透析和超濾課件

1、河北大學生命科學學院河北大學生命科學學院透析和超濾透析和超濾 (Dialysis and Ultrafiltration)河北大學生命科學學院河北大學生命科學學院n1透析是利用蛋白質等透析是利用蛋白質等生物大分子不能透過半生物大分子不能透過半透膜透膜而進行純化的一種方法。有以下幾種方法：而進行純化的一種方法。有以下幾種方法：q脫鹽透析：脫鹽透析：將含鹽的生物大分子溶液裝入透析袋內。將含鹽的生物大分子溶液裝入透析袋內。并將袋口扎好放入裝有蒸餾水的大容器中，用攪拌方并將袋口扎好放入裝有蒸餾水的大容器中，用攪拌方法使蒸餾水不斷流動經過一段時間后，透析袋內除大法使蒸餾水不斷流動經過一段時間后，透析袋內

2、除大分子外，小分子鹽類透過半透膜進入蒸餾水中，使膜分子外，小分子鹽類透過半透膜進入蒸餾水中，使膜內外鹽濃度達到平衡。如在透析過程中更換幾次大容內外鹽濃度達到平衡。如在透析過程中更換幾次大容器中的液體，可以使透析袋內的溶液達到脫鹽的目的。器中的液體，可以使透析袋內的溶液達到脫鹽的目的。脫鹽透析脫鹽透析是應用最廣泛的一種透析方法。是應用最廣泛的一種透析方法。透析透析河北大學生命科學學院河北大學生命科學學院q平衡透析：平衡透析：也是常用的透析方法之一。方法也是常用的透析方法之一。方法是將裝有生物大分子的透析袋裝入盛有一定是將裝有生物大分子的透析袋裝入盛有一定濃度的鹽溶液或緩沖液的大容器中，經過透濃度

3、的鹽溶液或緩沖液的大容器中，經過透析，袋內外的鹽濃度（或緩沖液析，袋內外的鹽濃度（或緩沖液pH）一致，）一致，從而有控制地改變被透析溶液的鹽濃度（或從而有控制地改變被透析溶液的鹽濃度（或pH）。）。河北大學生命科學學院河北大學生命科學學院q反透析：反透析：將透析袋放入高濃度吸水性強的多聚物溶將透析袋放入高濃度吸水性強的多聚物溶液中，透析袋內溶液中的水便迅速被袋外多聚物所液中，透析袋內溶液中的水便迅速被袋外多聚物所吸收，從而達到袋內液體濃縮的目的。這種方法稱吸收，從而達到袋內液體濃縮的目的。這種方法稱為為“反透析反透析”?？捎米龇赐肝龅亩嗑畚锟捎米龇赐肝龅亩嗑畚镉芯垡叶加芯垡叶迹≒olyet

4、hylene glycol, PEG）、聚乙烯吡咯烷酮）、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinyl Pyrrolidone, PVP）、右旋糖、蔗糖）、右旋糖、蔗糖等。等。n透析用的半透膜很多，玻璃紙、棉膠、動物膜、透析用的半透膜很多，玻璃紙、棉膠、動物膜、皮紙等都可用來制作半透膜。皮紙等都可用來制作半透膜。河北大學生命科學學院河北大學生命科學學院河北大學生命科學學院河北大學生命科學學院n2透析膜的種類：透析膜的種類：可用動物膜和玻璃紙等，可用動物膜和玻璃紙等，但用的最多的還是用纖維素制成的透析膜，但用的最多的還是用纖維素制成的透析膜， 截留分子量截留分子量MwCO（即留在透析袋內的生物大（即留在透

5、析袋內的生物大分子的最小分子量，縮寫為分子的最小分子量，縮寫為MwCO）通常為）通常為1 萬左右。萬左右。n商品透析袋制成管狀，為防干裂，商品透析袋制成管狀，為防干裂，出廠時都用出廠時都用10的甘油處理過，并含有極微量的硫化物的甘油處理過，并含有極微量的硫化物(0.1%)、重金屬和一些具有紫外吸收的雜質、重金屬和一些具有紫外吸收的雜質，用前必須除去。用前必須除去。河北大學生命科學學院河北大學生命科學學院n3 透析袋的處理透析袋的處理：n方法一：方法一：可先用可先用50乙醇煮沸乙醇煮沸1小時，再依次用小時，再依次用50乙醇、乙醇、0.01 mol/L碳酸氫鈉和碳酸氫鈉和0.001 mol/L E

6、DTA溶液洗滌，最溶液洗滌，最后用蒸餾水沖洗即可使用。（后用蒸餾水沖洗即可使用。（50乙醇處理對除去具有紫乙醇處理對除去具有紫外吸收的雜質特別有效。）外吸收的雜質特別有效。）n方法二：方法二：也可用蒸餾水將透析袋煮沸也可用蒸餾水將透析袋煮沸15分鐘，用蒸餾水徹分鐘，用蒸餾水徹底清洗后即可使用。底清洗后即可使用。n從此從此 時起取用透析袋必須戴手套（或洗干凈手）。時起取用透析袋必須戴手套（或洗干凈手）。n使用后的透析袋洗凈后可存于使用后的透析袋洗凈后可存于4蒸餾水中，確保透析袋蒸餾水中，確保透析袋始終浸沒在溶液內。用時必須仔細檢查，不漏時方可重復始終浸沒在溶液內。用時必須仔細檢查，不漏時方可重復

7、使用。使用。n若長時間不用，可加少量若長時間不用，可加少量NaN3，以防長菌。，以防長菌。河北大學生命科學學院河北大學生命科學學院n4透析方法：透析方法：n使用時，先檢查透析袋是否完好無損？使用時，先檢查透析袋是否完好無損？n裝量：通常要留三分之一至一半的空間，以防裝量：通常要留三分之一至一半的空間，以防透析過程中，透析的小分子量較大時，袋外的透析過程中，透析的小分子量較大時，袋外的水和緩沖液過量進入袋內水和緩沖液過量進入袋內 將袋漲破。將袋漲破。n為了加快透析速度，除多次更換透析液外，還為了加快透析速度，除多次更換透析液外，還可使用磁子攪拌。透析的容器要大一些，可使用磁子攪拌。透析的容器要大

8、一些， 可以可以使用大燒杯、大量筒和塑料桶。使用大燒杯、大量筒和塑料桶。n 檢查透析效果的方法是：用檢查透析效果的方法是：用1 BaCl2檢查檢查(NH4)2SO4，用，用1 AgNO3 檢查檢查NaCl、KCl等。等。河北大學生命科學學院河北大學生命科學學院超過濾超過濾n 1.超濾法是利用具有一定大小孔徑的微孔濾膜，超濾法是利用具有一定大小孔徑的微孔濾膜，對生物大分子溶液進行過濾（常壓、加壓或減對生物大分子溶液進行過濾（常壓、加壓或減壓），使大分子保留在超濾膜上面的溶液中，壓），使大分子保留在超濾膜上面的溶液中，小分子物質及水過濾出去，從而達到脫鹽、更小分子物質及水過濾出去，從而達到脫鹽、更

9、換緩沖液或濃縮的目的。這種利用超濾膜過濾換緩沖液或濃縮的目的。這種利用超濾膜過濾分離大分子和小分子物質的方法叫做超濾法分離大分子和小分子物質的方法叫做超濾法河北大學生命科學學院河北大學生命科學學院河北大學生命科學學院河北大學生命科學學院離子交換柱層析法分離蛋白質離子交換柱層析法分離蛋白質n層析技術常用。層析技術常用。n層析系統包括兩個相，一為固定相，一為流動相。當層析系統包括兩個相，一為固定相，一為流動相。當以流動相流過加有樣品的固定相時，由于樣品各組分以流動相流過加有樣品的固定相時，由于樣品各組分的理化性質（的理化性質（吸附力、分子形狀和大小、分子極性、吸附力、分子形狀和大小、分子極性、分子

10、親和力、分配系數等分子親和力、分配系數等）的差異，受固定相的阻力）的差異，受固定相的阻力與流動相的推力的影響不同，因而各組分在固定相與與流動相的推力的影響不同，因而各組分在固定相與流動相之間的分配也不同，從而使各組分以不同的速流動相之間的分配也不同，從而使各組分以不同的速度移動而達到分離的目的。度移動而達到分離的目的。 河北大學生命科學學院河北大學生命科學學院n1按固定相和流動相所處的狀態(tài)分類：可以分為液按固定相和流動相所處的狀態(tài)分類：可以分為液相層析和氣相層析。相層析和氣相層析。n2按層析原理分類按層析原理分類 ：n(1)吸附層析吸附層析(Adsorption Chromatography)

11、n(2)分配層析分配層析(Partition Chromatography)n(3)離子交換層析離子交換層析(Ion Exchanger Chromatography)n(4)凝膠層析凝膠層析(Gel Chromatography)n(5)親和層析親和層析(Affinity Chromatography) 河北大學生命科學學院河北大學生命科學學院n3按操作方式不同分類按操作方式不同分類 n(1)紙層析紙層析(Paper Chromatography) n(2)薄層層析薄層層析(Thin Layer Chromatography) 。 n(3)柱層析柱層析(colunm Chromatograp

12、hy) 河北大學生命科學學院河北大學生命科學學院n4 離子交換柱層析離子交換柱層析n是利用離子交換劑對各種離子有不同的親和力，是利用離子交換劑對各種離子有不同的親和力，來分離混合物中各種離子的層析技術。來分離混合物中各種離子的層析技術。河北大學生命科學學院河北大學生命科學學院n離子交換劑是由不溶于水的離子交換劑是由不溶于水的基質基質和共價結合在和共價結合在基質（母體）上的基質（母體）上的帶電功能基團帶電功能基團組成。帶電功組成。帶電功能基團上還結合有可以移動的、與功能基團帶能基團上還結合有可以移動的、與功能基團帶相反電荷的反離子。反離子可以被帶同種電荷相反電荷的反離子。反離子可以被帶同種電荷的

13、其他離子取代而發(fā)生可逆的離子交換，這個的其他離子取代而發(fā)生可逆的離子交換，這個過程中基質的性質不發(fā)生改變。過程中基質的性質不發(fā)生改變。河北大學生命科學學院河北大學生命科學學院n可分幾類：可分幾類：n離子交換纖維素離子交換纖維素：在纖維素分子結構上，連接：在纖維素分子結構上，連接一定的離子交換基團生成的離子交換纖維素。一定的離子交換基團生成的離子交換纖維素。如如DEAE-纖維素纖維素(二乙基氨乙基纖維素，二乙基氨乙基纖維素，-OCH2CH2N+H（C2H5）2)、羧甲基、羧甲基(CM)纖纖維素維素 河北大學生命科學學院河北大學生命科學學院n離子交換樹脂：離子交換樹脂：以不溶性的人工合成高分子為以

14、不溶性的人工合成高分子為母體的母體的離子交換樹脂離子交換樹脂，如聚苯乙烯樹脂等。，如聚苯乙烯樹脂等。n離子交換凝膠離子交換凝膠：以凝膠為母體，如葡聚糖，結：以凝膠為母體，如葡聚糖，結合一定的離子基團生成的離子交換葡聚糖凝膠；合一定的離子基團生成的離子交換葡聚糖凝膠；瓊脂糖等。如瓊脂糖等。如DEAE-Sephadex A25、A50，CM-Sephadex C25。河北大學生命科學學院河北大學生命科學學院n離子交換劑的作用原理如下：離子交換劑的作用原理如下： n陽離子交換劑分子中具有酸性基團，能和流動陽離子交換劑分子中具有酸性基團，能和流動相中的陽離子進行交換。相中的陽離子進行交換。 n RS03- H+ + Na+ = RS03- Na+ + H+ n陰離子交換劑分子中具有堿性基團，能和流動陰離子交換劑分子中具有堿性基團，能和流動相中的陰離子進行交換。相中的陰離子進行交換。 n RN+ (CH3)30H- + Cl-=RN+( CH3)3C1- + OH-河北大學生命科學學院河北大學生命科學學院n離子交換劑的選擇離子交換劑的選擇河北大學生命科學學院河北大學生命科學學院操