實(shí)驗(yàn)2重組質(zhì)粒的提取及鑒定2015

1、1實(shí)驗(yàn)二重組DNA的提取及酶切鑒定復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心邵紅霞邵紅 2一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆找韵路椒ê图夹g(shù)：掌握以下方法和技術(shù)： 1. 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的小量快速制備的小量快速制備 2. 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的限制性內(nèi)切酶酶切的限制性內(nèi)切酶酶切 3. DNA的瓊脂糖凝膠電泳的瓊脂糖凝膠電泳3二、實(shí)驗(yàn)原理 分離質(zhì)粒分離質(zhì)粒DNA有三個(gè)步驟：有三個(gè)步驟：1. 培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增2. 收集和裂解細(xì)菌（本實(shí)驗(yàn)：收集和裂解細(xì)菌（本實(shí)驗(yàn)：SDS裂解）裂解）3. 分離和純化質(zhì)粒分離和純化質(zhì)粒DNA（本實(shí)驗(yàn)：堿變性法）（本實(shí)驗(yàn)：堿變

2、性法）1. 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的小量快速制備的小量快速制備4堿變性法抽提質(zhì)粒堿變性法抽提質(zhì)粒DNASolution IIpH12.6Solution IIIpH4.8離心后去向離心后去向染色體染色體DNA氫鍵斷裂，雙氫鍵斷裂，雙螺旋解開螺旋解開不能復(fù)性不能復(fù)性沉淀中沉淀中質(zhì)粒質(zhì)粒DNA氫鍵部分?jǐn)嗔眩瑲滏I部分?jǐn)嗔?，cccDNA互補(bǔ)鏈互補(bǔ)鏈不完全分離不完全分離復(fù)性復(fù)性上清中上清中5硅基質(zhì)材料硅基質(zhì)材料(樹脂）與樹脂）與DNA雙鏈相互作用的原理雙鏈相互作用的原理 DNA分子中的磷酸二酯鍵骨架在鹽溶液的作用下分子中的磷酸二酯鍵骨架在鹽溶液的作用下脫水脫水，使，使得暴露的得暴露的磷酸基團(tuán)磷酸基團(tuán)吸附硅膠。雙

3、鏈吸附硅膠。雙鏈DNA分子一旦被硅膠吸分子一旦被硅膠吸附，一般的洗液不能將其洗脫下來，只有水溶性的緩沖液，附，一般的洗液不能將其洗脫下來，只有水溶性的緩沖液，如如TE或水重新或水重新水化水化后，后，DNA才能從層析柱上定量回收。才能從層析柱上定量回收。6 2. 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的限制性內(nèi)切酶酶切的限制性內(nèi)切酶酶切BamH I + Xba I雙酶切（酶切完全時(shí)）雙酶切（酶切完全時(shí)）瓊脂糖凝膠電泳凝膠中瓊脂糖凝膠電泳凝膠中2條區(qū)帶條區(qū)帶3.5kb pSV2載體片段載體片段4.8kb c-myc 目的基因片段目的基因片段pSV-c-mycBamH IXba Ic-myc基因片段基因片段4.8 kbpS

4、V2載體片段載體片段3.5kb7瓊脂糖瓊脂糖海藻中提取的線狀高聚物海藻中提取的線狀高聚物 加熱融化成清澈、透明的溶液加熱融化成清澈、透明的溶液 凝固后成凝膠凝固后成凝膠3. 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳89DNA在凝膠中的遷移率的影響因素 DNA分子的大小分子的大小 瓊脂糖的濃度瓊脂糖的濃度 DNA的構(gòu)象的構(gòu)象 所加電壓所加電壓 嵌入染料的存在嵌入染料的存在 電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度1011不同含量標(biāo)準(zhǔn)的瓊脂糖凝膠的分離范圍不同含量標(biāo)準(zhǔn)的瓊脂糖凝膠的分離范圍瓊脂糖凝膠濃度線狀瓊脂糖凝膠濃度線狀 DNA分子分離范圍分子分離范圍 （%，m/V） （kb） 0.3 5

5、60 0.5 130 0.6 120 0.7 0.812 1.0 0.510 1.2 0.46 1.5 0.24 2.0 0.1312 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的的3種構(gòu)象種構(gòu)象瓊脂糖凝膠電泳凝膠中瓊脂糖凝膠電泳凝膠中1、2、3條帶都有可能條帶都有可能共價(jià)閉合環(huán)形共價(jià)閉合環(huán)形DNA開環(huán)開環(huán)DNA線性線性DNA存在復(fù)制中間體可能存在復(fù)制中間體可能13DNA瓊脂糖凝膠電泳緩沖液141%瓊脂糖凝膠電泳中：瓊脂糖凝膠電泳中：溴酚藍(lán)遷移速率約與溴酚藍(lán)遷移速率約與300bp的線狀雙鏈的線狀雙鏈DNA相同；相同；二甲苯氰二甲苯氰FF約與長約與長4000bp的的DNA相同相同增加樣品密度，以確保增加樣品密度，以確保DN

6、A均勻進(jìn)入樣品孔里均勻進(jìn)入樣品孔里使樣品呈現(xiàn)顏色使樣品呈現(xiàn)顏色在電場中可預(yù)知速率（向陽極涌動(dòng)的染料）在電場中可預(yù)知速率（向陽極涌動(dòng)的染料）15三、實(shí)驗(yàn)器材與試劑（詳見實(shí)驗(yàn)講義）16四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟（詳見實(shí)驗(yàn)講義）（詳見實(shí)驗(yàn)講義）1. 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的小量快速制備的小量快速制備（AXYGEN AxyPrep質(zhì)粒質(zhì)粒DNA小量制備試劑盒小量制備試劑盒）注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)： 1. 首次使用前，將首次使用前，將RNaseA全部加入全部加入Buffer S1中，中，4 貯存貯存 2.首次使用前，首次使用前，Buffer W2 concentrate 中加入指定體積的無水乙醇中加入指定體積的無水乙

7、醇 3. 使用前檢查使用前檢查Buffer S2是否出現(xiàn)沉淀，若有應(yīng)在是否出現(xiàn)沉淀，若有應(yīng)在37加熱溶解并冷卻加熱溶解并冷卻至室溫使用至室溫使用 4. 自行準(zhǔn)備無核酸和核酸酶污染的自行準(zhǔn)備無核酸和核酸酶污染的tip頭和離心管頭和離心管 5. Buffer S2使用后立即蓋緊瓶蓋，以免空氣中的使用后立即蓋緊瓶蓋，以免空氣中的CO2中和中和Buffer S2中中的的NaOH，降低溶菌效率，降低溶菌效率17將細(xì)菌培養(yǎng)物全部倒入將細(xì)菌培養(yǎng)物全部倒入15ml離心管，離心管，4500rpm，5min加加250 l Buffer S1，吹打混勻（也可，吹打混勻（也可Vortex）以充分懸浮細(xì)菌，轉(zhuǎn)入）以充分

8、懸浮細(xì)菌，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管離心管加加250 l Buffer S2，上下顛倒，溫和混勻，上下顛倒，溫和混勻46次使菌體裂解次使菌體裂解加加350 l Buffer S3，上下顛倒，溫和混勻，上下顛倒，溫和混勻68次，次，12000g 離心離心10min吸取上清至已置于吸取上清至已置于 2ml 離心管的制備管中，離心管的制備管中，12000g離心離心1min，棄濾液，棄濾液同上，在制備管中加同上，在制備管中加500 l Buffer W1， 12000g離心離心1min ，棄濾液，棄濾液在制備管中加在制備管中加700 l Buffer W2， 12000g 離心離心1min ，棄，棄濾液，重

9、復(fù)以濾液，重復(fù)以Buffer W2洗滌（離心）一次，再空離心洗滌（離心）一次，再空離心1次次將制備管移入新的將制備管移入新的1.5ml離心管，在膜中央加離心管，在膜中央加60 l Eluent或去或去離子水，室溫靜置離子水，室溫靜置1min， 12000g離心離心1min，即為質(zhì)粒，即為質(zhì)粒DNA。避免劇烈搖晃，此步驟不宜超過避免劇烈搖晃，此步驟不宜超過5min避免劇烈搖晃避免劇烈搖晃Eluent液液65度溫育可提高洗脫效率度溫育可提高洗脫效率請(qǐng)保持同步！請(qǐng)保持同步！離心機(jī)配平離心機(jī)配平棄上清，瀝干，注意細(xì)菌沉淀別倒掉了！棄上清，瀝干，注意細(xì)菌沉淀別倒掉了！182. 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的限制性內(nèi)切

10、酶的雙酶切的限制性內(nèi)切酶的雙酶切Buffer 4 2 lBamH(20U/ l) 1 lXba(20 U/ l) 1 ldd H2O 10l質(zhì)粒質(zhì)粒DNA 6l 20 l混勻后短暫離心，混勻后短暫離心，37 水浴水浴1小時(shí)小時(shí)注意：注意：1. 加樣順序加樣順序2. 保證每樣試劑加入反應(yīng)體系保證每樣試劑加入反應(yīng)體系3. 乙酰化乙?；疊SA可不加可不加4. 加樣完成后需混勻，短暫離心加樣完成后需混勻，短暫離心5. 反應(yīng)結(jié)束反應(yīng)結(jié)束后，上樣電泳前需后，上樣電泳前需短短暫暫離心，再加凝膠離心，再加凝膠加樣緩沖液加樣緩沖液6. 及時(shí)將酶放回及時(shí)將酶放回-20 冰箱以保冰箱以保證酶的活力證酶的活力19準(zhǔn)備

11、好制膠器，插好梳子準(zhǔn)備好制膠器，插好梳子并保證梳子距底部并保證梳子距底部0.5mm-1.2mm灌膠（事先加灌膠（事先加GelRed）注）注意趕氣泡意趕氣泡待凝待凝準(zhǔn)備好凝膠，加熱熔解準(zhǔn)備好凝膠，加熱熔解20注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：1. 標(biāo)液面高度以觀察水分是否蒸發(fā)標(biāo)液面高度以觀察水分是否蒸發(fā)過多，若溶解后水分蒸發(fā)過多，過多，若溶解后水分蒸發(fā)過多，補(bǔ)水補(bǔ)水2. 三角燒瓶上覆三角燒瓶上覆打過洞打過洞的保鮮膜的保鮮膜（防水蒸發(fā)）（防水蒸發(fā)）3. 防爆沸和燙傷防爆沸和燙傷（帶手套）（帶手套）4. 加加6l GelRed后立即灌膠（戴手后立即灌膠（戴手套）套）稱量稱量agarose加入加入TAE 60ml，

12、勿晃勿晃微波爐溶膠微波爐溶膠注意先做好制膠準(zhǔn)備！注意先做好制膠準(zhǔn)備！1%agarose凝膠1%agarose凝膠21在電泳槽內(nèi)加電泳緩沖液在電泳槽內(nèi)加電泳緩沖液拔去加樣梳，將制好的凝拔去加樣梳，將制好的凝膠連同內(nèi)架放入電泳槽內(nèi)，膠連同內(nèi)架放入電泳槽內(nèi)，保證液面高于保證液面高于凝膠面凝膠面加入加入6 凝膠加樣緩沖液凝膠加樣緩沖液和和DNA（1:5比例混合）比例混合）依次加樣，并加好依次加樣，并加好Marker連通電源，連通電源，80V電泳至溴電泳至溴酚藍(lán)帶達(dá)到凝膠的酚藍(lán)帶達(dá)到凝膠的1/2處處結(jié)果觀察和記錄結(jié)果觀察和記錄DNA從陰極向陽極遷移從陰極向陽極遷移EBr從陽極向陰極遷移從陽極向陰極遷移（

13、加樣后不能移動(dòng)電泳槽?。訕雍蟛荒芤苿?dòng)電泳槽！）22凝膠成像及分析系統(tǒng)凝膠成像及分析系統(tǒng)233. DNA的的1%瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳制膠：制膠：1% agarose ，防過熱暴沸，防過熱暴沸上樣準(zhǔn)備上樣準(zhǔn)備 （1份凝膠加樣緩沖液加份凝膠加樣緩沖液加5份份DNA）上樣和電泳上樣和電泳: : 每組上樣每組上樣2個(gè)（個(gè)（ 未酶解質(zhì)粒和雙酶切產(chǎn)物）未酶解質(zhì)粒和雙酶切產(chǎn)物） 未酶解質(zhì)粒未酶解質(zhì)粒10 l +2 l凝膠加樣緩沖液凝膠加樣緩沖液 雙酶切產(chǎn)物雙酶切產(chǎn)物20 l +4 l凝膠加樣緩沖液凝膠加樣緩沖液 Marker5l, 放中間，放中間，2組組1塊膠塊膠 各組先做好準(zhǔn)備，兩組統(tǒng)一集中上樣

14、后電泳各組先做好準(zhǔn)備，兩組統(tǒng)一集中上樣后電泳 電泳槽和電泳儀不可移動(dòng)電泳槽和電泳儀不可移動(dòng)24 未酶切酶切未酶切酶切Marker10 l+2 l 20 l +4 l10 l+2 l 20 l +4 l5 l4. 結(jié)果觀察和記錄結(jié)果觀察和記錄80100V電泳，直到溴酚藍(lán)帶泳動(dòng)到凝膠的電泳，直到溴酚藍(lán)帶泳動(dòng)到凝膠的1/2至至2/3處處停止。停止。紫外燈下觀察，拍照記錄。紫外燈下觀察，拍照記錄。上樣圖示：上樣圖示：25預(yù)期結(jié)果預(yù)期結(jié)果未酶切質(zhì)粒對(duì)照組雙酶切實(shí)驗(yàn)組雙酶切實(shí)驗(yàn)組雙酶切對(duì)照組雙酶切未酶切質(zhì)粒Marker26未酶切質(zhì)粒對(duì)照組雙酶切實(shí)驗(yàn)組雙酶切DNA/Hind Marker-23130-941

15、6-6557-4361-2027-23221%agarose凝膠電泳27發(fā)散性思考：發(fā)散性思考：1.1.為何細(xì)菌平板上的長出的細(xì)菌集合是單克隆（一個(gè)細(xì)菌為何細(xì)菌平板上的長出的細(xì)菌集合是單克?。ㄒ粋€(gè)細(xì)菌來源）的？請(qǐng)例舉可能的解釋來支持或反對(duì)這一說法。來源）的？請(qǐng)例舉可能的解釋來支持或反對(duì)這一說法。2.2.為何線性的質(zhì)粒不易轉(zhuǎn)入細(xì)菌內(nèi)，如何從機(jī)理上解釋，為何線性的質(zhì)粒不易轉(zhuǎn)入細(xì)菌內(nèi)，如何從機(jī)理上解釋，從實(shí)驗(yàn)中證明？連接時(shí)是否會(huì)出現(xiàn)多聚體？從實(shí)驗(yàn)中證明？連接時(shí)是否會(huì)出現(xiàn)多聚體？思考與疑問：思考與疑問：1.1. 做感受態(tài)時(shí)，為何要在冰浴下進(jìn)行？做感受態(tài)時(shí)，為何要在冰浴下進(jìn)行？是否還有其他可能原因是否還有其他可能原因 為了讓細(xì)胞膜流動(dòng)性降低，利于為了讓細(xì)胞膜流動(dòng)性降低，利于DNADNA的結(jié)合，同時(shí)使細(xì)胞暫停生長，的結(jié)合，同時(shí)使細(xì)胞暫停生長，維持在對(duì)數(shù)生長期的高活性維持在對(duì)數(shù)生長期的高活性 全程在冰浴下進(jìn)行，反復(fù)凍融會(huì)使細(xì)菌細(xì)胞破裂全程在冰浴下進(jìn)行，反復(fù)凍融會(huì)使細(xì)菌細(xì)胞破裂2. 2. 為何細(xì)菌平板倒過來生長更好？為何細(xì)菌平板倒過來生長更好？是否還有其他可能原因是否還有其他可能原因 微生物培養(yǎng)時(shí)一般培養(yǎng)基中的水分含量較高，且培養(yǎng)溫度一般較高，微生物培養(yǎng)時(shí)一般培養(yǎng)基中的水分含量較高，且培養(yǎng)溫度一般較高，如果不將培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)，培養(yǎng)基中的水分會(huì)揮發(fā)出來，造成培養(yǎng)基中的水如果不將培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)，