第15章-流式細胞儀教學(xué)指導(dǎo)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上第十五章 流式細胞儀1基本要求 1.1了 解(1) 流式細胞儀的發(fā)展史(2) 流式細胞儀測量數(shù)據(jù)的存貯、顯示與分析1.2 熟 悉(1) 流式細胞儀的主要性能指標(biāo)有哪些?這些指標(biāo)的作用、測量方法和影響因素是什么?(2) 流式細胞儀操作技術(shù)的質(zhì)量控制主要涉及那幾個方面？(3) 流式細胞儀出現(xiàn)故障及排除方法是什么?(4) 流式細胞儀主要應(yīng)用哪些領(lǐng)域？1.3 掌 握(1) 什么是流式細胞技術(shù)和流式細胞儀？(2) 流式細胞儀的工作原理是什么？(3) 簡述流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)？(4) 流式細胞儀的液流系統(tǒng)由哪幾部分組成？(5) 流式細胞儀的流動室通常由什么材料制成？(6) 流式細

2、胞儀的光源有什么特點？(7) 流式細胞儀的光學(xué)系統(tǒng)組成和各種濾光片的作用是什么?(8) 流式細胞儀所檢測的信號有哪些？(9)流式細胞儀信號所代表的意義、作用、測量方式和校正方法是什么？(10)流式細胞儀分選器的組成、細胞分選原理和影響因素是什么？2重點難點 2.1重 點(1) 流式細胞儀和流式細胞技術(shù)的基本概念(2) 流式細胞儀的工作原理(3) 流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)(4) 流式細胞儀所檢測的信號有哪些？(5) 流式細胞儀信號所代表的意義、作用、測量方式和校正方法是什么？(6) 流式細胞儀分選器的組成、細胞分選原理和影響因素2.2 難點(1) 流式細胞儀信號所代表的意義、作用、測量方式和校正方法

3、是什么？(2) 流式細胞儀分選器的組成、細胞分選原理和影響因素(3) 流式細胞儀的主要性能指標(biāo)有哪些?這些指標(biāo)的作用、測量方法和影響因素是什么?3講授學(xué)時 建議6學(xué)時8學(xué)時4內(nèi)容提要 4.1 流式細胞儀基本原理生物學(xué)顆粒分析原理 流式細胞技術(shù)是在單細胞水平上，對于處在快速直線流動狀態(tài)中的大量細胞或生物顆粒進行多參數(shù)、快速的定量分析和分選的技術(shù)，現(xiàn)已成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究最先進的分析技術(shù)之一。應(yīng)用流式細胞儀對于處在快速直線流動狀態(tài)中的細胞或生物顆粒進行快速的、多參數(shù)的定量分析和分選的技術(shù)稱為流式細胞術(shù)。 生物學(xué)顆粒包括大的免疫復(fù)合物、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、病毒顆粒、脂質(zhì)體、細胞器、細菌、霉菌、染色體

4、、真核細胞、雜交細胞、聚集細胞等，所檢測的生物顆粒的理化性質(zhì)包括細胞大小、細胞形態(tài)、胞漿顆?；潭?、DNA含量、總蛋白質(zhì)含量、細胞膜完整性和酶活性等。 流式細胞儀是以激光為光源，集流體力學(xué)技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)、計算機技術(shù)以及細胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的新型高科技儀器。 流式細胞儀是在熒光顯微鏡技術(shù)、血細胞計數(shù)儀和噴墨技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。 鞘液和樣品流在噴嘴附近組成一個圓柱流束，與水平方向的激光束垂直相交，染色的細胞受激光照射后發(fā)出熒光，這些信號分別被光電倍增管熒光檢測器和光電二極管散射光檢測器接收，經(jīng)過計算機儲存、計算、分析這些數(shù)字化信息，就可得到細胞的大小、活性、

5、核酸含量、酶和抗原的性質(zhì)等物理和生化指標(biāo)。流式細胞儀細胞分選原理在壓電晶體上加上頻率為30kHz的信號，使液柱斷裂成一連串均勻的液滴。當(dāng)某類細胞的特性與要分選的細胞相同時，流式細胞儀就會在這類細胞形成液滴時給含有這類細胞的液滴充以特定的電荷，帶有電荷的液滴向下落入偏轉(zhuǎn)板間的靜電場時，依所帶電荷的符號分別向左偏轉(zhuǎn)或向右偏轉(zhuǎn)，落入指定的收集器內(nèi)，從而達到細胞分類收集的目的。4.2 流式細胞儀的結(jié)構(gòu)流式細胞儀的結(jié)構(gòu)可分為流動室及液流驅(qū)動系統(tǒng)；激光光源及光束成形系統(tǒng)；光學(xué)系統(tǒng)；信號檢測與分析系統(tǒng)；細胞分選系統(tǒng)等五個部分。流式細胞儀流動室與液流驅(qū)動系統(tǒng)流動室是FCM的核心部件，被測樣品在此與激光束相交。

6、流動室內(nèi)充滿了鞘液,鞘液的作用是將樣品流環(huán)包。流式細胞儀激光光源與光束成形系統(tǒng)激光是細胞微弱熒光快速分析的理想光源。激光光束在到達流動室前，先經(jīng)過透鏡將其聚焦，形成幾何尺寸約為22m×66m即短軸稍大于細胞直徑的光斑。流式細胞儀光學(xué)系統(tǒng)FCM的光學(xué)系統(tǒng)是由若干組透鏡、濾光片和小孔組成，它們分別將不同波長的熒光信號送入不同的電子探測器。作為FCM光學(xué)系統(tǒng)中的主要光學(xué)元件的濾光片，主要分為長通濾片、短通濾片和帶通濾片三類。長通濾光片 短通濾光片帶通濾光片流式細胞儀信號檢測與分析（1）散射光信號 散射光分為前向角散射和側(cè)向角散射，散射光不依賴任何細胞樣品的制備技術(shù)(如染色)，稱為細胞的物理

7、參數(shù) 前向角散射 前向角散射與被測細胞的大小有關(guān)，確切地說與細胞直徑的平方密切相關(guān)。 側(cè)向角散射 側(cè)向角散射是指與激光束正交900方向的散射光信號。側(cè)向散射光對細胞膜、細胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感，可提供細胞內(nèi)精細結(jié)構(gòu)和顆粒性質(zhì)的信息。（2）熒光信號 當(dāng)激光光束與細胞正交時，一般會產(chǎn)生兩種熒光信號。一種是細胞自身在激光照射下發(fā)出微弱的熒光信號，稱為細胞自發(fā)熒光；另一種是經(jīng)過特異熒光素標(biāo)記細胞后，受激發(fā)照射得到的熒光信號，通過對這類熒光信號的檢測和定量分析能了解所研究細胞的存在和定量。 熒光信號線性測量和對數(shù)測量： 熒光信號的面積和寬度 光譜重疊的校正從下圖可以看出，陰影為探測器檢測光譜的范圍，

8、FITC探測器會探測到少量的PE光譜，而PE探測器則檢測到較多的FITC光譜?？朔@種誤差的最有效方法是使用熒光補償電路，利用已知標(biāo)準(zhǔn)樣品或熒光小珠，可合理設(shè)置熒光信號的補償值。下圖中點A通過透鏡f成像在A處，而點B通過透鏡f成像在B處。在光電倍增管前放上一小孔，作為空間濾波器，排除其它雜散光信號，從而確保了A點光源進不了B點處，B點光源也進不了A點處。因此，避免第一激光(488nm)激發(fā)出的FL1，F(xiàn)L2，F(xiàn)L3和第二激光(635nm) 激發(fā)出的FL4間的補償。當(dāng)然FL1，F(xiàn)L2和FL3是來自于同一點光源，它們之間的補償是不可避免的。流式細胞儀細胞分選器細胞分選器由水滴形成、充電及偏轉(zhuǎn)三部分

9、組成。（1）水滴的形成 安裝在流動室上的壓電晶體加有數(shù)萬赫茲的電信號，于是壓電晶體帶動流動室一起振動。液流從噴孔出來后，需要經(jīng)過一段距離才被破壞形成水滴。 （2）水滴的充電 給水滴充電的脈沖并不是在做出分選決定時立即產(chǎn)生并加到流束上的，而是當(dāng)細胞達到分離點時才加上的。 （3）水滴的偏轉(zhuǎn) 當(dāng)水滴從流束上將要斷開時給整個流束充電，則水滴從流束上斷開后便帶有同極性的多余表面電荷，在電場中偏向與其有相反電荷的電極板而被分選。4.3 流式細胞儀的主要性能指標(biāo) 靈敏度靈敏度的高低是衡量儀器檢測微弱熒光信號的重要指標(biāo)。一般以能檢測到單個微球上最少標(biāo)有FITC或PE熒光分子數(shù)目來表示，現(xiàn)在的FCM均可達到檢測

10、小于100個熒光分子的指標(biāo)。前向角散射光檢測靈敏度是指能夠檢測到的最小顆粒大小，一般目前商品化的FCM可以測量到0.2m0.5m左右。儀器的分辨率分辨率是衡量儀器測量精度的指標(biāo)，通常用變異系數(shù)CV(Coefficient of Variation)值表示。分析速度一般可達到3000個/秒6000個/秒左右，大型機已達到每秒幾萬個細胞。分選指標(biāo)分選指標(biāo)主要包括分選速度、分選純度和分選收獲率。4.4 流式細胞儀應(yīng)用的技術(shù)要求 檢測樣品制備的重要性如果兩個或多個細胞間粘連重疊或細胞碎片過多，都會影響信號的收集及所收集信號的真實性，所以制備單細胞懸液是進行流式細胞儀分析最關(guān)鍵的第一步。 免疫分析中常用的熒光染料與標(biāo)記染色熒光信號來自于細胞的自發(fā)熒光或被分析細胞經(jīng)特異性熒光標(biāo)記染色后通過激光束激發(fā)后所產(chǎn)生的。因此，被分析細胞在制備成單細胞懸液后，經(jīng)過與熒光染料染色后才能上機進行檢測。 流式細胞儀操作技術(shù)的質(zhì)量控制光路與流路校正 CV值越小，則儀器工作狀態(tài)精度越高。CV值一般在23左右，不超過510。PMT校準(zhǔn) 對光電倍增管的校正是流式細胞儀在使用前進行的一項重要質(zhì)控指標(biāo)。絕對計數(shù)的校準(zhǔn) 在進行免疫學(xué)檢測時，常需對測定細胞進行絕對計