2022《臨床基因擴(kuò)增檢驗試驗室管理暫行辦法》

1、臨床基因擴(kuò)增檢驗試驗室管理暫行辦法 臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室管理暫行辦法 第一章總則 第一條為規(guī)范臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室管理，保證臨床基因擴(kuò)增檢驗質(zhì)量，使臨床診斷和治療更為科學(xué)、合理，特制定本辦法。 第二條臨床基因擴(kuò)增檢驗技術(shù)指以臨床診斷治療為目的，以擴(kuò)增檢測dna或rna為方法的檢測技術(shù)，如聚合酶鏈反應(yīng)（pcr）、連接酶鏈反應(yīng)（lcr）、轉(zhuǎn)錄依賴的放大系統(tǒng)（tas）自主序列復(fù)制系統(tǒng)（3sr）和鏈替代擴(kuò)增（sda）等。 第三條本辦法適用于開展臨床基因擴(kuò)增檢驗的實驗室。臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室設(shè)立在二級以上醫(yī)院。 第四條臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室必須使用經(jīng)國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的臨床檢驗試劑開展臨床基因

2、擴(kuò)增檢驗項目。 第五條衛(wèi)生部臨床檢驗中心（以下簡稱衛(wèi)生部臨檢中心）和省、自治區(qū)、直轄市臨床檢驗中心（以下簡稱省臨檢中心）負(fù)責(zé)對所轄行政區(qū)域內(nèi)臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室的質(zhì)量監(jiān)督管理工作。第二章實驗室設(shè)置和驗收 第六條擬設(shè)置臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室的醫(yī)療機(jī)構(gòu)按照臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室基本設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)（見附件）籌建實驗室；籌建完成后，由法定代表人向衛(wèi)生部臨檢中心提出技術(shù)驗收申請。申請時需提交以下材料： （一）醫(yī)療機(jī)構(gòu)執(zhí)業(yè)許可證復(fù)印件； （二）可行性研究報告； 1、擬設(shè)臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室機(jī)構(gòu)的所在地醫(yī)療衛(wèi)生資源狀況、本機(jī)構(gòu)的基本情況、對臨床基因擴(kuò)增檢驗的需求以及臨床基因擴(kuò)增實驗室運行的預(yù)測分析； 2、擬設(shè)

3、臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室的設(shè)置平面圖； 3、擬設(shè)臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室將開展的檢驗項目、實驗設(shè)備條件和有關(guān)技術(shù)人員資料 第七條衛(wèi)生部臨檢中心和省臨檢中心共同組織相關(guān)專業(yè)的專家組（以下簡稱專家組），按照臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室基本設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)對提出申請的臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室進(jìn)行技術(shù)驗收。驗收完成后，在20日內(nèi)將驗收報告寄送至申請機(jī)構(gòu)。 第八條經(jīng)專家組技術(shù)驗收合格的醫(yī)療機(jī)構(gòu)將本辦法第六條規(guī)定的材料及專家組驗收報告送至省級行政部備案。在將符合規(guī)定的全部材料送達(dá)省級衛(wèi)生行政部門后15日內(nèi)未收到省級衛(wèi)生行政部門不同意的意見，方可開展專家組技術(shù)驗收合格的臨床基因擴(kuò)增檢驗項目。 第九條未經(jīng)專家組驗收合格并報省級衛(wèi)

4、生行政部門備案的醫(yī)療機(jī)構(gòu)不得擅自開展臨床基因擴(kuò)增檢驗項目。第三章實驗室監(jiān)督管理 第十條臨床基因檢驗實驗室必須按照臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室工作規(guī)范（另發(fā)）開展臨床基因擴(kuò)增檢驗工作。 第十一條臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室技術(shù)人員必須進(jìn)行上崗培訓(xùn)。經(jīng)培訓(xùn)合格者，由培訓(xùn)單位發(fā)給合格證書，并將培訓(xùn)合格人員名單報衛(wèi)生部臨檢中心備案。獲得培訓(xùn)合格證書者方可從事臨床基因擴(kuò)增檢驗工作。 培訓(xùn)單位為衛(wèi)生部臨檢中心，或由省級衛(wèi)生行政部門指定并經(jīng)衛(wèi)生部臨檢中心認(rèn)定的機(jī)構(gòu)。培訓(xùn)時使用規(guī)定的統(tǒng)一教材。 第十二條以科研為目的的基因擴(kuò)增檢驗項目。不得向臨床出具檢驗報告，不得向病人收取任何費用。 第十三條臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室必須按照

5、臨床基因擴(kuò)增實驗室工作規(guī)范開展室內(nèi)質(zhì)量控制，并參加衛(wèi)生部臨檢中心組織的室內(nèi)質(zhì)量評價。第十四條衛(wèi)生部臨檢中心按照本方法和臨床基因擴(kuò)增實驗室工作規(guī)范協(xié)調(diào)、組織省臨檢中心對臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室的檢驗質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)測。監(jiān)測結(jié)果報省級衛(wèi)生行政部門，同時抄送被監(jiān)測的臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室所在醫(yī)療機(jī)構(gòu)。 第十五條衛(wèi)生部臨檢中心或省級臨檢中心受省級以上衛(wèi)生行政部門委托可對臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室進(jìn)行現(xiàn)場檢查，現(xiàn)場檢查工作人員在履行職責(zé)時應(yīng)出示證件。在進(jìn)行現(xiàn)場檢查時，檢查人員有權(quán)調(diào)閱有關(guān)資料，被檢查機(jī)構(gòu)不得拒絕或隱瞞。 第十六條衛(wèi)生部臨檢中心對在室間質(zhì)量評價中不合格的臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室提出警告，對連續(xù)二次或三次

6、中有二次發(fā)現(xiàn)臨床基因擴(kuò)增檢驗結(jié)果不合格的臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室，衛(wèi)生部臨檢中心報省級以上衛(wèi)生行政部門由省級以上衛(wèi)生行政部門責(zé)令其暫停有關(guān)臨床基因擴(kuò)增檢驗項目，限期整改。經(jīng)專家組進(jìn)行再次技術(shù)驗收并合格，并報省級衛(wèi)生行政部門核準(zhǔn)后，方可重新開展臨床基因擴(kuò)增檢驗項目。 第十七條對于未經(jīng)衛(wèi)生部臨檢中心組織的專家組技術(shù)驗收合格并報省級衛(wèi)生部門備案，擅自開展臨床基因檢驗項目的醫(yī)療機(jī)構(gòu)，由省級衛(wèi)生行政部門依據(jù)醫(yī)療機(jī)構(gòu)管理條例第四十七條和醫(yī)療機(jī)構(gòu)管理條例實施細(xì)則第八十條予以處罰，并予以公告。公告所需費用由被公告機(jī)構(gòu)支付。第十八條出現(xiàn)下列情況之一的臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室，由省級衛(wèi)生行政部門責(zé)令其停止開展臨床基因

7、擴(kuò)增檢驗，并對其所在醫(yī)療機(jī)構(gòu)予以公告。公告所需費用由被公告機(jī)構(gòu)支付： （一）開展超出衛(wèi)生部臨檢中心組織的技術(shù)驗收合格并報省級衛(wèi)生行政部門備案臨床基因擴(kuò)增檢驗項目的； （二）使用未經(jīng)國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的試劑開展臨床基因擴(kuò)增檢驗的； （三）在臨床基因擴(kuò)增檢驗中未開展室內(nèi)質(zhì)量控制的； （四）在臨床基因擴(kuò)增檢驗中未參加室間質(zhì)量評價的； （五）在臨床基因擴(kuò)增檢驗中弄虛作假的； （六）以科研為目的的基因擴(kuò)增檢驗項目向病人收取費用的； （七）使用未經(jīng)培訓(xùn)合格的專業(yè)技術(shù)人員從事臨床基因擴(kuò)增檢驗的；第四章附則 第十九條對采供血機(jī)構(gòu)的基因擴(kuò)增檢驗實驗室開展基因擴(kuò)增檢驗項目的管理，參照本辦法執(zhí)行。 第二十條衛(wèi)生

8、部臨檢中心組織的專家組對申請開展臨床基因擴(kuò)增檢驗的實驗室進(jìn)行技術(shù)驗收所需費用按國家有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。第二十一條本辦法由衛(wèi)生部負(fù)責(zé)解釋。第二十二條本辦法自發(fā)布之日起施行。附：臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室基本設(shè)置標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)臨床檢驗擴(kuò)增檢驗實驗室管理暫行辦法，制定本標(biāo)準(zhǔn) 一、臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室區(qū)域設(shè)置原則 （一）臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室區(qū)域設(shè)置原則 1、試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū) 2、標(biāo)本制備區(qū) 3、擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū) 4、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū) 如使用全自動分析儀，區(qū)域可適當(dāng)合并。 （二）各工作區(qū)域必須有明確的標(biāo)記，避免不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品混用。 （三）進(jìn)入各工作區(qū)域必須嚴(yán)格按照單一方向進(jìn)行，即試劑儲存和準(zhǔn)備

9、區(qū)>標(biāo)本制備區(qū)>擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)>擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。 （四）不同的工作區(qū)域使用不同的工作服（例如不同的顏色）。工作人員離開各工作區(qū)域時，不得將工作服帶出。 二、工作區(qū)域儀器設(shè)備配置標(biāo)準(zhǔn) （一）試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū) 1、2-8c和-15c冰箱 2、混勻器 3、微量加樣器（覆蓋1-1000ul） 4、移動紫外燈（近工作臺面） 5、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心） 6、專用工作服和工作鞋 7、專用辦公用品 （二）標(biāo)本制備區(qū) 1、2-8c冰箱、-20c或-80c冰箱 2、高速臺式冷凍離心機(jī) 3、混允器 4、水浴箱或加熱模塊 5、微量加樣器

10、（覆蓋1-1000ul） 6、可移動紫外燈（近工作臺面） 7、超凈工作臺 8、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心） 9、專用工作服和工作鞋 10、專用辦公用品 如需處理大分子dna，應(yīng)具有超聲波水浴儀。 （三）擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū) 1、核酸擴(kuò)增儀 2、微量加樣器（覆蓋1-1000ul） 3、可移動紫外燈（近工作臺面） 4、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心） 5、專用工作服和工作鞋 6、專用辦公用品 （四）擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū) 視檢驗方法不同而定?；緝x器設(shè)備如下。 1、微量加樣器（覆蓋1-1000ul） 2、可移動紫

11、外燈（近工作臺面） 3、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、加樣器吸頭（帶濾心） 4、專用工作服和工作鞋 5、專用辦公用品如何迎接臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室技術(shù)驗收 2003年華XX縣區(qū)臨床檢驗中心協(xié)作組臨床實驗室質(zhì)量管理及新技術(shù)應(yīng)用高級研討會 臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室主要應(yīng)用把pcr（聚合酶鏈反應(yīng)）技術(shù)應(yīng)用于疾病的診斷與治療監(jiān)測。pcr技術(shù)發(fā)明是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一項革命性創(chuàng)舉，具有深遠(yuǎn)歷史意義，但在上世紀(jì)九十年代中國，在我國由于部分醫(yī)部機(jī)構(gòu)受利益的驅(qū)動，在缺乏技術(shù)、設(shè)備以及規(guī)范化管理的情況下，pcr技術(shù)臨床應(yīng)用泛濫，出現(xiàn)大量假陽性和假陰性結(jié)果，甚至出現(xiàn)虛假檢測報告，造成檢驗結(jié)果和臨床意義應(yīng)用十分混亂，

12、嚴(yán)重擾亂正常醫(yī)療秩序，特別在性病基因檢測方面，甚至還帶來一系列道德倫理、家庭糾紛以及社會和法律問題。pcr技術(shù)臨床應(yīng)用所出現(xiàn)的一系列問題引起衛(wèi)生部管理層高度重視，衛(wèi)生部醫(yī)政司于1988年下發(fā)了衛(wèi)醫(yī)發(fā)19989號文件宣布pcr技術(shù)暫停應(yīng)用于臨床診斷。經(jīng)過近四年反復(fù)論證，衛(wèi)生部2002年1月14日發(fā)布“臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室管理暫行辦法”，同年2月20日衛(wèi)生部臨床檢驗中心發(fā)布“臨床基因擴(kuò)增實驗室工作規(guī)范”。兩個文件宣布了pcr技術(shù)臨床應(yīng)用解凍，明確規(guī)定臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室開展pcr技術(shù)必需具備的基本條件：規(guī)范的pcr實驗室編寫適合本實驗室的質(zhì)量手冊經(jīng)pcr專業(yè)知識培訓(xùn)的技術(shù)人員（pcr上崗證）使

13、用有生產(chǎn)批文的pcr試劑。具備條件的二級以上醫(yī)院可向衛(wèi)生部或省臨床檢驗中心申請技術(shù)驗收。 本人作為通過衛(wèi)生部臨床檢驗中心驗收的臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室一名實驗室工作人員，同時也作為專家多次參與衛(wèi)生部臨床檢驗中心組織的實驗室驗收，就臨床基因擴(kuò)增實驗室技術(shù)驗收的前期準(zhǔn)備工作和現(xiàn)場技術(shù)驗收整個過程作一簡單介紹，并談?wù)劚救梭w會。 一、為什么要進(jìn)行臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室技術(shù)增收 臨床基因擴(kuò)增實驗室采用pcr技術(shù)用于臨床基因診斷，由于pcr技術(shù)對所檢測的核酸模板進(jìn)行大量擴(kuò)增，容易出現(xiàn)實驗室污染導(dǎo)致臨床檢測標(biāo)本假陽性結(jié)果；另外由于pcr技術(shù)要求高、影響因素多（特別是rna標(biāo)本），實驗過程處理不當(dāng)易導(dǎo)致核酸模板

14、無擴(kuò)增現(xiàn)象，導(dǎo)致臨床標(biāo)本假陰性結(jié)果。因此臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室技術(shù)驗收和規(guī)范化管理是pcr技術(shù)本身需要，也是在臨床上順利應(yīng)用該技術(shù)前提。 二、pcr實驗室驗收準(zhǔn)備工作 （一）硬件準(zhǔn)備實驗室基本建設(shè) 1.根據(jù)文件要求，臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室原則上分為四個單獨的工作區(qū)域：試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)；標(biāo)本制備區(qū)；擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)；擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)，如使用全自動封閉分析儀器檢測，此區(qū)域可不設(shè)。 2.各工作區(qū)域必須有明確的標(biāo)記，避免不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品混用。 3.進(jìn)入各工作區(qū)域必須嚴(yán)格按照單一流向進(jìn)行，即試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。 4.不同的工作區(qū)域使用不同

15、的工作服（不同的顏色）。工作人員離開各工作區(qū)域時，不得將工作服帶出。 5.工作區(qū)域儀器設(shè)備配置標(biāo)準(zhǔn)（1）試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū) 28和-15冰箱：混勻器；微量加樣器（覆蓋11000ul）；移動紫外燈（近工作臺面）；消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）；專用工作服和工作鞋；專用辦公用品等。（2）標(biāo)本制備區(qū) 28冰箱，-20或-80冰箱；高速臺式冷凍離心機(jī)；混勻器；水浴箱或加熱模塊；微量加樣器（覆蓋11000ul）；可移動紫外燈（近工作臺面）；超凈工作臺，消耗品；一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）；專用工作服和工作鞋；專用辦公用品等。

16、（3）擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū) 核酸擴(kuò)增儀；微量加樣器（覆蓋11000ul）；可移動紫外燈（近工作臺面）；消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）；專用工作服和工作鞋；專用辦公用品等。（4）擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū) 視檢測方法不同而定。基本儀器設(shè)備如下：微量加樣器（覆蓋1200ul）；可移動紫外燈（近工作臺面）；消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）；專用工作服和工作鞋；專用辦公用品等。 （二）軟件建設(shè)質(zhì)量手冊編寫與實施、人才資源（上崗證培訓(xùn)與相關(guān)知識學(xué)習(xí)） 1.臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室的質(zhì)量手冊編寫 質(zhì)量手冊是闡明臨床基因擴(kuò)增檢驗實

17、驗室的質(zhì)量方針，并描述過其質(zhì)量體系的文件。質(zhì)量手冊規(guī)定了質(zhì)量體系的基本結(jié)構(gòu)，是實施和保持質(zhì)量體系應(yīng)長期遵循的文件。臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室質(zhì)量手冊編寫應(yīng)依照衛(wèi)生部下發(fā)兩個文件，并結(jié)合本實驗室實際情況編寫適合本實驗室的切實可行的質(zhì)量手冊。質(zhì)量手冊的提綱應(yīng)包括三部分：質(zhì)量方針和宗旨；工作制度；標(biāo)準(zhǔn)操作文件（sop）（1）質(zhì)量方針和宗旨 制定臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室的質(zhì)量管理目標(biāo)和質(zhì)量保證體系的結(jié)構(gòu)體系和總方針。（2）工作制度 一般應(yīng)包括以下文件：實驗室的設(shè)置、布局及組織結(jié)構(gòu)；實驗室內(nèi)務(wù)管理制度；實驗室的人員配置及管理制度；生物的防護(hù)與安全制度；實驗室廢棄物處理制度；實驗室清潔消毒制度；儀器設(shè)備的管理制

18、度；儀器、試劑、耗材購置程序及管理制度；臨床標(biāo)本的管理制度；實驗室記錄的管理制度；質(zhì)量控制工作管理制度；結(jié)果報告管理制度；抱怨的內(nèi)部處理制度；負(fù)責(zé)人及質(zhì)檢員職責(zé)；崗位設(shè)置和責(zé)任制等""（3）標(biāo)準(zhǔn)操作程序（sop） 一般包括：消毒液配制標(biāo)準(zhǔn)操作程序：消毒標(biāo)準(zhǔn)操作程序；超凈工作臺使用標(biāo)準(zhǔn)操作程序；超凈工作臺維護(hù)和保養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作文件；pcr儀使用標(biāo)準(zhǔn)操作程序；pcr儀維護(hù)和保養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作程序；高速低溫離心機(jī)使用標(biāo)準(zhǔn)操作程序；移液器使用標(biāo)準(zhǔn)操作程序；冰箱維護(hù)和保養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作程序；電熱恒溫水浴箱操作程序；電子天平使用和校正操作程序；可移動紫外消毒車使用操作程序；加樣器校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)操作程序；離心

19、機(jī)維護(hù)保養(yǎng)操作程序；溫度計校準(zhǔn)程序；試劑的質(zhì)檢操作程序；標(biāo)本唯一標(biāo)識編號編制規(guī)則；臨床標(biāo)本的采集及處理操作程序；臨床標(biāo)本的保存程序；乙肝病毒核酸擴(kuò)增熒光檢測標(biāo)準(zhǔn)操作程序；丙肝病毒核酸擴(kuò)增熒光檢測標(biāo)準(zhǔn)操作程序；結(jié)核分枝桿菌核酸擴(kuò)增熒光檢測標(biāo)準(zhǔn)操作程序；沙眼衣原體核酸擴(kuò)增熒光檢測標(biāo)準(zhǔn)操作程序等""（4）引用圖表：pcr擴(kuò)增可接受標(biāo)本記錄表；pcr擴(kuò)增拒收標(biāo)本記錄表；室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果記錄表；室間質(zhì)控記錄表；消耗性材料驗收記錄表；試劑驗收記錄表；故障處理表；臺階式高速離心機(jī)使用記錄表；臺式高速冷凍離心機(jī)使用記錄表；擴(kuò)增儀維護(hù)保養(yǎng)記錄表；人員培訓(xùn)計劃及培訓(xùn)記錄表；實驗室工作人員一覽表；主

20、要設(shè)備一覽表；實驗室清潔消毒記錄表；工作區(qū)溫度、濕度記錄表；抱怨記錄表；標(biāo)本超低溫保存記錄表；應(yīng)急處理記錄表；垃圾處理記錄表；冰箱溫度記錄表；水浴箱溫度記錄表；移動紫外消毒車記錄表；設(shè)備校正記錄表；檢測結(jié)果報告流程；報告單樣張；臨床送檢標(biāo)本流程圖；實驗室組織結(jié)構(gòu)圖。 三、臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室技術(shù)驗收申請（1）填寫臨床擴(kuò)增檢驗實驗室技術(shù)驗收申請表（a）基因擴(kuò)增檢驗實驗室基本情況 包括檢驗科基本情況特別是基因擴(kuò)增檢驗實驗室基本運行情況，必要性與可行性，著重分析開展項目運行情況、人員配置現(xiàn)狀、內(nèi)部質(zhì)量管理體系執(zhí)行情況與效果分析。（b）應(yīng)提供資料醫(yī)療機(jī)構(gòu)執(zhí)業(yè)許可證； 擬設(shè)置基因擴(kuò)增檢驗實驗室醫(yī)院的醫(yī)

21、療衛(wèi)生資源狀況、對臨床基因擴(kuò)增檢驗的需求情況以及實驗室運行的預(yù)測分析； 擬設(shè)基因擴(kuò)增檢驗實驗室的設(shè)置平面圖； 實驗室主要負(fù)責(zé)人簡歷表； 實驗室工作人員一覽表（附實驗室工作人員簡歷）； 主要儀器設(shè)備表；擬開展的臨床基因診斷項目； 臨床基因診斷質(zhì)量手冊； 檢驗報告單2份。（c）希望驗收時間 根據(jù)本實驗室建設(shè)進(jìn)展情況和試運行進(jìn)展，提出大致的現(xiàn)場技術(shù)驗收時間。（d）聲明 志愿申請，承擔(dān)兩義務(wù)。遵守臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室管理暫行辦法和臨床基因診斷實驗室工作規(guī)范及有關(guān)規(guī)定；不論能否獲準(zhǔn)通過驗收，預(yù)付驗收階段的全部費用。 （2）衛(wèi)生部或省臨床檢驗中心預(yù)審 對申報文件和現(xiàn)場進(jìn)行預(yù)驗收，初步確定是否進(jìn)行現(xiàn)場驗收

22、和驗收時間。 四、現(xiàn)場技術(shù)驗收 衛(wèi)生部臨床檢驗中心臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室技術(shù)任務(wù)書現(xiàn)場技術(shù)專家組成員組成 技術(shù)驗收工作日程表驗收組預(yù)備會首次會議現(xiàn)場驗收 實驗室設(shè)置及儀器設(shè)備配備情況實驗室標(biāo)準(zhǔn)操作程序文件有關(guān)記錄現(xiàn)場考核現(xiàn)場試驗驗收組全體會議擬定驗收結(jié)論和驗收報告末次會議 驗收組宣布驗收結(jié)論實驗室負(fù)責(zé)人講話 .臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室驗收體會 （）對驗收文件的學(xué)習(xí)不夠、理解不深，導(dǎo)致編制程序性文件偏離，應(yīng)對照驗收要求逐條落實，切實可行。（）目的性認(rèn)識不足： 受老觀念的影響，總以為實驗室技術(shù)驗收準(zhǔn)備工作是為專家而準(zhǔn)備的，沒意識到這是本實驗室檢驗質(zhì)量的內(nèi)在需要，以為只要通過專家現(xiàn)場驗收，拿到合格證書

23、就萬事大吉了。（）質(zhì)量控制意識不強(qiáng) 我們編寫的質(zhì)量手冊的目的是規(guī)范實驗操作整個過程，做到實驗過程有章可循，實驗記錄有據(jù)可查，保證實驗結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。由于基因擴(kuò)增技術(shù)特殊性，即使嚴(yán)格按質(zhì)量手冊進(jìn)行操作，也難免出現(xiàn)錯誤結(jié)果，因此還應(yīng)該強(qiáng)化質(zhì)量控制意識。實驗過程中嚴(yán)格設(shè)置質(zhì)控標(biāo)本，包括試劑空白對照、陰性標(biāo)本對照、臨界值陽性標(biāo)本對照等，分別監(jiān)測試劑配制與加樣過程中是否存在污染。標(biāo)本核酸模板提取過程中是否存在污染。標(biāo)本檢測過程中是否存在假陰性結(jié)果和結(jié)果是否準(zhǔn)確。等。但有些醫(yī)院由于考慮到各種實際問題而沒有很好落實，應(yīng)引起高度重視。（4）程序文件實施難問題 在許多醫(yī)院，由于基因擴(kuò)增檢驗實驗室是目前大多

24、檢驗科唯一通過實驗室技術(shù)驗收的實驗室，可能受周邊其他實驗室不規(guī)范行為的干擾和存在人員配備方面問題，可能出現(xiàn)文件落實方面問題，特別是原始標(biāo)本的接收和記錄方面。 （5）工作量少影響質(zhì)量保證體系實施 嚴(yán)格按臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室技術(shù)要求通過驗收的實驗室，存在一定運行成本，需要有一定臨床標(biāo)本量的支持；如果某一醫(yī)院醫(yī)療資源不足，標(biāo)本來源不足以支持運行成本時，就會想方設(shè)法去減少運行成本（包括試劑成本和勞務(wù)成本），導(dǎo)致檢驗質(zhì)量難以得到保證。因此建議欲建立臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室的單位，應(yīng)充分考慮自己醫(yī)療資源情況，確定是自己建立臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室合算。還是外送標(biāo)本合算。同時衛(wèi)生部和省臨床檢驗中心在初審應(yīng)充分

25、考慮這方面情況，以及現(xiàn)場驗收專家應(yīng)嚴(yán)加把關(guān)1質(zhì)量管理的歷史 1950年代臨床實驗室開始質(zhì)量控制（qualitycontrol，qc）;1980年代參照工業(yè)的gmp管理思路建立良好實驗室實踐準(zhǔn)則（goodlaboratorypractice，glp）；進(jìn)入質(zhì)量保證（qualityassurance，qa）；1990年代實驗室引入質(zhì)量體系認(rèn)證及實驗室認(rèn)可制度，實現(xiàn)全面質(zhì)量管理（tqm，totalqualitymanagement）。質(zhì)量體系認(rèn)證iso9000（2000版）；實驗室認(rèn)可iso/iec標(biāo)準(zhǔn)17025-2000校準(zhǔn)和檢測實驗室資格的通用要求；iso/dis標(biāo)準(zhǔn)15189-1999“醫(yī)學(xué)實

26、驗室的質(zhì)量管理?！?美國臨床實驗室認(rèn)證o發(fā)證機(jī)構(gòu)：hcfa（healthgarefinancingadministrations），衛(wèi)生保健署 o認(rèn)證依據(jù)，cloa38，行業(yè)認(rèn)可，強(qiáng)制，體系+能力o認(rèn)證中介機(jī)構(gòu)： *jcaho（jointcommissiononaccreditationofhealthcareorganizations）衛(wèi)生機(jī)構(gòu)認(rèn)可聯(lián)合委員會 *cap（collegeofamericanpathologist）美國病理家學(xué)會 *cola（commissiononofficelaboratoryaccred-itation） 醫(yī)生實驗室認(rèn)可委員會3我國實驗室合格評定o認(rèn)可 *依

27、據(jù)：iso/iec17025，15189*國家評審，自愿，體系+能力o認(rèn)證 *依據(jù)：iso9000：2000版*中介機(jī)構(gòu)，自愿，體系o行業(yè)技術(shù)驗收 *臨床實驗室管理辦法，XX省醫(yī)院檢驗科建設(shè)與管理規(guī)范*省、市臨床檢驗中心，強(qiáng)制，體系+能力4pcr驗收意義及驗收依據(jù)2002年開始的pcr實驗室驗收工作開創(chuàng)臨床檢驗技術(shù)準(zhǔn)入的先河、推動臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)、規(guī)范檢測市場、建立醫(yī)療事故預(yù)防機(jī)制。其依據(jù)為：臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室管理暫行辦法衛(wèi)醫(yī)發(fā)200210號臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室工作規(guī)范衛(wèi)檢字20028號關(guān)于成立臨床基因擴(kuò)增檢驗專家組的通知蘇衛(wèi)醫(yī)200242號5規(guī)定應(yīng)具有的sop（13個） 儀器設(shè)備的

28、維護(hù)保養(yǎng)程序、儀器設(shè)備的校準(zhǔn)程序、儀器設(shè)備的操作程序、臨床標(biāo)本收集程序、臨床標(biāo)本的處理（核酸純化）程序、臨床標(biāo)本的保存程序、試劑的質(zhì)檢操作程序、消耗品購置驗收和儲存程序、廢棄物的處理程序、內(nèi)務(wù)管理程序、室內(nèi)質(zhì)量控制程序、核酸擴(kuò)增及產(chǎn)物分析檢測的操作程序、抱怨處理程序。6質(zhì)量管理體系 6.1定義在質(zhì)量方面指揮和控制組織的管理體系。（qualitymanagementsystem）管理體系是指建立方針和目標(biāo)并實現(xiàn)這些目標(biāo)的體系。實驗室通過把組織機(jī)構(gòu)、職責(zé)、工作程序、質(zhì)量活動過程和各類資源、信息等協(xié)調(diào)統(tǒng)一起來所形成的有機(jī)整體即為實驗室的質(zhì)量體系。 6.2質(zhì)量體系的文件構(gòu)成第一層：質(zhì)量手冊（綱領(lǐng)性文件

29、）；第二層：程序性文件（體系要素的規(guī)定）；第三層：作業(yè)指導(dǎo)書（具體項目的操作指導(dǎo)）；第四層：記錄包括表格、簽名、原始記錄、報告等質(zhì)量記錄和技術(shù)記錄。 6.3質(zhì)量手冊定義 gb/t6583定義。質(zhì)量手冊是闡明一個實驗室的質(zhì)量方針，并描述質(zhì)量體系的文件。它既是質(zhì)量體系的表征形式，又是質(zhì)量體系建立和運行的綱領(lǐng)。它對實驗室的組織結(jié)構(gòu)（含職責(zé)）、程序、活動能力（過程）和資源作出規(guī)定，是實驗室長期遵循的文件。 6.4質(zhì)量手冊的分類 根據(jù)手冊的內(nèi)容和用途分為二類。質(zhì)量保證手冊用于證明，供客戶使用，質(zhì)量管理手冊用于運行，供實驗室內(nèi)部使用。 6.5質(zhì)量手冊的作用 編寫質(zhì)量手冊的健全和完善質(zhì)量體系的首要環(huán)節(jié)。根據(jù)

30、實驗室的內(nèi)外因素合理調(diào)整、選擇體系要素，分配和落實質(zhì)量職責(zé)，理順管理關(guān)系，明確管理責(zé)任，合理安排各類文件的層次，把實驗室積累的經(jīng)驗變成法規(guī)性文件。協(xié)調(diào)各工作環(huán)節(jié)的準(zhǔn)則。 內(nèi)部質(zhì)量審核的依據(jù)；對外證實實驗室的質(zhì)量保證能力，提高客戶的信任度。 6.6質(zhì)量手冊的特征 o以客戶為關(guān)注焦點：以病人為中心，為臨床服務(wù)o領(lǐng)導(dǎo)作用：創(chuàng)造使員工能夠充分參與實現(xiàn)目標(biāo)的環(huán)境o全員參與：各負(fù)其責(zé) o過程方法：將資源和活動作為過程進(jìn)行有效管理o管理的系統(tǒng)方法：各個過程的有效連接o持續(xù)改進(jìn)：根據(jù)實際不斷完善 o基于事實的決策方法：遵循科學(xué)，實事求是出報告o與供方互利的關(guān)系：相互協(xié)作，共同獲利6.7質(zhì)量手冊的結(jié)構(gòu)o封面o批

31、準(zhǔn)頁：包括實驗室名稱、標(biāo)志，發(fā)行版次，生效日期，批準(zhǔn)人簽名，手冊編號，受控狀態(tài)。o實驗室公正性聲明 o修訂頁。以表格描述修訂序號、修訂的章節(jié)條款和簡要內(nèi)容、批準(zhǔn)人及日期。 o目錄：各章節(jié)條款的名稱及頁碼 o前言：介紹實驗室的一般情況和手冊的適用范圍以及手冊中術(shù)語或縮略語的定義 o手冊的管理：對手冊的保存、分發(fā)、評審、修訂以及保密作出規(guī)定o質(zhì)量方針及目標(biāo) o組織結(jié)構(gòu)及人員責(zé)權(quán)利關(guān)系 o要素描述：由系列sop文件對溯源、人、機(jī)、料、樣、法、測等質(zhì)量諸要素的陳述 o支持性文件：包括實驗室平面圖、人員一覽表、儀器設(shè)備一覽表、引用標(biāo)準(zhǔn)及參考文獻(xiàn)等6.8標(biāo)準(zhǔn)操作程序 standardoperational

32、procedure，簡稱sop。程序的定義為： 為進(jìn)行某項活動所規(guī)定的途徑。sop是臨床實驗室內(nèi)部以文件的形式對質(zhì)量活動用規(guī)定的方法進(jìn)行連續(xù)而恰當(dāng)?shù)目刂?。實驗室的sop應(yīng)涵蓋所有的質(zhì)量活動，包括檢測或校準(zhǔn)計劃、管理性程序、技術(shù)性程序、項目操作程序和記錄表格等。由于影響每個實驗室的質(zhì)量活動的條件和因素不一樣，一個sop只在某個實驗室內(nèi)有效，而不一定適用于其他實驗室。 6.9標(biāo)準(zhǔn)操作程序的一般要求o對完成各項質(zhì)量活動的方法作出規(guī)定，每個sop都應(yīng)對一個或一組相互關(guān)系的活動進(jìn)行描述； o每個sop應(yīng)說明該項質(zhì)量各環(huán)節(jié)的輸入、轉(zhuǎn)換和輸出所需的文件、物資、人員、記錄以及它們與有關(guān)活動的接口關(guān)系； o規(guī)定

33、開展質(zhì)量活動的各個環(huán)節(jié)的物資、人員、信息和環(huán)境等方面應(yīng)具備的條件； o明確每個環(huán)節(jié)轉(zhuǎn)換過程中各項因素的要求，即由誰做、做什么、做到什么程序、達(dá)到什么要求，如何控制、形成什么記錄和報告，以及相應(yīng)的審批手續(xù)； o規(guī)定在質(zhì)量活動中需要注意的例外或特殊情況的糾正措施；osop應(yīng)簡練、明確和易懂并且工作人員熟練掌握和嚴(yán)格遵守。 6.10推薦pcr實驗室質(zhì)量手冊目錄1.質(zhì)量方針和宗旨2.工作制度 2.1實驗室的設(shè)置、布局及組織結(jié)構(gòu)2.2實驗室內(nèi)務(wù)管理制度2.3實驗室的人員配置及管理制度2.4生物防護(hù)與安全制度2.5實驗室廢棄物處理制度2.6實驗室清潔消毒制度2.7儀器設(shè)備的管理制度 2.8儀器、試劑、耗材

34、購置程序及管理制度2.9臨床標(biāo)本的管理制度2.10實驗室記錄的管理制度2.11質(zhì)量控制工作管理制度2.12結(jié)果報告管理制度2.13崗位責(zé)任制2.14抱怨制度3.操作指導(dǎo)書（sop）3.1消毒標(biāo)準(zhǔn)操作程序 3.2超凈工作臺使用標(biāo)準(zhǔn)操作程序3.3超凈工作臺維護(hù)和保養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作程序3.4pcr儀使用標(biāo)準(zhǔn)操作程序3.5pcr儀維護(hù)和保養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作程序3.6臺式離心機(jī)使用標(biāo)準(zhǔn)操作程序3.7高速冷凍離心操作標(biāo)準(zhǔn)操作程序3.8移液器使用標(biāo)準(zhǔn)操作程序3.9加樣器校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)操作程序3.10冰箱維護(hù)和保養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作程序3.11電熱恒溫水浴箱操作程序3.12電子天平使用和校正操作程序3.13可移動紫外消毒車使用操作程序3.

35、14溫度計校準(zhǔn)程序3.15試劑的質(zhì)檢操作程序3.16標(biāo)本唯一標(biāo)識編號編制規(guī)則3.17臨床標(biāo)本的采集及處理操作程序3.18臨床標(biāo)本的保存程序 3.19乙肝病毒核酸擴(kuò)增熒光檢測標(biāo)準(zhǔn)操作程序3.20室內(nèi)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)操作程序3.21室間質(zhì)評標(biāo)準(zhǔn)操作程序4.引用圖表 4.1實驗室組織結(jié)構(gòu)圖4.2實驗室工作人員一覽表4.3人員培訓(xùn)計劃及培訓(xùn)記錄表4.4主要儀器設(shè)備一覽表4.5臨床送檢標(biāo)本流程圖4.6pcr擴(kuò)增可接受標(biāo)本記錄表4.7pcr擴(kuò)增拒收標(biāo)本記錄表4.8室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果記錄表4.9室間質(zhì)控記錄表4.10消耗性材料驗收記錄表4.11試劑驗收記錄表4.12故障處理表4.13儀器設(shè)備使用記錄表4.14儀器設(shè)備

36、維護(hù)保養(yǎng)記錄表4.15實驗室清潔消毒記錄表4.16工作區(qū)溫度、濕度記錄表4.17抱怨記錄表 4.18標(biāo)本超低溫保存記錄表4.19應(yīng)急處理記錄表4.20垃圾處理記錄表4.21冰箱溫度記錄表4.22水浴箱溫度記錄表4.23移動紫外消毒車記錄表4.24設(shè)備校正記錄表4.25檢測結(jié)果報告流程4.26報告單樣張6.11文件格式一目的二范圍三職責(zé)四工作流程五引用文件及表格6.12寫作技巧 o目的：why，為什么要開展這項活動o范圍：what，活動涉及的方面o職責(zé)：who+what，誰做，誰負(fù)責(zé) o工作流程：列出活動順序和細(xì)節(jié)，明確各環(huán)節(jié)“輸入轉(zhuǎn)換輸出”，即做何事（what）、何人做（who）、何時做（wh

37、en）、何地做（where）、如何做（how）o引用文件和表格： 開展此項活動涉及的文件、標(biāo)準(zhǔn)以及使用的表格、證明文件和記錄保存期7評審中常見問題7.1手冊 文件不全，無系統(tǒng)性；質(zhì)量要素描述不全；格式不對；與實際工作脫節(jié)；無現(xiàn)行有效性（無手簽，各區(qū)無相應(yīng)手冊）；記錄不全、不規(guī)范7.2人員 人員檔案。每人一個檔案袋，有關(guān)資格證書（如上崗證）、培訓(xùn)、技能和經(jīng)歷等。 培訓(xùn)計劃及實施記錄。每人有年度、季度、月的培訓(xùn)內(nèi)容及實施記錄；內(nèi)容包括外出學(xué)習(xí)、進(jìn)修，內(nèi)部質(zhì)量手冊學(xué)習(xí)、業(yè)務(wù)學(xué)習(xí)、新項目引進(jìn)等。 7.3設(shè)施與環(huán)境 通風(fēng)、紫外、清潔、消毒的程序及記錄、生物安全防護(hù)的程序及記錄、生物垃圾的處理。 7.4儀

38、器設(shè)備 采購程序及驗收標(biāo)準(zhǔn)；校準(zhǔn)程序及狀態(tài)標(biāo)識，使用、維護(hù)、保養(yǎng)的程序及記錄；檔案：每個與檢測質(zhì)量相關(guān)的設(shè)備均應(yīng)建檔，內(nèi)容包括：設(shè)備的名稱；制造商名稱、型號、序號或其它唯一性標(biāo)識；接收日期和啟用日期；）目前放置地點；接收時的狀態(tài)（例如全新的、經(jīng)改裝的）；儀器使用說明書或其復(fù)印件；校準(zhǔn)和/或檢測的日期和結(jié)果以及下次校準(zhǔn)和/或檢測的日期；迄今所進(jìn)行的維護(hù)和今后維護(hù)計劃的細(xì)節(jié)；損壞、故障、改裝或修理的歷史。 7.4料（試劑、耗品） 采購程序及領(lǐng)用記錄，質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)、程序及記錄，應(yīng)急程序；缺貨、試劑變質(zhì)；室內(nèi)質(zhì)控品。 7.5樣（品）標(biāo)本唯一編號，年月日項目順序號；標(biāo)本采集標(biāo)準(zhǔn)操作程序；標(biāo)本接受（拒收）標(biāo)準(zhǔn)

39、、交接記錄；標(biāo)本保存、銷毀的程序及記錄；標(biāo)本處理標(biāo)準(zhǔn)操作程序7.6（方）法 方法學(xué)的有效性依據(jù)；sop的合理性生搬硬套；分區(qū)操作的協(xié)作流程合理；質(zhì)控點的安排提取效率、擴(kuò)增效率；基線的調(diào)整ct值、本底熒光值。 7.7（檢）測 o室內(nèi)質(zhì)控的sop：耗品質(zhì)檢，試劑質(zhì)檢，質(zhì)控方法（糾錯措施），質(zhì)控圖。o室間質(zhì)評的sop：糾偏措施7.8報告 o發(fā)放范圍：門診、病區(qū)、外單位o發(fā)放方式：保密、電子、郵件 o報告單的格式：唯一編號、檢測下限、實驗室申明o審核、標(biāo)準(zhǔn)、不合格報告的處理7.9抱怨 o實驗室服務(wù)、質(zhì)量改進(jìn)的依據(jù) o對象。病人、醫(yī)生、工作人員。sop應(yīng)明確方式、職責(zé)、反饋、記錄。 臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗

40、室管理暫行辦法 如何迎接臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室技術(shù)驗收 設(shè)計與驗收標(biāo)準(zhǔn) 臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室工作規(guī)范 為使基因擴(kuò)增檢驗技術(shù)有效地應(yīng)用于臨床，更好地為疾病的預(yù)防、診斷和治療服務(wù)，保證檢驗質(zhì)量，特制定本規(guī)范。 一、臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室的規(guī)范化設(shè)置及其管理 臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室的規(guī)范化設(shè)置詳見臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室管理暫行辦法（衛(wèi)醫(yī)發(fā)200210號文）附件臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室基本設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)。為避免污染，必須嚴(yán)格遵循臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室。臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室四個隔開的工作區(qū)域中每一區(qū)域都須有專用的儀器設(shè)備。各區(qū)域都必須有明確的標(biāo)記，以避免設(shè)備物品如加樣器或試

41、劑等從其各自的區(qū)域內(nèi)移出從而造成不同的工作區(qū)域間設(shè)備物品發(fā)生混淆。進(jìn)入各個工作區(qū)域必須嚴(yán)格遵循單一方向順序，即只能從試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)（簡稱擴(kuò)增區(qū)）至產(chǎn)物分析區(qū)，避免發(fā)生交叉污染。在不同的工作區(qū)域應(yīng)使用不同顏色或有明顯區(qū)別標(biāo)志的工作服，以便于鑒別。此外，當(dāng)工作者離開工作區(qū)時，不得將各區(qū)特定的工作服帶出。 清潔方法不當(dāng)也是污染發(fā)生的一個主要原因，因此實驗室的清潔應(yīng)按試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)至擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)的方向進(jìn)行。不同的實驗區(qū)域應(yīng)有其各自的清潔用具以防止交叉污染。 （一）試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū) 下述操作在該區(qū)進(jìn)行。貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。貯存試劑

42、和用于標(biāo)本制備的材料應(yīng)直接運送至試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)，不能經(jīng)過產(chǎn)物分析區(qū)。在打開含有反應(yīng)混合液的離心管或試管前，應(yīng)將其快速離心數(shù)秒。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。當(dāng)貯存試劑溶液經(jīng)檢查可用后，應(yīng)將其分裝貯存?zhèn)溆茫苊庥捎诮?jīng)常打開反應(yīng)管吸液而造成污染。 含反應(yīng)混合液的離心管或試管在冰凍前都應(yīng)快速離心數(shù)秒。大多數(shù)用于擴(kuò)增的試劑都應(yīng)冰凍貯存。為避免因單次反應(yīng)取液而頻繁的凍融主貯存試劑，應(yīng)分裝冰凍貯存試劑溶液。貯存試劑的分裝體積根據(jù)通常在實驗室內(nèi)一次測定所需的擴(kuò)增反應(yīng)數(shù)來決定。 主反應(yīng)混合液的組成成份尤其是聚合酶的適用性和穩(wěn)定性通過預(yù)試驗來檢查，評價結(jié)果必須有書面報告。對于&q

43、uot;熱啟動"技術(shù)（在第一個高溫變性步驟后加入酶），聚合酶也可不包含在主反應(yīng)混合液中。 在整個本區(qū)的實驗操作過程中，操作者必須戴手套，并經(jīng)常更換。此外，操作中使用一次性帽子也是一個有效地防止污染的措施。 嚴(yán)禁用嘴吸取液體，加樣器和吸頭等必須經(jīng)高壓處理。 工作結(jié)束后必須立即對工作區(qū)進(jìn)行清潔。本工作區(qū)的實驗臺表面應(yīng)可耐受諸如次氯酸鈉的化學(xué)物質(zhì)的消毒清潔作用。實驗臺表面的紫外照射應(yīng)方便有效。由于紫外照射的距離和能量對去污染的效果非常關(guān)鍵，因此可使用可移動紫外燈（254nm波長），在工作完成后調(diào)至實驗臺上6090cm內(nèi)照射。由于擴(kuò)增產(chǎn)物僅幾百bp，對紫外線損傷不敏感，因此紫外照射擴(kuò)增片段必

44、須延長照射時間，最好是照射過夜。實驗室及其設(shè)備的使用必須有日常記錄。 （二）標(biāo)本制備區(qū) 下述操作在該區(qū)進(jìn)行。臨床標(biāo)本的保存，核酸（rna、dna）提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測定rna時cdna的合成。 要正確使用加樣器。由于在加樣操作中可能會發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應(yīng)避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動?？赏ㄟ^在本區(qū)內(nèi)設(shè)立正壓條件避免從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。為避免樣本間的交叉污染，加入待測核酸后，必須蓋好含反應(yīng)混合液的反應(yīng)管。對具有潛在傳染危險性的材料，必須有明確的樣本處理和滅活程序。 用過的加樣器吸頭必須放入專門的消毒（例如含次氯酸鈉溶液）容器內(nèi)。實驗室桌椅表面每次工作后都要清潔，實驗材料

45、（原始血標(biāo)本、血清標(biāo)本、提取中的標(biāo)本與試劑的混合液等）如出現(xiàn)外濺，則必須分別處理并作出記錄。對實驗臺適當(dāng)?shù)淖贤庹丈洌?54nm波長，與工作臺面近距離）適合于滅活去污染?？梢苿幼贤饩€管燈可用來確保工作后對實驗臺面的充分照射。 樣本處理對核酸擴(kuò)增有很大影響，必須使用有效的核酸提取方法，可在開展臨床標(biāo)本檢測前對提取方法進(jìn)行評價。 用于rna擴(kuò)增檢測的樣本制備好以后，應(yīng)立即進(jìn)行cdna合成，因為cdna鏈較rna穩(wěn)定，保存相對容易。為保證逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的需要，應(yīng)在標(biāo)本制備區(qū)設(shè)置一個以上的溫育裝置。cdna合成的理想溫度依所使用的酶而定，傾向于使用一步法：即使用在擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液條件下具有逆轉(zhuǎn)錄活性的熱穩(wěn)定的

46、dna聚合酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，其較cdna合成后再開蓋以調(diào)節(jié)緩沖液或加入聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增發(fā)生污染的可能性降低。 待測rna的cdna拷貝須保存在標(biāo)本制備區(qū)，不得在本區(qū)對樣本進(jìn)行pcr擴(kuò)增。 （三）擴(kuò)增區(qū) 下述工作在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。dna或cdna擴(kuò)增。此外，已制備的dna模板和合成的cdna（來自樣本制備區(qū)）的加入和主反應(yīng)混合液（來自試劑貯存和制備區(qū)）制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。在巢式pcr測定中，通常在第一輪擴(kuò)增后必須打開反應(yīng)管，因此巢式擴(kuò)增有較高的污染危險性，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。 不能從本區(qū)再進(jìn)入任何"上游"區(qū)域，可降低本區(qū)的氣壓以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠

47、所致的污染，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的走動。如有加樣則應(yīng)在超凈臺內(nèi)進(jìn)行。打開預(yù)處理過的反應(yīng)混合液時必須防止液體濺出，尤其是在巢式擴(kuò)增步驟之間。一個簡單的方法是在打開反應(yīng)管前快速離心數(shù)秒?？墒褂皿w積較小的離心機(jī)，因其所占實驗臺面小，易于用一只手操作，適合于大多數(shù)超凈臺。防潮屏障如石蠟油或輕礦物油也具有防污染作用，但必須注意的是，礦物油本身也可能成為一種持續(xù)性的污染源。用過的加樣器必須注意清潔消毒。 完成操作及每天工作后都必須對實驗室臺面進(jìn)行清潔和消毒，紫外照射方法與前面區(qū)域相同。如有溶液濺出，必須處理并作出記錄。 （四）擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū) 下述操作在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。擴(kuò)增片段的測定。核酸擴(kuò)增后產(chǎn)物的分析方法多種

48、多樣，如膜上或微孔板上探針雜交方法（同位素標(biāo)記或非同位素標(biāo)記）、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、southern轉(zhuǎn)移、核酸測序方法等。目前國內(nèi)的商品試劑盒絕大部分均采用非同位素標(biāo)記的微孔板上探針雜交方法，即pcr-elisa方法，也有膜上探針雜交方法。 本區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源，因此必須注意避免通過本區(qū)的物品及工作服將擴(kuò)增產(chǎn)物帶出。在使用pcr-elisa方法檢測擴(kuò)增產(chǎn)物時，必須使用洗板機(jī)洗板，廢液必須收集至1mol/lhc1中，并且不能在實驗室內(nèi)傾倒，而應(yīng)至遠(yuǎn)離pcr實驗室的地方棄掉。用過的吸頭也必須放至1mol/lhcl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序處理，如焚燒。 由于本區(qū)有可能會

49、用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)如溴化乙錠、丙烯酰胺、甲醛或同位素等，故應(yīng)注意實驗人員的安全防護(hù)。本區(qū)的清潔消毒和紫外照射方法同前面區(qū)域。本區(qū)如采用負(fù)壓條件或減壓情況下（如安裝排風(fēng)扇）可減少擴(kuò)增產(chǎn)物從本區(qū)擴(kuò)散至前面區(qū)域的可能性。 二、臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室質(zhì)量保證 臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室質(zhì)量保證涉及到整個基因擴(kuò)增檢驗的所有階段，即測定分析前的標(biāo)本采集處理、測定中的核酸提取、擴(kuò)增和產(chǎn)物分析以及測定后的結(jié)果報告等。 （一）標(biāo)本的采集 常用于基因擴(kuò)增檢測的臨床標(biāo)本包括edta或枸櫞酸鈉抗凝全血或骨髓、血清或血漿、痰、腦脊液、尿及分泌物等。采血液等樣本時，應(yīng)使用一次性密閉容器，如真空采血管。當(dāng)使用非密閉

50、采樣系統(tǒng)時，如尿、分泌物和骨髓的采樣，必須注意防止來自采樣者的皮屑或分泌物的污染。采樣時必須戴一次性手套。 玻璃器皿在使用前應(yīng)高壓處理，因為玻璃器皿常含有不易失活的rna酶。最好是熱滅菌，250烘烤4小時以上可使rna酶永久性失活。 全血和骨髓標(biāo)本必須進(jìn)行抗凝處理。edta和枸櫞酸鹽是首選的抗凝劑。不能使用肝素抗凝，因為肝素是taq酶的強(qiáng)抑制劑，而且在其后的核酸提取步驟中很難去除。 臨床用于rna（如hcvrna）擴(kuò)增檢測的血標(biāo)本建議進(jìn)行抗凝處理，并盡快（3小時以內(nèi)）分離血漿，以避免rna的降解。如未作抗凝處理，則抽血后，必須在1小時內(nèi)分離血清。 （二）標(biāo)本的穩(wěn)定化處理 用于dna擴(kuò)增檢測的標(biāo)

51、本，采集后一般不需要特殊的穩(wěn)定化處理，但標(biāo)本應(yīng)及時送至實驗室。 由于rna易受rna酶的降解，因此用于rna測定的標(biāo)本有時必須進(jìn)行穩(wěn)定化處理，如流行病學(xué)調(diào)查的現(xiàn)場采樣。異硫氰酸胍鹽（guanidinethiocyanate，gitc）可使dna酶和rna酶立即失活，因此在采集標(biāo)本時，可將標(biāo)本材料如血清或血漿按1：4的比例加至含有5mol/lgitc的試管中，從而使血清（漿）中的rna酶不可逆失活。經(jīng)上述穩(wěn)定化處理后，標(biāo)本一般不需要冷藏即可郵寄。對于特定的檢測項目，上述穩(wěn)定化處理方法的效果究竟如何，要使用相應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄pcr測定方法來評價。 （三）標(biāo)本的運送 標(biāo)本采集后必須盡快送至實驗室。經(jīng)過適當(dāng)

52、穩(wěn)定化處理的標(biāo)本可在常溫下通過郵寄運送。如用于dna擴(kuò)增檢測的edta抗凝全血標(biāo)本及用于rna擴(kuò)增檢測的經(jīng)gitc穩(wěn)定化處理的標(biāo)本。通常在運送時，應(yīng)采用不易破碎的容器裝載標(biāo)本。用于rna檢測的標(biāo)本，如果未經(jīng)穩(wěn)定化處理，則必須速凍后，放在干冰中運送。 （四）標(biāo)本的貯存 臨床體液標(biāo)本如血清/血漿等可于-70下長時間貯存。用于dna測定的已純化核酸樣本可在10mmol/ltris-1mmol/ledta緩沖液（ph7.5-8.0）中4保存。用于rna測定的已純化核酸樣本應(yīng)在緩沖液中-80或液氮中貯存。用乙醇沉淀的核酸樣本貯存在-20即可。用gitc處理的rna標(biāo)本在室溫可保存7天。 （五）標(biāo)本的處理

53、（核酸提取） 標(biāo)本處理即核酸提取純化是決定擴(kuò)增檢測成敗的關(guān)鍵性步驟，在使用商品核酸提取試劑提取臨床標(biāo)本中的核酸模板前，應(yīng)對其進(jìn)行充分評價以驗證其提取的有效性。通常，核酸制備質(zhì)量不高是由于抑制物去除不完全所致，抑制物可能來源于標(biāo)本本身（如血紅素及其前體或降解產(chǎn)物）或核酸提取過程中殘留的有機(jī)溶劑（如酚、氯仿等），這些物質(zhì)對其后的taq酶擴(kuò)增反應(yīng)步驟具有強(qiáng)烈的抑制作用，從而影響靶核酸的擴(kuò)增測定。當(dāng)標(biāo)本為痰時，則必須先進(jìn)行液化處理，再提取核酸。需注意的是，液化時不能加熱，液化時間不能過長。此外，當(dāng)靶核酸為rna時，逆轉(zhuǎn)錄pcr測定失敗的常見原因是標(biāo)本在運送前未經(jīng)充分的穩(wěn)定化處理及核酸提取試劑的rna酶

54、的污染。對于前者，要核查測定分析前的步驟，如果發(fā)現(xiàn)有rna降解的證據(jù)，實驗室則應(yīng)拒絕接受標(biāo)本，要求重新采取標(biāo)本，并對運送者給以詳細(xì)的指導(dǎo)。對于后者，建議使用高質(zhì)量的商品核酸提取試劑。 （六）靶核酸的逆轉(zhuǎn)錄（rt）和擴(kuò)增 1、靶rna的逆轉(zhuǎn)錄 cdna合成為逆轉(zhuǎn)錄pcr中的第一個酶反應(yīng)步驟，所產(chǎn)生的cdna為靶rna的反向互補鏈，為后面擴(kuò)增的模板。下述因素通常影響cdna合成的效率：（1）逆轉(zhuǎn)錄效率的降低或完全缺乏。其可能的原因有逆轉(zhuǎn)錄酶質(zhì)量不高、試劑降解變質(zhì)或加樣錯誤等；（2）用于逆轉(zhuǎn)錄的標(biāo)本中存在逆轉(zhuǎn)錄或taq酶的抑制物（如酚、氯仿、血紅素等）；（3）rna酶的存在導(dǎo)致rna的降解。 2、核

55、酸的擴(kuò)增有多種因素可引起核酸擴(kuò)增檢測的假陽性或假陰性結(jié)果，如擴(kuò)增靶核酸中抑制劑存在、taq酶失活、退火溫度不對、mg+濃度不佳、患者標(biāo)本或試劑受污染等。擴(kuò)增儀孔中熱傳導(dǎo)的均一性極為重要，必須定期對擴(kuò)增儀的溫度控制和加熱模塊中熱傳導(dǎo)的一致性進(jìn)行檢查，以避免假陰性結(jié)果。 （七）污染 在實際工作中，常見有以下幾種污染類型。擴(kuò)增片段的污染（產(chǎn)物污染）；天然基因組dna的污染、試劑污染（貯存液或工作液）以及標(biāo)本間交叉污染（如氣溶膠從一個陽性標(biāo)本擴(kuò)散到原本陰性的標(biāo)本）。臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室中污染的最主要來源是擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。由于一旦發(fā)生污染后，再圍繞實驗室來尋找污染源不僅耗時而且還很繁瑣，所以防止污染重在預(yù)防。但如果發(fā)生了污染，實驗