過瘤胃體外模型的測定方法

1、過瘤胃體外模型的測定方法一、體外-人工模擬消化液法1，人工唾液配方(MeDougall，1948)-用來模擬動(dòng)物口腔，測定過瘤胃前的釋放率注：MgSO4（MgC12）準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量1.0g(精確至0.0001g)樣品放入250ml碘量瓶內(nèi)，每個(gè)樣做三個(gè)重復(fù)，加入200ml人工唾液，溶于少量蒸餾水中定容至1000ml)，蓋緊膠塞，在39的恒溫水浴鍋內(nèi)分別消化0、6和12小時(shí)(消化過程中每隔1小時(shí)振動(dòng)1次)，測定溶液中產(chǎn)品的含量，從而求得過瘤胃產(chǎn)品的釋放率。（先將除CaCl2以外的物質(zhì)充分溶解，再將CaCl2溶解后倒入前者溶液中。使用前向其中通入二氧化碳，使其pH在8.2左右。并在39的水中溫浴

2、30分鐘。） McDougall E I. Studies on ruminant saliva, 1. The composition and output of sheeps saliva. Bilchemical Journal, 1948, 43: 99- 109.2，人工模擬瘤胃液、真胃和十二指腸消化液準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量(精確至0.0001g)過瘤胃產(chǎn)品，放入50mL具塞試管底部，加入20mL人工模擬消化液(pH為6.6、5.4和2.4的緩沖溶液，分別模擬動(dòng)物瘤胃、真胃和十二指腸消化道近端的消化液)，蓋緊試管塞，在39的恒溫水浴搖床內(nèi)消化0、12、24、48小時(shí)，取出后沖洗、過濾，濾液

3、定容，測定濾液中產(chǎn)品的含量。計(jì)算公式:產(chǎn)品瘤胃釋放率(W1)=A2/Al x 100%式中:Al-產(chǎn)品中有效成分的含量；A2-產(chǎn)品在pH 6.6緩沖溶液濾液中有效成分的含量。產(chǎn)品小腸釋放率(W2)=A3/A1 x 100%式中:A3-產(chǎn)品在pH 2.4緩沖溶液濾液中有效成分的含量。產(chǎn)品有效釋放率（%）=(l-W1) x W2x100%。 Papas A M,Sniffen C J,Muscato T V. Effectiveness of rumen protected methionine for delivering methionine postruminally in dairy co

4、ws J. J Dairy Sci, 1984a, 67: 545552.附：人工腸液的制備磷酸氫二鉀胰蛋白酶胰脂肪酶胰淀粉酶氫氧化鈉6.8g0.25g9.375g83.3mg調(diào)pH注：先將磷酸氫二鉀加500ml水溶解，加入胰蛋白酶、胰脂肪酶和胰淀粉酶等，再定容至1000ml，用0.1M氫氧化鈉調(diào)至適宜pH（）；二、體外-瘤胃液培養(yǎng)法1，瘤胃液的采集晨飼（6：00）后2小時(shí)，由瘤胃內(nèi)采集足量瘤胃液灌入經(jīng)預(yù)熱達(dá)到39并通有CO2的保溫瓶中灌滿后，立即蓋嚴(yán)瓶口迅速返回實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)4層紗布過濾后，持續(xù)充入CO2氣體5分鐘。然后，迅速分裝至上述已預(yù)熱好并通有CO2的培養(yǎng)瓶內(nèi)，每個(gè)培養(yǎng)瓶加20ml瘤胃液，

5、蓋緊瓶塞放入39水浴搖床培養(yǎng)。2，瘤胃培養(yǎng)底物的制備培養(yǎng)底物組成：淀粉3g，氯化銨0.1729g，無水硫酸鈉0.0269g，以上試劑為分析純。3，瘤胃緩沖液的制備體外批次培養(yǎng)的培養(yǎng)體系為60mL，其中瘤胃液與緩沖液的比例為1：2，培養(yǎng)底物的添加量為0.5g。采取McDougall緩沖液。每10LGIF緩沖液含（g）：98g NaHCO3，93g Na2HPO3，4.7g NaC1，1.2g MgSO47H2O，5.7g KCI，0.4g CaC12H2O。4，測定方法稱取膽堿樣品lg左右，放入已經(jīng)加入瘤胃液和培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中(250ml)，搖動(dòng)混合，向溶液充CO2，使溶液和試管內(nèi)空間全部充滿C

6、O2，然后蓋上帶有放氣閥門的橡皮塞，將其置于水浴搖床培養(yǎng)(39)，設(shè)置好搖床頻率，分別于2、4、8、16、24h，每個(gè)樣品取出6個(gè)瓶子，傾去上清液，剩余物用自來水沖洗三次，至水澄清，除三個(gè)樣品用于下一階段的試驗(yàn)，其余三個(gè)樣品65烘干至恒重(48h)，移至干燥器內(nèi)15min后稱重，進(jìn)行剩余物中膽堿含量，從而測定瘤胃降解率。三、半體內(nèi)法-尼龍袋法1，尼龍袋的制作選擇孔徑為35-50m(250目-400目)的尼龍布，裁剪成15cm x 11cm的長方塊，對折，用滌綸線進(jìn)行雙道縫合，制成長x寬為7cm x10cm的尼龍袋。邊緣用烙鐵熨燙，使其無散邊，密封，用油性筆標(biāo)號(hào)，再用自來水沖洗，浸泡50分鐘，然

7、后低溫烘干至恒重，備用。十二指腸尼龍袋：選擇孔徑為3550m尼龍布，裁成7 x 6cm的長方形，對折，然后用尼龍線或滌綸線縫雙道，制成6 x 2.5cm尼龍袋。2，實(shí)驗(yàn)方法選用永久性瘺管反芻動(dòng)物，分別測定不同包被產(chǎn)品在3，6，9，12，24h時(shí)間點(diǎn)的降解率。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。預(yù)飼期14天，試驗(yàn)期4天，每一試驗(yàn)期結(jié)束后轉(zhuǎn)入下一期的預(yù)飼期。3，尼龍袋消化試驗(yàn)及樣品的采集制備將尼龍袋用清水洗凈，于65烘箱中烘48h，放入干燥器中冷卻稱重、標(biāo)號(hào)。于每一尼龍袋中準(zhǔn)確稱取包被產(chǎn)品，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，每3個(gè)平行袋固定在一條小鐵鏈上，按一次投入、在不同時(shí)間點(diǎn)取出的原則將尼龍袋分別進(jìn)行0，3，6，9，12，

8、24h瘤胃培養(yǎng)。將尼龍袋從瘤胃中取出，用自來水沖洗，將尼龍袋表面的瘤胃內(nèi)容物及殘?jiān)鼪_洗，停止微生物活動(dòng)，直至沖洗干凈，沖洗過程不能用手?jǐn)D壓袋內(nèi)樣品，以免增大消失率。將尼龍袋放入65）恒溫真空干燥箱內(nèi)烘干至恒重，然后將烘干恒重的尼龍袋殘余物磨碎，-20保存待測。具體操作程序參考rskov等（1980）的方法。 Rskov E R, DeB Hovell FD, Mould F .The use of the nylon bag technique for the evaluation of feedstuffs J.Animal Production, 1980, 5(3):195-213.四、

9、體外-小腸液凍干粉1，小腸液凍干粉（GIF）的制備牛/羊屠宰后立即收集全小腸食糜(十二指腸-回腸末端)，立即放在-50冷庫中速凍，回到試驗(yàn)室后經(jīng)冷水解凍，用雙層紗布過濾后，于4，4000r/min離心約15min，用吸管吸去上層浮油，將上清液倒入表面皿中，置于FTS凍干機(jī)凍干，然后將凍干粉迅速分裝于可封口塑料袋內(nèi)，-20保存。2，McDougall緩沖液的配制每10LGIF緩沖液含（g）：98g NaHCO3，93g Na2HPO3，4.7g NaC1，1.2g MgSO47H2O，5.7g KCI，0.4g CaC12H2O，用0.2M鹽酸調(diào)至pH 7.0。3，胰蛋白酶活性和淀粉酶的檢測胰蛋

10、白酶和淀粉酶的活性測定參照南京建成生物試劑盒說明書的測定方法進(jìn)行。4，操作方法a.過瘤胃產(chǎn)品非降解殘?jiān)闹苽浞Q取一定質(zhì)量1.0 g(精確至0.0001g)過瘤胃膽堿于尼龍袋內(nèi)，飼喂后12h，將尼龍袋投入到裝有永久性瘤胃屢管牛/羊的瘤胃內(nèi)，每只放4個(gè)尼龍袋，待飼料在瘤胃內(nèi)培養(yǎng)16h取出，在-20保存?zhèn)溆?。b.測定方法取出上述樣品，解凍，沖洗干凈，分別放入50mL三角瓶中，加入提前預(yù)熱至39含o.4gGIF(與試驗(yàn)得出，McDougall緩沖液中GIF的用量為0.4g/30mL)的緩沖液30mL，放入39恒溫水浴搖床內(nèi)中速振蕩16h，取出沖洗，65烘干，然后測定殘?jiān)新然憠A的含量。（16 h 為

11、人工瘤胃體外培養(yǎng)最佳時(shí)間也是精料在瘤胃內(nèi)的滯留時(shí)間）5，計(jì)算公式瘤胃釋放率W1(%)=(A1-A2)/A1xl00%小腸消化率W2(%)=A3xl00%。過瘤胃有效釋放率(%)=(l-W1)xW2x100%。式：Al一袋中氯化膽堿起始質(zhì)量；A2一袋中殘?jiān)新然憠A.的質(zhì)量；A3一產(chǎn)品在小腸凍干粉緩沖液中的氯化膽堿釋放率。五、體內(nèi)-真胃和小腸釋放率-移動(dòng)尼龍袋法將1.0g過瘤胃氯化膽堿樣品裝入十二指腸尼龍袋（6 cm x 2.5 cm）中，放入39、pH為2的0.2%的HCl-胃蛋白酶溶液(6 ml鹽酸用蒸餾水稀釋至1000ml，加熱到39后加入胃蛋白酶2g，混合均勻)中2.5 h，然后放入十二指腸瘺管內(nèi)，從糞中回收，沖洗，然后放入40烘箱內(nèi)，烘至恒重，備測。 Rossi F, Maurizio M, Francesco M, et al. Rum