凡納濱對蝦中優(yōu)勢腐敗細(xì)菌的分離鑒定及抑菌劑的篩選

1、凡納濱對蝦中優(yōu)勢腐敗細(xì)菌的分離鑒定及抑菌劑的篩選凡納濱灼蝦制呂工藝采用沸鹽水煮制的為式對河蝦進行處理”環(huán)蝦中的大部対微生物在熟制過程中會死亡世一些耐熱性微生物不能被徹底殺滅1在適宜條件下'殘朗的耐熱產(chǎn)會迅遠(yuǎn)主K,造成刑蝦軟礪頭昂質(zhì)的劣變編短保質(zhì)期°對對蝦優(yōu)勢腐敗珊葫的分隈鑒saw茵劑的箔選為保證對抒制品的安全性和延K保質(zhì)期整定了碁51L材料1LL1試驗原料凡細(xì)濱對蝦取自汕頭市溢海達下養(yǎng)殖l2CJd的半海水蝦，選取輔活、芫整、規(guī)略一致的個恠試劑ft3-試驗試刑Riblc3-1Experimentredeems試別、皓養(yǎng)基名稱生產(chǎn)廠家WJSfi天潭市化學(xué)試劑三廠木牌北京廉昔匯維科

2、技梧阻處可阿拉怕精天津韋化學(xué)試劑三廠甘輻醇上海挾冬實業(yè)旬限公刁過氧化氫浙江金料詛敦化需臉份有限公刊結(jié)晶紫上海扶生實業(yè)有限公司融粉C生化試ffll）北京臾悌星生韌茲術(shù)相眼責(zé)任如司売廉踮（靈呂吸）脫>>%北京臣泰克生物技術(shù)有艱處司乳酸厲球蒔素（倉品級）北爪百泰克牛物我術(shù)有眼皆巨潘曲誨（模品吸）北京百泰克生翔枝術(shù)有垠公耳多聚彌氨酸（靈品級北京百泰克生物技術(shù)有艱址司營養(yǎng)肉透t薛基北京竇博星生物技術(shù)有瑯義任公司營齊瓊脂培養(yǎng)呈北京奚博星生物技術(shù)有垠責(zé)任公司LB瓊脂培養(yǎng)基北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司精類發(fā)酵試驗培養(yǎng)基北京奧博星生物技術(shù)有瑯責(zé)任公司淀粉水健試驗培養(yǎng)基北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司

3、檸樣醴鹽利用試驗培養(yǎng)杲北京奧傅星生物技術(shù)有理責(zé)任公S儀器與設(shè)備表32試驗儀器與設(shè)備Iabkj3-2Experimentinstrumentandequipments儀器設(shè)備生產(chǎn)廠家祐密電子天平梅特勒特利多有艱公司LD2X-3O1G園立式葛壓滅菌鍋上海申安醫(yī)疔盞仙通用燮超淨(jìng)工作臺海爾特種電器有限公司DHG-9140A型電熱也溫鼓風(fēng)干燥箱上海一恒科學(xué)儀話有限公司DZKW-D2型電熱恒溫水浴鍋北京市永光明醫(yī)療儀器廠LRH-25OF型恒溫培養(yǎng)箱上海-恒科學(xué)儀器自限公司4（）-10S型均質(zhì)機上海東華高壓均質(zhì)機廠ZHWY-2102C型搖床上海智城分松儀器制造有限公瓦數(shù)顯游標(biāo)E尺常州市華昊機電有限公司牛津杯

4、直徑（7.76mm）上海陸斯清空儀器有限公旬方法凡納濱對蝦中優(yōu)勢腐敗細(xì)菌的分離純化選取10只新鮮、完整的對蝦個體于沸水中袁制3min后，育空封裝2VT放至變色，有異味，放入200mL滅菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，30弋條件下培養(yǎng)至肉湯明顯混濁，取ImL至ICT?至IO-X,取100pL.各稀釋度的楮釋菌液涂布千営養(yǎng)瓊脂平板，30。（：培養(yǎng)48h,挑取優(yōu)勢菌落，于莒養(yǎng)瓊脂平板劃線分離，30弋培養(yǎng)48h,挑取單菌落保存于營養(yǎng)瓊脂斜面。優(yōu)勢菌定義為：在最高稀釋度上，菌落數(shù)占總菌落數(shù)的比咧為10%以.上的菌稱之為優(yōu)勢菌每個樣品中最多的菌落數(shù)達不到10%的，取菌落故最多的前兩種作為該樣品的優(yōu)勢菌卻。形態(tài)觀察對

5、篩選純化的優(yōu)勢菌落的頗色、形狀、邊緣，表面、隍起形狀、透明度、菌落質(zhì)地等螢落形態(tài)箱征進行後痙"同時選取單匿落進行革蘭氏染色，芽泡染色，觀密細(xì)菌的個體形態(tài)、排列方式，以及芽抱的大小、形狀和看生位SS,76生理生化特性鑒定根據(jù)常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊"和伯杰細(xì)菌鑒定手冊E第八版，對篩選出的優(yōu)勢細(xì)菌逬行檸檬酸註利用試驗、耐鹽性試驗、接觸輛試驗、糖類發(fā)嶂試驗、運動性試驗、甲基紅試驗、V-P«驗和淀籾水解試驗。抑菌劑的篩選分別選取殼聚糖、乳酸鈕球菌素（Nisin1溶菌琵做為抑菌劑，依據(jù)GB2760-2011倉品添加劑衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)印中規(guī)定的熟制水產(chǎn)品的使用限量，選擇抑菌劑的濃度見表I

6、o以3I21中分離純化的兩株優(yōu)勢腐敗細(xì)菌作為試驗菌，將抑菌液用0.22pm細(xì)菌謔器過濾，采用牛津杯平板擴散法I®,在苣養(yǎng)諒脂中混入0.2ml濃度為10%仙ml的菌懸液,取抑菌劑200pl加入牛津杯中，每個試驗組設(shè)三個平行，30°C,培養(yǎng)20h,測冥抑菌圏直徑，計算平均值。抑菌裁試驗評判標(biāo)準(zhǔn)如下：抑區(qū)直徑20mm為極敏感十+十”；15mmW抑茵直徑20mm為高敏"10mmS抑菌直徑VI5mm為中敏"*；7.8mmW抑菌直徑VOmm為低敏“+"；抑菌直徑W7.8nun為無效“吧表3-3抑菌劑的濃度Iablc33TIkconcaitrationgra

7、dientofbacterialinhibitor抑菌劑濃度（mg/lOOml）芫聚第051.05.010.015.()Nism203.04.05.06.0溶苗筋02030.40.50.63.2結(jié)果與分析321凡納濱対蝦優(yōu)勢腐敗細(xì)菌的鑒走纟日菌園落特征從對蝦中分離到兩株優(yōu)勢腐敗細(xì)菌,其茵落形態(tài)兀表34所示。茨3-4茵落形態(tài)特征Table3-4Colonialmorpliologjcluuaclerislicsofstrainsisolatedfromslimnp種形狀邊壕表面隆起形狀1乳白色圓形干燥扁平不透審軟2淡黃色圓形整齊灌濕、粘稠凸起不透朿軟321.2細(xì)菌個體形態(tài)從對蝦中分離純化得到2株

8、優(yōu)勢腐敗細(xì)菌.】號為革蘭氏陽性桿茄.單個、成對或錢狀徘列,芽泡楠過形，位于苗體中央；2號為革蘭氏陽性球菌,單個或成堆排列不生芽忍321.3生埋生化特性鑒定結(jié)果如表3所示，根處常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手田和伯杰細(xì)菌鑒定手冊，1號屈于芽泡桿菌科蘋蘭氏陽性芽袍桿菌畐（Hucltus）（不能碑定到種），2號屬干蘋蘭氏陽性海球菌屬白色海球菌（kfarinococcus表35生理生化鑒定結(jié)果TableM5Idontifkationofbacteriabasedontheofphysiologicalandbiochemicalexperiments菌種菌種試臉1號2號試驗1號2號檸樟腹鹽利月4-4-4-接MB+7

9、%NaCl+運動性+IO%MC1f甲蔓紅+直萄稅產(chǎn)酸+-V-P+木精產(chǎn)韻+4淀粉水解+L-問拉伯精產(chǎn)酸十!%NaCI+廿蟲醇產(chǎn)酸+注:r表示陽性廠表示陰性。抑菌劑的篩選由表36可知.芽抱桿菌屬対濃度為05mglOOrnL的殼聚糠敏感對濃度分別為1.0、5.0和】0.0mgOOOmL的堯疑糖表現(xiàn)為中敏，對濃度為15.0mg/lOOmL的殼聚糖表現(xiàn)為高敏；白色海球菌對濃度為05、1A5JX10.0100mL的殼聚椅表現(xiàn)為中敏，對濃度為15.0mg/lOOmL的殼聚糖表現(xiàn)為高敏；2株菌的抑菌妥直徑隨著殼聚席濃度的培大而増強.不同濃度的Nisin和溶苗臨對芽砲桿菌畐和白色海球苗無抑菌作用。最終礎(chǔ)定殼聚

10、惦作為凡納濱對蝦的抑蒂劑使用濃度為ISOms/lOOmL,走34抑菌試強結(jié)果lablc34)Antunicrobialactnihofagainstbacterioisolatedfromshrunp抑菌劑rRS(ing/!(M>n)L)芽泡桿葡屬白色海環(huán)葡抑菌圉直徑(mm)相對抑菌圈宜徑(mm)相對戰(zhàn)感度0.59.911.3*1.0101*11.6殼聚宙5.010.3寺124十10.()12.44-4-13.44-4-15.015.8+15.3+2.05.55.230545Nisin4.05.85.25.06.166.066.20.2560.35.26.20.45.95.80.5535.70.6545.63.3討論有關(guān)無艮韜的抑菌機理的推測主要是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)側(cè)質(zhì)的正常代謝活動受殼聚折的帶電,性質(zhì)的干尤，出提供酸性水溶性條件時，殼聚韜會形成NH“，陽離子吸附細(xì)苗表面帶負(fù)電的個體，使之賢集沉淀，阻礙菌體的正常代謝剛，另外由于正負(fù)電荷相互作用，改變細(xì)胞膜通透性，使胞內(nèi)的蛋白誨以及其他成分泄露，從而引起細(xì)菌的死亡廠呵，本研究結(jié)果表茅水溶性殼聚糖對凡納潦對蝦中分離得到的兩株革蘭氏陽性優(yōu)勢腐敗細(xì)菌（芽抱桿菌屬和白色海琢葩）有抑茵作用，并且抑菌效果較好，此結(jié)果與徐麗敏Ml等水溶性殼聚糧對于南美白對蝦的腐敗菌芽泡桿菌（脅加）抑菌率只有40%的結(jié)果有所不同。殼聚精對芽泡和菌屬