和相關(guān)系數(shù)要求線性回歸和相關(guān)系數(shù)要求 Y = mX + b，m=(YX - XY)/(XX-X2) = mX/Y實測數(shù)據(jù)實測數(shù)據(jù)121.10.5 oC下梭狀芽孢桿菌孢子下梭狀芽孢桿菌孢子在在PBS中的存活數(shù)量中的存活數(shù)量時間 (min)存活數(shù)量(CFU)對數(shù)值01.02.03.04.05.01.7105 3.1104 5.0103 1.3103 4.0102 4.0101 5.24 4.49 3.70 3.11 2.6 1.60 D值計