植物遺傳轉(zhuǎn)化方法和技術(shù)

1、植物遺傳轉(zhuǎn)化方法和技術(shù) 植物基因工程是近植物基因工程是近2020年來(lái)隨著年來(lái)隨著DNADNA重組技術(shù)、植物重組技術(shù)、植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)及植物組織培養(yǎng)技術(shù)而發(fā)展起來(lái)的現(xiàn)代生遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)及植物組織培養(yǎng)技術(shù)而發(fā)展起來(lái)的現(xiàn)代生物技術(shù)。物技術(shù)。 通過(guò)植物基因工程獲得轉(zhuǎn)基因植物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)通過(guò)植物基因工程獲得轉(zhuǎn)基因植物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展及植物分子生物學(xué)研究中有十分重要的意義。目前，展及植物分子生物學(xué)研究中有十分重要的意義。目前，已獲得很多有重大經(jīng)濟(jì)價(jià)值的轉(zhuǎn)基因植物。已獲得很多有重大經(jīng)濟(jì)價(jià)值的轉(zhuǎn)基因植物。目的基因的獲取基因載體的選擇與構(gòu)建目的基因與載體的拼接重組子導(dǎo)入受體分子外源基因的表達(dá)和產(chǎn)物的分離重組子的

2、檢測(cè)本節(jié)主要內(nèi)容根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法基因槍介導(dǎo)法其它轉(zhuǎn)化方法第一節(jié)第一節(jié) 植物遺傳轉(zhuǎn)化方法植物遺傳轉(zhuǎn)化方法常用的植物轉(zhuǎn)基因方法：常用的植物轉(zhuǎn)基因方法：l到目前為止到目前為止, , 已確立了已確立了1111種植物轉(zhuǎn)基因方法。根據(jù)其轉(zhuǎn)種植物轉(zhuǎn)基因方法。根據(jù)其轉(zhuǎn)化原理，可分為三大類(lèi)，即利用載體的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，不用化原理，可分為三大類(lèi)，即利用載體的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，不用任何載體，采用物理、化學(xué)方法直接將外源基因?qū)胧苋魏屋d體，采用物理、化學(xué)方法直接將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞的直接轉(zhuǎn)化系統(tǒng)以及利用植物生殖細(xì)胞等種質(zhì)媒體細(xì)胞的直接轉(zhuǎn)化系統(tǒng)以及利用植物生殖細(xì)胞等種質(zhì)媒介的種質(zhì)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。介的種質(zhì)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。l現(xiàn)將這三大類(lèi)系統(tǒng)的載體

3、、轉(zhuǎn)化原理、轉(zhuǎn)化方法和受體現(xiàn)將這三大類(lèi)系統(tǒng)的載體、轉(zhuǎn)化原理、轉(zhuǎn)化方法和受體細(xì)胞等歸納如圖細(xì)胞等歸納如圖4-14-1。一、根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法l根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的分子機(jī)制l農(nóng)桿菌介導(dǎo)法需要具備的條件l農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的基本流程1 1、植物冠癭瘤、植物冠癭瘤植物的一種癌癥植物的一種癌癥（1）冠癭瘤的起因：）冠癭瘤的起因： 由根癌農(nóng)桿菌對(duì)植物的侵染而引起。由根癌農(nóng)桿菌對(duì)植物的侵染而引起。（2）冠癭瘤的侵染過(guò)程：）冠癭瘤的侵染過(guò)程： 細(xì)菌通過(guò)傷口進(jìn)入植物，在基因水平上轉(zhuǎn)化植細(xì)菌通過(guò)傷口進(jìn)入植物，在基因水平上轉(zhuǎn)化植物。細(xì)菌物。細(xì)菌DNA中的編碼基因在植物細(xì)胞中表達(dá)，中的編碼基因在植物細(xì)胞中表達(dá)，刺激植物細(xì)胞不受

4、控制的分裂，形成瘤。刺激植物細(xì)胞不受控制的分裂，形成瘤。（一）根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的分子機(jī)制（一）根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的分子機(jī)制2 2、TiTi質(zhì)粒質(zhì)粒 根瘤農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質(zhì)，為共價(jià)閉根瘤農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質(zhì)，為共價(jià)閉合環(huán)狀的合環(huán)狀的DNADNA分子。分子。l為農(nóng)桿菌提供附著于植物細(xì)胞壁的能力；為農(nóng)桿菌提供附著于植物細(xì)胞壁的能力；l參與寄主細(xì)胞合成激素的能力；參與寄主細(xì)胞合成激素的能力；l誘發(fā)植物產(chǎn)生冠癭瘤；誘發(fā)植物產(chǎn)生冠癭瘤；l賦予寄主分解冠癭堿的能力；賦予寄主分解冠癭堿的能力；l決定寄主范圍。決定寄主范圍。 （1 1）TiTi質(zhì)粒的功能質(zhì)粒的功能（2）Ti質(zhì)粒的功能區(qū)域 T-DNA區(qū)區(qū)

5、 Vir 區(qū)區(qū) Con 區(qū)區(qū) Ori 區(qū)區(qū)200 kb T-DNA區(qū)（區(qū)（transferred-DNA regions）：）： 核心區(qū)核心區(qū)左邊界左邊界右邊界右邊界 T-DNA T-DNA是農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí)，從是農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí)，從TiTi質(zhì)粒上切割下質(zhì)粒上切割下來(lái)轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的一段來(lái)轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的一段DNADNA，故稱之為轉(zhuǎn)移，故稱之為轉(zhuǎn)移DNADNA。 該該DNADNA片段上的基因與腫瘤的形成有關(guān)。片段上的基因與腫瘤的形成有關(guān)。lVirVir區(qū)是一段長(zhǎng)度為區(qū)是一段長(zhǎng)度為35KB35KB操縱子；操縱子；l包含六個(gè)基因：包含六個(gè)基因：VirAVirA、VirBVirB、VirCV

6、irC、VirDVirD、VirEVirE、VirGVirG。l該區(qū)段上的基因能激活該區(qū)段上的基因能激活T-DNAT-DNA轉(zhuǎn)移，使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性，轉(zhuǎn)移，使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性，故稱之為毒性區(qū)。故稱之為毒性區(qū)。lT-DNAT-DNA區(qū)與區(qū)與VirVir區(qū)在質(zhì)粒區(qū)在質(zhì)粒DNADNA上彼此相鄰，上彼此相鄰， 合起來(lái)約占合起來(lái)約占TiTi質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的三分之一的三分之一。 Vir區(qū)操縱子基因的結(jié)構(gòu)與功能區(qū)操縱子基因的結(jié)構(gòu)與功能LBRBT-DNAVir Con區(qū)（區(qū)（regions encoding conjugations） 該區(qū)段上存在著與細(xì)菌接合轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因（該區(qū)段上存在著與細(xì)菌接合轉(zhuǎn)移

7、的有關(guān)基因（tra），調(diào)控），調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移。冠癭堿能激活質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移。冠癭堿能激活tra基因，誘導(dǎo)基因，誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移，因此稱之為接合轉(zhuǎn)移編碼區(qū)。移，因此稱之為接合轉(zhuǎn)移編碼區(qū)。 Ori區(qū)（區(qū)（origin of replication） 該區(qū)段基因調(diào)控該區(qū)段基因調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制，故稱之為復(fù)制起質(zhì)粒的自我復(fù)制，故稱之為復(fù)制起始區(qū)。始區(qū)。定向轉(zhuǎn)移到寄主植物細(xì)胞內(nèi)定向轉(zhuǎn)移到寄主植物細(xì)胞內(nèi)T-DNAT-DNA鏈整合植物基因組鏈整合植物基因組受傷植物產(chǎn)生酚類(lèi)物質(zhì)，誘導(dǎo)受傷植物產(chǎn)生酚類(lèi)物質(zhì)，誘導(dǎo)VirVir基因的表達(dá)基因的表達(dá)編碼編碼 核酸內(nèi)切酶核酸內(nèi)切酶依次在依

8、次在RBRB、LBLB序列中產(chǎn)生缺口序列中產(chǎn)生缺口單鏈單鏈T-DNAT-DNA被釋放被釋放3、T-DNA轉(zhuǎn)移的機(jī)制轉(zhuǎn)移的機(jī)制植物細(xì)胞酶體系合成雙鏈合成雙鏈T-DNAT-DNA鏈分子鏈分子VirE2蛋白的核定位作用4、植物遺傳轉(zhuǎn)化的載體系統(tǒng)、植物遺傳轉(zhuǎn)化的載體系統(tǒng)一元載體（順勢(shì)載體）一元載體（順勢(shì)載體）雙元載體（反式載體）雙元載體（反式載體） Ti Ti質(zhì)粒分子量過(guò)大，一般在質(zhì)粒分子量過(guò)大，一般在160160240kb240kb； 分布各種限制酶的多個(gè)切點(diǎn)；分布各種限制酶的多個(gè)切點(diǎn)； T-DNA T-DNA區(qū)內(nèi)含有許多編碼基因，干擾宿主植物中內(nèi)源激素區(qū)內(nèi)含有許多編碼基因，干擾宿主植物中內(nèi)源激素的

9、平衡，轉(zhuǎn)化細(xì)胞長(zhǎng)成腫瘤，阻礙細(xì)胞的分化和植株的再的平衡，轉(zhuǎn)化細(xì)胞長(zhǎng)成腫瘤，阻礙細(xì)胞的分化和植株的再生；生； Ti Ti質(zhì)粒不能在大腸桿菌中復(fù)制質(zhì)粒不能在大腸桿菌中復(fù)制, , 即使得到重組質(zhì)粒，也只能即使得到重組質(zhì)粒，也只能在農(nóng)桿菌中進(jìn)行擴(kuò)增；在農(nóng)桿菌中進(jìn)行擴(kuò)增； Ti Ti質(zhì)粒上還存在一些對(duì)于質(zhì)粒上還存在一些對(duì)于T-DNAT-DNA轉(zhuǎn)移不起任何作用的基因。轉(zhuǎn)移不起任何作用的基因。 野生型野生型TiTi質(zhì)粒不能直接作為植物基因工程載體：質(zhì)粒不能直接作為植物基因工程載體：5、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的構(gòu)建、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的構(gòu)建P G2 T NOSAmpAmpr r P G1 T目的基因目的基因報(bào)

10、告基因，選擇標(biāo)記基因報(bào)告基因，選擇標(biāo)記基因目的基因目的基因報(bào)告基因，選擇標(biāo)記基因報(bào)告基因，選擇標(biāo)記基因LBRB啟動(dòng)子的選擇35S, cauliflower mosaic virus 35S promoter CaMV 35S is a strong promoter that is active in essentially all dicot plant tissues. （二）農(nóng)桿菌介導(dǎo)法需要具備的條件（二）農(nóng)桿菌介導(dǎo)法需要具備的條件l高效的植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)高效的植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)l受體植物細(xì)胞對(duì)農(nóng)桿菌要有很高的親和力。受體植物細(xì)胞對(duì)農(nóng)桿菌要有很高的親和力。l具有有效的選擇系統(tǒng)。具有

11、有效的選擇系統(tǒng)。l穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化技術(shù)和基因表達(dá)。穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化技術(shù)和基因表達(dá)。1、高效的植物基因轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)、高效的植物基因轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)成功的基因轉(zhuǎn)化首先依賴于良好的植物受體系統(tǒng)的建成功的基因轉(zhuǎn)化首先依賴于良好的植物受體系統(tǒng)的建立。立。受體系統(tǒng)：用于轉(zhuǎn)化的外植體通過(guò)組織培養(yǎng)途徑或其它受體系統(tǒng)：用于轉(zhuǎn)化的外植體通過(guò)組織培養(yǎng)途徑或其它非組織培養(yǎng)途徑（如發(fā)苗產(chǎn)生子葉、胚軸等），能高效、非組織培養(yǎng)途徑（如發(fā)苗產(chǎn)生子葉、胚軸等），能高效、穩(wěn)定地再生無(wú)性系，并能接受外源穩(wěn)定地再生無(wú)性系，并能接受外源DNADNA整合，對(duì)轉(zhuǎn)化選整合，對(duì)轉(zhuǎn)化選擇抗生素敏感的再生系統(tǒng)。擇抗生素敏感的再生系統(tǒng)。A. 植物基因轉(zhuǎn)化受體系

12、統(tǒng)的條件植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的條件（1 1）高效穩(wěn)定的再生能力）高效穩(wěn)定的再生能力（2 2）較高的遺傳穩(wěn)定性）較高的遺傳穩(wěn)定性（3 3）具有穩(wěn)定的外植體來(lái)源）具有穩(wěn)定的外植體來(lái)源（4 4）對(duì)選擇性抗生素敏感）對(duì)選擇性抗生素敏感（5 5）對(duì)農(nóng)桿菌侵染有敏感性）對(duì)農(nóng)桿菌侵染有敏感性（6 6）具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值或理論研究意義。）具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值或理論研究意義。B. 植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的類(lèi)型植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的類(lèi)型1.1.愈傷組織再生系統(tǒng)愈傷組織再生系統(tǒng)外植體材料經(jīng)過(guò)脫分化培養(yǎng)誘導(dǎo)形成愈傷組織，轉(zhuǎn)化（含目的基因質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染），分化培養(yǎng)獲得再生植株。優(yōu)點(diǎn)：外植體來(lái)源廣，繁殖快，易接受外源基因， 轉(zhuǎn)化效率高

13、。缺點(diǎn)：遺傳穩(wěn)定性差、嵌合體 因此需要連續(xù)的再生系統(tǒng)2.直接分化再生系統(tǒng) 外植體材料細(xì)胞不經(jīng)過(guò)脫分化形成愈傷組織階段，而是直接分化出不定芽形成再生植株。優(yōu)點(diǎn)：周期短、操作簡(jiǎn)單，體細(xì)胞變異小，遺傳穩(wěn)定；缺點(diǎn)：材料局限，轉(zhuǎn)化率低。3.原生質(zhì)體再生系統(tǒng) 原生質(zhì)體恢復(fù)細(xì)胞壁具有分化再生能力，是應(yīng)用最早的再生受體系統(tǒng)之一。優(yōu)點(diǎn)：高效、廣泛地?cái)z取外源DNA或遺傳物質(zhì)，獲得基因型一致的克隆細(xì)胞，所獲轉(zhuǎn)基因植株嵌合體少，適用于多種轉(zhuǎn)化系統(tǒng)；缺點(diǎn)：不易制備、再生困難和變異程度高。4.胚狀體再生系統(tǒng)是指具有胚胎性質(zhì)的個(gè)體。優(yōu)點(diǎn)：個(gè)體數(shù)目巨大、同質(zhì)性好，接受外源基因能力強(qiáng)， 嵌合體少，易于培養(yǎng)、再生。缺點(diǎn)：技術(shù)含量

14、高，多數(shù)植物不易獲得胚狀體。5.生殖細(xì)胞受體系統(tǒng) 以生殖細(xì)胞如花粉粒、卵細(xì)胞等受體細(xì)胞進(jìn)行外源基因轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)。 一是利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行小孢子和卵細(xì)胞的單倍體培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)； 二是直接利用花粉和卵細(xì)胞受精過(guò)程進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化，如花粉管導(dǎo)入法，花粉粒浸泡法，子房微針注射法等。2、選擇系統(tǒng)、選擇系統(tǒng)l選擇是為了將轉(zhuǎn)化細(xì)胞與非轉(zhuǎn)化細(xì)胞區(qū)分開(kāi)，使轉(zhuǎn)化選擇是為了將轉(zhuǎn)化細(xì)胞與非轉(zhuǎn)化細(xì)胞區(qū)分開(kāi)，使轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。在構(gòu)建載體時(shí)，往往在目的基因細(xì)胞具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。在構(gòu)建載體時(shí)，往往在目的基因上連上一個(gè)選擇標(biāo)記基因。上連上一個(gè)選擇標(biāo)記基因。l主要是編碼可使抗生素或除草劑失活的蛋白酶基因。主要是編碼可使抗生素或

15、除草劑失活的蛋白酶基因。l最常用的有：新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因最常用的有：新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因( NPT( NPT) )、新霉素抗、新霉素抗性基因（性基因（neoneo）、慶大霉素抗性基因（）、慶大霉素抗性基因（gentgent）、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)）、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（移酶基因（hpthpt）, ,以及膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（以及膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（barbar）等。）等。l新霉素抗性基因是從大腸桿菌轉(zhuǎn)座子新霉素抗性基因是從大腸桿菌轉(zhuǎn)座子Tn5Tn5中分離的，其對(duì)應(yīng)中分離的，其對(duì)應(yīng)失活的選擇試劑為卡那霉素、新霉素和失活的選擇試劑為卡那霉素、新霉素和G418G418。l對(duì)茄科植物（煙草、馬鈴薯、

16、番茄）轉(zhuǎn)化特別有效，對(duì)茄科植物（煙草、馬鈴薯、番茄）轉(zhuǎn)化特別有效，對(duì)豆科和單子葉植物效果不佳。對(duì)豆科和單子葉植物效果不佳。A、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（Npt-II）B、慶大霉素抗性基因（、慶大霉素抗性基因（gent）l該基因編碼一種乙酰轉(zhuǎn)移酶，屬抗生素標(biāo)記基因，它該基因編碼一種乙酰轉(zhuǎn)移酶，屬抗生素標(biāo)記基因，它通過(guò)對(duì)慶大霉素的乙酰化而使其失活。通過(guò)對(duì)慶大霉素的乙酰化而使其失活。l該選擇系統(tǒng)目前也有一定的應(yīng)用，例如矮牛、煙草該選擇系統(tǒng)目前也有一定的應(yīng)用，例如矮牛、煙草和番茄。和番茄。 潮霉素是一種很強(qiáng)的細(xì)胞抑制劑，對(duì)許多植物都有很強(qiáng)的毒潮霉素是一種很強(qiáng)的細(xì)胞抑制劑，對(duì)許多植物

17、都有很強(qiáng)的毒性。潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶可通過(guò)對(duì)潮霉素磷酸化而使其失活。性。潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶可通過(guò)對(duì)潮霉素磷酸化而使其失活。C、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（hpt）D、膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（、膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（bar）l該基因是從吸水鏈霉菌中克隆的一種基因，其對(duì)應(yīng)的該基因是從吸水鏈霉菌中克隆的一種基因，其對(duì)應(yīng)的選擇試劑為膦絲菌素（選擇試劑為膦絲菌素（bastabasta），膦絲菌素可抑制谷），膦絲菌素可抑制谷氨酰胺合成酶的活性，從而導(dǎo)致非轉(zhuǎn)化細(xì)胞發(fā)生氨的氨酰胺合成酶的活性，從而導(dǎo)致非轉(zhuǎn)化細(xì)胞發(fā)生氨的致死性累積。致死性累積。（三）農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的基本流程（三）農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的基本流

18、程大豆子葉節(jié)法為例：l大豆子葉節(jié)器官發(fā)生系統(tǒng)的優(yōu)化大豆子葉節(jié)器官發(fā)生系統(tǒng)的優(yōu)化l大豆農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的優(yōu)化大豆農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的優(yōu)化l大豆無(wú)菌苗的獲得大豆無(wú)菌苗的獲得l外植體的制備（類(lèi)型、生理狀態(tài)）外植體的制備（類(lèi)型、生理狀態(tài)）l高分化率基因型的選擇高分化率基因型的選擇l叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的確定叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的確定l叢生芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基的確定叢生芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基的確定l生根培養(yǎng)基的確定生根培養(yǎng)基的確定l移栽移栽大豆子葉節(jié)器官發(fā)生系統(tǒng)的優(yōu)化大豆子葉節(jié)器官發(fā)生系統(tǒng)的優(yōu)化l選擇壓的確定選擇壓的確定l農(nóng)桿菌侵染液的制備農(nóng)桿菌侵染液的制備l外植體苗齡外植體苗齡l預(yù)培養(yǎng)（時(shí)間）預(yù)培養(yǎng)（時(shí)間）l農(nóng)桿菌的侵染（濃度、時(shí)間

19、）農(nóng)桿菌的侵染（濃度、時(shí)間）l共培養(yǎng)（時(shí)間）共培養(yǎng)（時(shí)間）l選擇培養(yǎng)選擇培養(yǎng)l抗性芽的伸長(zhǎng)抗性芽的伸長(zhǎng)l生根培養(yǎng)生根培養(yǎng)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的優(yōu)化農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的優(yōu)化F1. 共培養(yǎng)2. 在選擇培養(yǎng)基上篩選3. 篩選獲得的抗性愈傷 5. 胚萌發(fā)成苗6. 轉(zhuǎn)基因植株移栽大田4. 抗性愈傷分化成胚狀體棉花(a) Embryogenic calli generated from the scutella of mature seeds. Arrowheads show actively growing calli appropriate for Agrobacterium inoculation. (b)

20、Inoculation of calli with A. tumefaciens. (c) Proliferation of hygromycin-resistant calli on N6D-S medium 3 weeks after transfer. Left calli are resistant to hygromycin and right calli are sensitive. (d) Shoot regeneration from calli resistant to hygromycin on MS-NK medium 3 weeks after transfer. (e

21、) Rooting and growth of transgenic rice plants.二、基因槍法（微彈轟擊法）二、基因槍法（微彈轟擊法）1 1、工作原理：將外源、工作原理：將外源DNADNA包被在微小的金?；虬辉谖⑿〉慕鹆；蜴u粒表面，然后在高壓的作用下將微粒高速射鎢粒表面，然后在高壓的作用下將微粒高速射入受體細(xì)胞或組織，微粒上的外源入受體細(xì)胞或組織，微粒上的外源DNADNA進(jìn)入細(xì)進(jìn)入細(xì)胞后，整合到植物染色體上并得到表達(dá)，從而胞后，整合到植物染色體上并得到表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)化。實(shí)現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)化。 步驟簡(jiǎn)單易行：適合于大多數(shù)細(xì)胞或組織，克服了受體材料步驟簡(jiǎn)單易行：適合于大多數(shù)

22、細(xì)胞或組織，克服了受體材料的限制，不必制備原生質(zhì)體，具有相當(dāng)廣泛的應(yīng)用范圍，的限制，不必制備原生質(zhì)體，具有相當(dāng)廣泛的應(yīng)用范圍，已經(jīng)成為植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化最有效方法之一。已經(jīng)成為植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化最有效方法之一。到目前為止，利用基因槍法已經(jīng)在煙草、豆類(lèi)和多數(shù)到目前為止，利用基因槍法已經(jīng)在煙草、豆類(lèi)和多數(shù)禾本科農(nóng)作物、果樹(shù)花卉和林木等植物上獲得轉(zhuǎn)基禾本科農(nóng)作物、果樹(shù)花卉和林木等植物上獲得轉(zhuǎn)基因植株。因植株。2、操作步驟：、操作步驟：（1 1）制備）制備DNADNA微彈；微彈； （2 2）準(zhǔn)備靶外植體材料；）準(zhǔn)備靶外植體材料； （3 3）DNADNA微彈轟擊；微彈轟擊；（4 4）培養(yǎng)轟擊后的外植體）培養(yǎng)轟擊后的

23、外植體immature embryos high osmotic media prepare calli3、轉(zhuǎn)化率影響因素：、轉(zhuǎn)化率影響因素：l金屬微粒：金粉顆粒較鎢粒性質(zhì)優(yōu)良金屬微粒：金粉顆粒較鎢粒性質(zhì)優(yōu)良, ,但是價(jià)格昂貴但是價(jià)格昂貴. .lDNADNA沉淀輔助劑：這些化合物對(duì)沉淀輔助劑：這些化合物對(duì)DNADNA在微粒上的黏附有重要在微粒上的黏附有重要作用作用, ,但對(duì)植物受體細(xì)胞也產(chǎn)生一定的傷害但對(duì)植物受體細(xì)胞也產(chǎn)生一定的傷害. .lDNADNA純度及濃度純度及濃度 l微彈速度微彈速度l植物材料內(nèi)在因素植物材料內(nèi)在因素 基因槍法的優(yōu)點(diǎn)：基因槍法的優(yōu)點(diǎn)：l無(wú)宿主限制；無(wú)宿主限制；l靶受體類(lèi)型廣泛；靶受體類(lèi)型廣泛；l可控度高；可控度高；l操作簡(jiǎn)便。操作簡(jiǎn)便。問(wèn)題：?jiǎn)栴}：l轉(zhuǎn)化效率低；轉(zhuǎn)化效率低；l嵌合體多；嵌合體多；l穩(wěn)定性差，瞬時(shí)表達(dá)；穩(wěn)定性差，瞬時(shí)表達(dá)；l外源基因沉默；外源基因沉默；1.整合機(jī)理不詳。整合機(jī)理不詳。4、基因槍轉(zhuǎn)化法的特點(diǎn)：、基因槍轉(zhuǎn)化法的特點(diǎn)：花粉管通道法花粉管通道法 l在授粉后向子房注射合目的基因的DNA溶液，利用植物在開(kāi)花、受精過(guò)程中形成的花粉管通道，將外源DNA