實(shí)驗(yàn)十二谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性檢測

1、 血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的測定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的測定二、基本原理二、基本原理 血清中的谷血清中的谷-丙轉(zhuǎn)氨酶（丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT），在），在37、pH7.4的條的條件下，可催化基質(zhì)（底物）液中的丙氨酸與件下，可催化基質(zhì)（底物）液中的丙氨酸與-酮戊二酮戊二酸反應(yīng)生成谷氨酸和丙酮酸：酸反應(yīng)生成谷氨酸和丙酮酸： 生成的丙酮酸可與起終止和顯色作用的生成的丙酮酸可與起終止和顯色作用的2,4二硝基苯肼發(fā)生加成二硝基苯肼發(fā)生加成反應(yīng)，生成丙酮酸反應(yīng)，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，進(jìn)而在堿性環(huán)境中生成紅二硝基苯腙，進(jìn)而在堿性環(huán)境中生成紅棕色的苯腙硝醌化合物，棕色的苯腙硝醌化合物，其顏色的深淺在一定范圍內(nèi)與丙酮酸

2、其顏色的深淺在一定范圍內(nèi)與丙酮酸的生成量，亦即與的生成量，亦即與ALT活性的高低成正比關(guān)系活性的高低成正比關(guān)系。據(jù)此與同樣處。據(jù)此與同樣處理的丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液相比較，便可算出或通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查出血清理的丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液相比較，便可算出或通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查出血清中中ALT的活性。的活性。* 儀器1. 515cm試管、刻度吸量管。2. 恒溫水浴、離心機(jī)、721型分光光度計(jì)。* 試劑1.0.1mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液0.1mol/L磷酸氫二鈉溶液：稱取Na2HPO414.22g或Na2HPO42H2O17.8g溶 解于蒸餾水中，并稀釋至1 000ml,4保存。0.1mol/L磷酸二氫鉀溶液：稱KH2PO

3、413.61g溶解dH2O中，稀釋至1000ml, 4保存。將0.1mol/L磷酸氫二鈉溶液420ml和0.1mol/L磷酸二氫鉀溶液80ml混和即 為0.1mol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液。加氯仿數(shù)滴，4保存。三、儀器與試劑三、儀器與試劑 2. 標(biāo)準(zhǔn)丙酮酸（含丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)丙酮酸（含丙酮酸2.0mol/mL） 取標(biāo)準(zhǔn)丙酮酸鈉取標(biāo)準(zhǔn)丙酮酸鈉10mg，用上述緩沖液準(zhǔn)確定容為，用上述緩沖液準(zhǔn)確定容為50mL。此液須當(dāng)日用當(dāng)。此液須當(dāng)日用當(dāng)日配。日配。3. ALT底物液底物液(含含-酮戊二酸酮戊二酸2mol/ml及及DL-丙氨酸丙氨酸200mol/ml) 取取-酮戊酮戊二酸二酸29.2mg，DL-丙

4、氨酸丙氨酸7g ,用試劑用試劑1溶成溶成100ml，在稀釋到刻度前，以，在稀釋到刻度前，以1mol /L NaOH調(diào)調(diào)pH至至7.4（因?yàn)檗D(zhuǎn)氨酶在（因?yàn)檗D(zhuǎn)氨酶在pH7.3以下或以下或7.6以上的環(huán)境中酶以上的環(huán)境中酶活性下降），加數(shù)滴氯仿防腐。此液于冰箱保存可使用活性下降），加數(shù)滴氯仿防腐。此液于冰箱保存可使用4天。天。4. 2.4二硝基苯肼溶液二硝基苯肼溶液 取分析純?nèi)》治黾?,4二硝基苯肼二硝基苯肼19.8mg，用，用1mol /L HCl溶于溶于100ml，置棕色瓶中保，置棕色瓶中保存。存。5. 0.4mol/L NaOH溶液溶液 常規(guī)配制。常規(guī)配制。1、血清樣品制備、血清樣品制備 取雞

5、血取雞血100mL于于4oC靜置靜置10hr，后經(jīng)離心分離得到血清，后經(jīng)離心分離得到血清， 保存于冰箱中待用保存于冰箱中待用(由于血細(xì)胞中轉(zhuǎn)氨酶活性較血清中由于血細(xì)胞中轉(zhuǎn)氨酶活性較血清中 高，故應(yīng)防止溶血；若血清中此酶活性過高，則可適高，故應(yīng)防止溶血；若血清中此酶活性過高，則可適 當(dāng)稀釋后再用當(dāng)稀釋后再用) 。2、標(biāo)準(zhǔn)曲線制作、標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 取取6 6支干燥潔凈的試管，按下表操作，得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果。支干燥潔凈的試管，按下表操作，得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 以吸光度值為縱坐標(biāo)，酶活力單位數(shù)為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)以吸光度值為縱坐標(biāo)，酶活力單位數(shù)為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo) 紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。四、實(shí)驗(yàn)操作四、實(shí)驗(yàn)操

6、作 3、血清樣品谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的測定、血清樣品谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的測定 取取4 4支干燥潔凈試管，按下表操作（血清和底物溶液支干燥潔凈試管，按下表操作（血清和底物溶液 事先保溫事先保溫10min10min）：）：五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1、將得出的吸光值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得酶活性、將得出的吸光值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得酶活性2、計(jì)算：、計(jì)算： 丙酮酸物質(zhì)的量（丙酮酸物質(zhì)的量（mol） SGPT活性單位活性單位/100mL= 1000 時(shí)間（時(shí)間（min）1. 1. 在測定在測定SGPTSGPT時(shí)，應(yīng)事先將底物、血清在時(shí)，應(yīng)事先將底物、血清在3737水浴中水浴中 保溫，然后在血清管中加入底物，準(zhǔn)確記時(shí)。保溫，

7、然后在血清管中加入底物，準(zhǔn)確記時(shí)。2. 2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線上數(shù)值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上數(shù)值在20500U20500U是準(zhǔn)確可靠的，超過是準(zhǔn)確可靠的，超過 500U500U時(shí)，需將樣品稀釋。時(shí)，需將樣品稀釋。3. 3. 轉(zhuǎn)氨酶只能作用于轉(zhuǎn)氨酶只能作用于L L氨基酸，對氨基酸，對D D氨基酸無氨基酸無 作用。實(shí)驗(yàn)室多用作用。實(shí)驗(yàn)室多用DLDL氨基酸（較氨基酸（較L L氨基酸氨基酸 價(jià)廉），若用價(jià)廉），若用L L氨基酸，則用量減半。氨基酸，則用量減半。4. 4. 溶血標(biāo)本不宜使用，因血細(xì)胞中轉(zhuǎn)氨酶活力較高，溶血標(biāo)本不宜使用，因血細(xì)胞中轉(zhuǎn)氨酶活力較高， 會影響測定效果。會影響測定效果。5. 5. 血清樣品的測定需在

8、顯色后血清樣品的測定需在顯色后3030分鐘內(nèi)完成。分鐘內(nèi)完成。六、注意事項(xiàng)六、注意事項(xiàng) 6.丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度要求十分精確。由于丙酮酸開封丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度要求十分精確。由于丙酮酸開封后易變質(zhì)為多聚丙酮酸，而影響丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液的有效濃后易變質(zhì)為多聚丙酮酸，而影響丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液的有效濃度而不易察覺。建議使用質(zhì)量可靠的市售丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液。度而不易察覺。建議使用質(zhì)量可靠的市售丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液。7.每批試劑的空白管吸光度上下波動不應(yīng)超過每批試劑的空白管吸光度上下波動不應(yīng)超過0.015A，若有超出，應(yīng)仔細(xì)檢查試劑與儀器方面的問題。，若有超出，應(yīng)仔細(xì)檢查試劑與儀器方面的問題。8.嚴(yán)重脂血、黃疸、溶血和糖尿病酮癥酸中

9、毒病人血清嚴(yán)重脂血、黃疸、溶血和糖尿病酮癥酸中毒病人血清標(biāo)本可增加測定的吸光度，測定這類標(biāo)本應(yīng)做血清標(biāo)本標(biāo)本可增加測定的吸光度，測定這類標(biāo)本應(yīng)做血清標(biāo)本對照管對照管9. 9. 操作中加操作中加 0.4N NaOH0.4N NaOH液時(shí)，需以較慢速度加入，液時(shí)，需以較慢速度加入，并且邊加邊搖勻加快時(shí)則并且邊加邊搖勻加快時(shí)則a a一戊酮二酸引起的發(fā)色一戊酮二酸引起的發(fā)色增強(qiáng)。增強(qiáng)。10. 10. 本實(shí)驗(yàn)中各試劑加量都需要準(zhǔn)確，并且要注本實(shí)驗(yàn)中各試劑加量都需要準(zhǔn)確，并且要注意控制條件，保溫時(shí)間要嚴(yán)格意控制條件，保溫時(shí)間要嚴(yán)格. .11.11.本法測定本法測定SGTPSGTP正常值為正常值為4040單

10、位以下。單位以下。* 1個(gè)卡門氏單位的定義是：在溫度個(gè)卡門氏單位的定義是：在溫度25，pH7.4，波長，波長340nm，光徑，光徑1cm 的條件下，的條件下，1ml血清使血清使NADH的吸光度下降的吸光度下降0.001的轉(zhuǎn)氨酶活性。的轉(zhuǎn)氨酶活性。* * 國際單位：在最適溫度（國際單位：在最適溫度（2525）下，）下，1 1分鐘產(chǎn)生分鐘產(chǎn)生1 1mol丙酮酸的酶量為丙酮酸的酶量為1個(gè)活性單位，即個(gè)活性單位，即1IU=1umol/min。* King法單位定義是：每法單位定義是：每1ml血清在血清在37條件下與底物作用條件下與底物作用60 min，生，生 成成1mol丙酮酸稱為一個(gè)單位。丙酮酸稱為

11、一個(gè)單位。 * Mohun 法單位定義是：每毫升血清在法單位定義是：每毫升血清在pH=7.4，37條件下與底物作條件下與底物作用用 30 min，每生成，每生成2.5微克丙酮酸為微克丙酮酸為1單位。單位。七、酶活性單位的定義七、酶活性單位的定義 六、臨床意義六、臨床意義 化驗(yàn)介紹化驗(yàn)介紹: : 正常時(shí)，谷丙轉(zhuǎn)氨酶主要存在于組織細(xì)胞內(nèi)，以肝細(xì)胞含正常時(shí)，谷丙轉(zhuǎn)氨酶主要存在于組織細(xì)胞內(nèi)，以肝細(xì)胞含量最多，心肌細(xì)胞中含量其次，只有極少量釋放血中。所以量最多，心肌細(xì)胞中含量其次，只有極少量釋放血中。所以血清中此酶活力很低。血清中此酶活力很低。當(dāng)肝臟、心肌病變、細(xì)胞壞死或通透性增加時(shí)，細(xì)胞內(nèi)各種當(dāng)肝臟、

12、心肌病變、細(xì)胞壞死或通透性增加時(shí)，細(xì)胞內(nèi)各種酶釋放出來，使血清中此酶活性升高。所以測定血清中此酶酶釋放出來，使血清中此酶活性升高。所以測定血清中此酶的含量可作為診斷、鑒別診斷及預(yù)后觀察的依據(jù)。的含量可作為診斷、鑒別診斷及預(yù)后觀察的依據(jù)。 臨床意義臨床意義: : 谷丙轉(zhuǎn)氨酶的增高意義較大，其增高程度可反谷丙轉(zhuǎn)氨酶的增高意義較大，其增高程度可反映肝細(xì)胞損害和壞死的程度。映肝細(xì)胞損害和壞死的程度。（1 1）肝膽疾?。海└文懠膊。杭毙圆《拘愿窝?，急性病毒性肝炎，ALTALT是最為敏感的指標(biāo)之一，會出現(xiàn)明顯是最為敏感的指標(biāo)之一，會出現(xiàn)明顯升高。慢性肝炎血清升高。慢性肝炎血清ALTALT升高一般不超過參考

13、值的升高一般不超過參考值的3 3倍，而倍，而且有時(shí)可降至正常。慢性活動性肝炎血清且有時(shí)可降至正常。慢性活動性肝炎血清ALTALT可升高至參考可升高至參考值的值的3 35 5倍以上?；顒有瓦M(jìn)行性肝硬化時(shí)倍以上?；顒有瓦M(jìn)行性肝硬化時(shí)ALTALT可中輕度升高可中輕度升高，但在代償期可正?；蛏栽龈??；荚l(fā)性肝癌時(shí)，但在代償期可正?；蛏栽龈摺；荚l(fā)性肝癌時(shí)，ALTALT可正可正?；蛑休p度升高。膽道疾病如膽石癥引起梗阻時(shí)，雖無肝常或中輕度升高。膽道疾病如膽石癥引起梗阻時(shí)，雖無肝細(xì)胞病變，但細(xì)胞病變，但ALTALT可稍升高?？缮陨摺?（2 2）其他疾?。海┢渌膊。盒募」Ｈ靶墓δ懿蝗珜?dǎo)致肝淤血可使心肌梗塞及心功能不全導(dǎo)致肝淤血可使ALTALT明顯升高。骨骼明顯升高。骨骼疾病、多發(fā)性肌炎、肌營養(yǎng)不良均可使疾病、多發(fā)性肌炎、肌營養(yǎng)不良均可使ALTALT活性升高。某些活性升高。