實(shí)驗(yàn)二 PCR引物設(shè)計(jì)

1、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 PCR 引物設(shè)計(jì)要點(diǎn)引物設(shè)計(jì)要點(diǎn) Primer Premier 軟件設(shè)計(jì)引物軟件設(shè)計(jì)引物ncbi 在線在線 primer-Blast 獲取候選引物獲取候選引物引物對(duì)的特異性驗(yàn)證引物對(duì)的特異性驗(yàn)證PCRPCR反應(yīng)一般由三個(gè)步驟組成反應(yīng)一般由三個(gè)步驟組成： 模板的熱變性模板的熱變性； 引物復(fù)性到單鏈模板上引物復(fù)性到單鏈模板上； 熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定DNADNA聚合酶催化的聚合酶催化的延伸延伸一、引物設(shè)計(jì)要點(diǎn)一、引物設(shè)計(jì)要點(diǎn) GC含量應(yīng)在含量應(yīng)在40%-60%（ 45%-55% ）之間；）之間； 4種堿基在引物中分配均勻；種堿基在引物中分配均勻； 沒有多聚嘌呤或多聚嘧啶序列，如沒有多聚嘌呤或多聚嘧

2、啶序列，如AAAAA等；等； 沒有二核苷酸重復(fù)序列，如沒有二核苷酸重復(fù)序列，如GCGCGC等；等；引物中與模板互補(bǔ)的區(qū)應(yīng)為引物中與模板互補(bǔ)的區(qū)應(yīng)為個(gè)核苷酸長個(gè)核苷酸長度；度；上下引物長度差別不能大于上下引物長度差別不能大于3bp，如上游引物，如上游引物為為19bp，下游引物為，下游引物為24bp等。等。 引物的引物的 Tm 值一般為值一般為50-70； 計(jì)算出來的兩個(gè)引物的計(jì)算出來的兩個(gè)引物的 Tm 值相差不能大于值相差不能大于5 ； 擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增產(chǎn)物的 Tm 值與引物的值與引物的 Tm 值相差不能大于值相差不能大于10 ； 這些特性保證了擴(kuò)增產(chǎn)物在每一個(gè)這些特性保證了擴(kuò)增產(chǎn)物在每一個(gè) PC

3、R 循環(huán)可循環(huán)可有效變性。有效變性。 形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，會(huì)阻止引物和模板之間的復(fù)性。形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，會(huì)阻止引物和模板之間的復(fù)性。 一個(gè)引物的一個(gè)引物的3末端序列不允許結(jié)合到另一個(gè)引物末端序列不允許結(jié)合到另一個(gè)引物的任何位點(diǎn)上，因?yàn)榈娜魏挝稽c(diǎn)上，因?yàn)镻CR中引物濃度較高，會(huì)形中引物濃度較高，會(huì)形成引物二聚體。成引物二聚體。 3末端的性質(zhì)非常關(guān)鍵。末端的性質(zhì)非常關(guān)鍵。 不推薦不推薦3末端有末端有.NNNCG或或.NNNGC序列的序列的引物，引物，GC高自由能促進(jìn)發(fā)夾及引物二聚體產(chǎn)生；高自由能促進(jìn)發(fā)夾及引物二聚體產(chǎn)生； 5端序列添加限制性酶切位點(diǎn)。端序列添加限制性酶切位點(diǎn)。二、二、Primer Premi

4、er 軟件設(shè)計(jì)引物軟件設(shè)計(jì)引物 是由加拿大的是由加拿大的 Premier Premier 公司開發(fā)的專業(yè)用于公司開發(fā)的專業(yè)用于PCRPCR或測(cè)序引物以及雜交探針或測(cè)序引物以及雜交探針的設(shè)計(jì)、評(píng)估的的設(shè)計(jì)、評(píng)估的軟件軟件 主要界面分為序列主要界面分為序列編輯窗口編輯窗口（genetankgenetank）、）、primer designprimer design、酶切分析酶切分析（restriction restriction sitesite）和）和 MotifMotif正向（正向（As isAs is）、反向（）、反向（reversedreversed）、互補(bǔ)（）、互補(bǔ)（complement

5、edcomplemented）及）及反向互補(bǔ)（反向互補(bǔ)（reverse complemented reverse complemented ）。）。Primer點(diǎn)擊點(diǎn)擊 SearchSearch，進(jìn)行引物搜索，進(jìn)行引物搜索Search criteria Search criteria 窗口：多種參數(shù)可以調(diào)整。窗口：多種參數(shù)可以調(diào)整。Primer LengthPrimer Length常設(shè)置在常設(shè)置在181830bp,30bp,短了特異性不好，長了沒有必要。短了特異性不好，長了沒有必要。當(dāng)然有特殊要求的除外，如加個(gè)酶當(dāng)然有特殊要求的除外，如加個(gè)酶切位點(diǎn)什么的。切位點(diǎn)什么的。PCR Product

6、 sizePCR Product size最好是最好是100100500bp500bp之間，小于之間，小于100bp100bp的的PCRPCR產(chǎn)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳出來，條帶很模物瓊脂糖凝膠電泳出來，條帶很模糊，不好看。至于上限倒也不必要糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。求苛刻。ManualManualSearch parameters Search parameters 人工搜索參數(shù)設(shè)置窗口。人工搜索參數(shù)設(shè)置窗口。Search stringencySearch stringency應(yīng)選應(yīng)選HighHigh。GCGC含量一般是含量一般是40406060。其它參數(shù)默認(rèn)就可以。其它參數(shù)默認(rèn)就可以

7、。Search progress Search progress 窗口中顯示窗口中顯示Search CompletedOKSearch CompletedOK鍵鍵結(jié)果窗口結(jié)果窗口有三種顯示形式，上游引物、下游引物和成對(duì)顯示。有三種顯示形式，上游引物、下游引物和成對(duì)顯示。引物按優(yōu)劣次序排列，滿分為引物按優(yōu)劣次序排列，滿分為100100。選其中的一對(duì)引物，在主。選其中的一對(duì)引物，在主窗口顯示結(jié)果。窗口顯示結(jié)果。對(duì)于上述引物，如果其它各項(xiàng)指對(duì)于上述引物，如果其它各項(xiàng)指標(biāo)還可以，可在引物末端去掉一標(biāo)還可以，可在引物末端去掉一個(gè)不滿意的或加上一個(gè)堿基，看個(gè)不滿意的或加上一個(gè)堿基，看看引物的評(píng)估參數(shù)有沒有

8、變好點(diǎn)。看引物的評(píng)估參數(shù)有沒有變好點(diǎn)。當(dāng)然，搜索出的引物，其擴(kuò)增產(chǎn)當(dāng)然，搜索出的引物，其擴(kuò)增產(chǎn)物很短，你可以不選擇它。物很短，你可以不選擇它。引物引物3 3端端22個(gè)個(gè)A A或或T,T,或引物內(nèi)部或引物內(nèi)部連續(xù)的連續(xù)的G G或或C C太多，或引物太多，或引物3 3端端22個(gè)個(gè)G G或或C C，這樣的引物應(yīng)作，這樣的引物應(yīng)作為次選，沒得選了就選它。為次選，沒得選了就選它。該圖分為四部分：最上面是圖示模板及產(chǎn)物位置，該圖分為四部分：最上面是圖示模板及產(chǎn)物位置，“S”“S”和和“A”“A”可查看有義鏈可查看有義鏈或反義鏈的引物。右邊是兩個(gè)引物在模板上結(jié)合位置的直觀圖；第二層是模或反義鏈的引物。右邊是

9、兩個(gè)引物在模板上結(jié)合位置的直觀圖；第二層是模板及引物序列的配對(duì)情況；第三層顯示引物的各種參數(shù)。板及引物序列的配對(duì)情況；第三層顯示引物的各種參數(shù)。注意：尾末給出該注意：尾末給出該引物的最佳退火溫度引物的最佳退火溫度！第四層：四種重要指標(biāo)的分析！第四層：四種重要指標(biāo)的分析Ta：復(fù)性溫度（：復(fù)性溫度（退火溫度退火溫度），至關(guān)重要?。?，至關(guān)重要！退火溫度太高，退火溫度太高，引物不能與模板很好地復(fù)性，引物不能與模板很好地復(fù)性，擴(kuò)增效率會(huì)非常低；擴(kuò)增效率會(huì)非常低；退火溫度太低，退火溫度太低，引物將產(chǎn)生非特異性復(fù)性，從引物將產(chǎn)生非特異性復(fù)性，從而導(dǎo)致非特異性而導(dǎo)致非特異性DNA片段的擴(kuò)增；片段的擴(kuò)增；退火溫

10、度，通常比理論設(shè)計(jì)的引物和模板的退火溫度，通常比理論設(shè)計(jì)的引物和模板的Tm值值低低 3-5 下進(jìn)行。下進(jìn)行。最好通過對(duì)最好通過對(duì)復(fù)性溫度復(fù)性溫度比兩條比兩條引物的引物的Tm 值低值低 2-10 內(nèi)進(jìn)行內(nèi)進(jìn)行PCR預(yù)實(shí)驗(yàn)（梯度）來對(duì)復(fù)性條件的優(yōu)預(yù)實(shí)驗(yàn)（梯度）來對(duì)復(fù)性條件的優(yōu)化化。引物長度：引物長度：控制著引物的特異性和在控制著引物的特異性和在PCR反應(yīng)中的退火反應(yīng)中的退火溫度。長的溫度。長的PCR引物能給擴(kuò)增帶來更好的特異性，可以引物能給擴(kuò)增帶來更好的特異性，可以通過降低退火溫度提高反應(yīng)的靈敏度，不過長引物易形通過降低退火溫度提高反應(yīng)的靈敏度，不過長引物易形成包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)二聚體自身互補(bǔ)等二級(jí)結(jié)構(gòu)

11、。適宜引物成包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)二聚體自身互補(bǔ)等二級(jí)結(jié)構(gòu)。適宜引物長度為長度為18-27 nt。Tm 融鏈溫度融鏈溫度：根據(jù)相：根據(jù)相鄰二堿基對(duì)作用原理來鄰二堿基對(duì)作用原理來計(jì)算融鏈溫度。計(jì)算融鏈溫度。PCR 反應(yīng)的合適反應(yīng)的合適 Tm 范范圍為圍為56-63 （50-70）GC% 含量含量：對(duì)于：對(duì)于PCR 反應(yīng)來說反應(yīng)來說 GC含量在含量在50% 左右比左右比較合適。較合適。（40-60%,45-55%）Degeneracy多義性多義性，盡量減少，盡量減少引物多義性，這樣會(huì)帶來更好引物多義性，這樣會(huì)帶來更好的特異性，盡量避免的特異性，盡量避免3末端末端的多義性，因?yàn)檫@個(gè)位置即使的多義性，因?yàn)檫@個(gè)位

12、置即使一個(gè)堿基的錯(cuò)配都能阻止引物一個(gè)堿基的錯(cuò)配都能阻止引物延伸。延伸。 三、三、ncbi 在線在線 primer-Blast 獲取候選引物獲取候選引物點(diǎn)擊點(diǎn)擊Primer Blast/tools/primer-blast/或者打開或者打開mRNA序列序列后，點(diǎn)擊后，點(diǎn)擊Pick Primer 或者或者mBad基因編碼序列基因編碼序列至于至于RT-PCR所用的引物，最好是所用的引物，最好是使得產(chǎn)物跨過內(nèi)含子，這樣避免潛使得產(chǎn)物跨過內(nèi)含子，這樣避免潛在在DNA對(duì)對(duì)RT-PCR的干擾。的干擾。 選擇物種選擇物種篩選時(shí)，上、下游引物不在同篩選時(shí)，上、

13、下游引物不在同一個(gè)外顯子上的引物對(duì)。一個(gè)外顯子上的引物對(duì)。 四、引物對(duì)的特異性驗(yàn)證：四、引物對(duì)的特異性驗(yàn)證：BLAST 驗(yàn)證驗(yàn)證引物引物如果一對(duì)PCR引物能夠和其他基因或目的基因的其他位置配對(duì)，可能產(chǎn)生非特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物，甚至導(dǎo)致目的基因的擴(kuò)增失敗。通過NCBI上提供的，可檢索到該物種中所有能夠與所設(shè)計(jì)引物互補(bǔ)的序列，包括基因片段和基因組片段。http: //BLAST/點(diǎn)擊點(diǎn)擊Basic BLAST中的中的 nucleotide blast 選項(xiàng)選項(xiàng) 在在Enter Query SequenceEnter Query Sequence欄中輸入引物序列：

14、欄中輸入引物序列： 例：例：mouse Badmouse Bad基因上游引物基因上游引物為為5 5- -GGGCAGCCACCAACAGTCATCAT-3GGGCAGCCACCAACAGTCATCAT-3 為本次搜索命名為本次搜索命名選該物種基因組和轉(zhuǎn)錄物選該物種基因組和轉(zhuǎn)錄物作為搜索的范圍作為搜索的范圍引物長度為引物長度為23nt23nt，每條，每條橫線表明該匹配序列橫線表明該匹配序列在引物上的位置。在引物上的位置。與引物匹配的序列有兩類：轉(zhuǎn)錄物和基因組序列。在與引物匹配的序列有兩類：轉(zhuǎn)錄物和基因組序列。在通過通過RT-PCRRT-PCR時(shí)由于提取時(shí)由于提取RNARNA的時(shí)候基因組的時(shí)候基因

15、組DNADNA可以被完可以被完全去除，基因組全去除，基因組DNADNA上潛在的引物匹配序列不會(huì)對(duì)擴(kuò)上潛在的引物匹配序列不會(huì)對(duì)擴(kuò)增目的基因造成影響，因此只有位于轉(zhuǎn)錄物上的匹配增目的基因造成影響，因此只有位于轉(zhuǎn)錄物上的匹配序列才有可能對(duì)序列才有可能對(duì)PCRPCR產(chǎn)物產(chǎn)生不利影響。產(chǎn)物產(chǎn)生不利影響。 目的基因目的基因 基因基因Tm9sf1Tm9sf1上有上有16nt16nt與引物與引物匹配，但是引物的匹配，但是引物的3 3端有端有3 3個(gè)堿基不能匹配的，因此不個(gè)堿基不能匹配的，因此不會(huì)對(duì)目的基因擴(kuò)增產(chǎn)生影響。會(huì)對(duì)目的基因擴(kuò)增產(chǎn)生影響。如果其他基因序列與上游引物的如果其他基因序列與上游引物的3 3端端

16、有匹配，有匹配，此時(shí)查看與下游引物的此時(shí)查看與下游引物的3 3端的匹配情況，如果不匹配的話，端的匹配情況，如果不匹配的話，不影響目的基因擴(kuò)增結(jié)果。不影響目的基因擴(kuò)增結(jié)果。分析結(jié)果表明，這對(duì)引物雖在分析結(jié)果表明，這對(duì)引物雖在其他基因序列上有不同程度其他基因序列上有不同程度的錯(cuò)配，但是他們對(duì)的錯(cuò)配，但是他們對(duì)mBad mBad 基基因擴(kuò)增不會(huì)產(chǎn)生不利影響，因擴(kuò)增不會(huì)產(chǎn)生不利影響，屬于特異性較好的引物對(duì)。屬于特異性較好的引物對(duì)。 在在Enter Query SequenceEnter Query Sequence欄中輸入引物序列：欄中輸入引物序列： 例：例：引物為引物為5 5-CTGAGATCCTG

17、AGCCTTTGG-3-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3; ; 5 5-TGCCCATCACAACATCATCT-3-TGCCCATCACAACATCATCT-3 同時(shí)輸入上下游引物。輸入上下游引物都從同時(shí)輸入上下游引物。輸入上下游引物都從5 5 3 3。輸入上游引物后，加上輸入上游引物后，加上2020個(gè)字母?jìng)€(gè)字母n n，再輸入下游引物。，再輸入下游引物。 在在Choose Search SetChoose Search Set欄中：欄中：DatabaseDatabase根據(jù)預(yù)操作基根據(jù)預(yù)操作基因的種屬定了，可選因的種屬定了，可選Human genomic + transcript

18、Human genomic + transcript或或OthersOthers 在在Program SelectionProgram Selection中：選擇中：選擇Somewhat similar Somewhat similar sequences (blastn)sequences (blastn)項(xiàng)，如下圖：項(xiàng)，如下圖： 在此界面最下面關(guān)鍵要點(diǎn)擊在此界面最下面關(guān)鍵要點(diǎn)擊Algorithm parametersAlgorithm parameters參參數(shù)設(shè)置，進(jìn)入?yún)?shù)設(shè)置界面。數(shù)設(shè)置，進(jìn)入?yún)?shù)設(shè)置界面。 在在General ParametersGeneral Parameters中：中：Expect thressholdExpect thresshold期望閾值須改為期望閾值須改為10001000，大于，大于10001000也可以；在也可以；在Word sizeWord size的下拉框?qū)?shù)字改為的下拉框?qū)?shù)字改為7 7。 圖中圖中：序列與引物匹配的得分值小于：序列與引物匹配的得分值小于4040分、分、40405050分、分、50-8050-80分、分、80-20080-200分等分等，分值越高，特異性越好；，分值越高，特異性越好；線段代表上或下游線段代表上或