細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)(一)

1、1細(xì)胞生物技術(shù)細(xì)胞生物技術(shù)2主主 要要 內(nèi)內(nèi) 容容第一節(jié)第一節(jié) 培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)第二節(jié)第二節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)第三節(jié)第三節(jié) 顯微鏡知識(shí)顯微鏡知識(shí)第四節(jié)第四節(jié) 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)3第一節(jié)第一節(jié)培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)4主要內(nèi)容主要內(nèi)容（一）體內(nèi)、外細(xì)胞的差異（二）體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型 （三）培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖過(guò)程 5 體外培養(yǎng)的細(xì)胞和體內(nèi)細(xì)胞的比較體外培養(yǎng)的細(xì)胞和體內(nèi)細(xì)胞的比較 相似：相似：仍存在仍存在細(xì)胞細(xì)胞和和細(xì)胞細(xì)胞、 細(xì)胞細(xì)胞和和基質(zhì)基質(zhì)的的相互關(guān)系相互關(guān)系 單個(gè)細(xì)胞雖能生長(zhǎng)繁殖單個(gè)細(xì)胞雖能生長(zhǎng)繁殖, 但但不如群體細(xì)胞能力強(qiáng)不如群

2、體細(xì)胞能力強(qiáng)， 當(dāng)相鄰細(xì)胞接觸，便導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)停止當(dāng)相鄰細(xì)胞接觸，便導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)停止 細(xì)胞相互溝通生物信息細(xì)胞相互溝通生物信息的結(jié)果的結(jié)果 對(duì)對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)仍有依存性仍有依存性 差異：差異：失去失去原有組織結(jié)構(gòu)原有組織結(jié)構(gòu)和和細(xì)胞形態(tài)細(xì)胞形態(tài)， 分化減弱或分化減弱或不明顯不明顯 6 細(xì)胞外基質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì) 存在于組織中，存在于組織中，由細(xì)胞合成由細(xì)胞合成并分泌至胞外的成分，并分泌至胞外的成分，分布在分布在細(xì)胞表面細(xì)胞表面或或細(xì)胞之間細(xì)胞之間的大分子，包括的大分子，包括纖維性纖維性成分成分(膠原蛋白、彈性蛋白和網(wǎng)織蛋白膠原蛋白、彈性蛋白和網(wǎng)織蛋白)、連接蛋白連接蛋白(纖維粘連蛋白、層粘連蛋白纖維粘

3、連蛋白、層粘連蛋白)和和空間充填分子空間充填分子(主要主要為糖胺聚糖為糖胺聚糖)等，其對(duì)細(xì)胞增殖和分化發(fā)揮重要調(diào)控等，其對(duì)細(xì)胞增殖和分化發(fā)揮重要調(diào)控作用。作用。 這些物質(zhì)構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，這些物質(zhì)構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，支持并連接支持并連接組織結(jié)組織結(jié)構(gòu)、構(gòu)、調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)組織的發(fā)生組織的發(fā)生和和細(xì)胞的生理活動(dòng)細(xì)胞的生理活動(dòng)。 71影響細(xì)胞的存活、生長(zhǎng)與死亡影響細(xì)胞的存活、生長(zhǎng)與死亡 正常真核細(xì)胞，大多須粘附于特定的正常真核細(xì)胞，大多須粘附于特定的細(xì)胞外基質(zhì)上才能細(xì)胞外基質(zhì)上才能抑制凋亡而存活抑制凋亡而存活，稱，稱為定著依賴性（為定著依賴性（anchorage dependence）。）。例如，例如，

4、上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞一旦脫離了一旦脫離了細(xì)胞外基質(zhì)則會(huì)發(fā)生程序性死亡。細(xì)胞外基質(zhì)則會(huì)發(fā)生程序性死亡。82決定細(xì)胞的形狀決定細(xì)胞的形狀 細(xì)胞呈細(xì)胞呈單個(gè)游離單個(gè)游離狀態(tài)時(shí)多呈狀態(tài)時(shí)多呈球形球形。 同一種細(xì)胞在同一種細(xì)胞在不同的細(xì)胞外基質(zhì)上不同的細(xì)胞外基質(zhì)上粘附粘附時(shí)可表現(xiàn)出完全時(shí)可表現(xiàn)出完全不同的形狀不同的形狀。 細(xì)胞外基質(zhì)決定細(xì)胞的形狀這一作用是細(xì)胞外基質(zhì)決定細(xì)胞的形狀這一作用是通過(guò)其通過(guò)其受體受體影響影響細(xì)胞骨架的組裝細(xì)胞骨架的組裝而實(shí)現(xiàn)而實(shí)現(xiàn)的。的。93控制細(xì)胞的分化控制細(xì)胞的分化 細(xì)胞通過(guò)與特定的細(xì)胞外基質(zhì)成分作用細(xì)胞通過(guò)與特定的細(xì)胞外基質(zhì)成分作用而發(fā)生分化。而發(fā)生分化。

5、 例如，成肌細(xì)胞成肌細(xì)胞在纖粘連蛋白纖粘連蛋白上增殖并保持未分化的表型；而在層粘連蛋白層粘連蛋白上則停止增殖，進(jìn)行分化，融合為肌管。10 4參與細(xì)胞的遷移參與細(xì)胞的遷移 細(xì)胞外基質(zhì)可以細(xì)胞外基質(zhì)可以控制控制細(xì)胞遷移細(xì)胞遷移的的速度速度與與方向方向，并為細(xì)胞遷移提供，并為細(xì)胞遷移提供“腳手架腳手架”。 細(xì)胞的遷移細(xì)胞的遷移依賴于依賴于細(xì)胞的粘附細(xì)胞的粘附與與細(xì)胞骨細(xì)胞骨架的組裝架的組裝。細(xì)胞粘附于一定的細(xì)胞外基。細(xì)胞粘附于一定的細(xì)胞外基質(zhì)時(shí)質(zhì)時(shí)誘導(dǎo)誘導(dǎo)粘著斑粘著斑的形成，粘著斑是聯(lián)系的形成，粘著斑是聯(lián)系細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞骨架細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞骨架“鉚釘鉚釘”。 11（一）體內(nèi)、外細(xì)胞的差異（一）體內(nèi)

6、、外細(xì)胞的差異 體內(nèi)：神經(jīng)和體液的調(diào)節(jié)、細(xì)胞間相互影響體內(nèi)：神經(jīng)和體液的調(diào)節(jié)、細(xì)胞間相互影響 體外：缺乏動(dòng)態(tài)平衡的穩(wěn)定環(huán)境體外：缺乏動(dòng)態(tài)平衡的穩(wěn)定環(huán)境 發(fā)生的變化發(fā)生的變化 分化現(xiàn)象減弱分化現(xiàn)象減弱 形態(tài)功能趨于單一化形態(tài)功能趨于單一化 一定時(shí)間后死亡或者轉(zhuǎn)化獲得不死性一定時(shí)間后死亡或者轉(zhuǎn)化獲得不死性12 體外培養(yǎng)的細(xì)胞仍具有研究的意義 許多性狀仍與體內(nèi)相同 如體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞仍可博動(dòng)， 細(xì)胞在培養(yǎng)中的表現(xiàn)，存在相應(yīng)基因關(guān)閉基因關(guān)閉開(kāi)啟開(kāi)啟引起的現(xiàn)象，在培養(yǎng)的細(xì)胞中某些特定功能的喪失，可為該基因的表達(dá)與調(diào)控表達(dá)與調(diào)控提供線索。13（二）體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型（二）體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型 貼附型：貼附

7、型：大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長(zhǎng)，屬于貼壁依賴性細(xì)胞，判斷細(xì)胞形態(tài)時(shí)不能按體內(nèi)組織學(xué)標(biāo)推判定 懸浮型：懸浮型：見(jiàn)于少數(shù)特殊的細(xì)胞，白血病細(xì)胞，骨髓細(xì)胞或免疫細(xì)胞，不需要細(xì)胞間和細(xì)胞與培養(yǎng)表面的接觸 。14 貼附型細(xì)胞的分類貼附型細(xì)胞的分類 成纖維細(xì)胞型成纖維細(xì)胞型 上皮型細(xì)胞上皮型細(xì)胞 游走細(xì)胞型游走細(xì)胞型 多型細(xì)胞型多型細(xì)胞型15 成纖維細(xì)胞型成纖維細(xì)胞型 梭型或不規(guī)則三角形，生長(zhǎng)時(shí)呈放射狀。梭型或不規(guī)則三角形，生長(zhǎng)時(shí)呈放射狀。 除真正的成纖維細(xì)胞外，凡由除真正的成纖維細(xì)胞外，凡由中胚層間充質(zhì)中胚層間充質(zhì)起源的組織，起源的組織，如心肌、平滑肌、成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮等常呈本型狀態(tài)。如心肌、平滑肌、成骨

8、細(xì)胞、血管內(nèi)皮等常呈本型狀態(tài)。 凡培養(yǎng)中凡培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維類似形態(tài)與成纖維類似時(shí)皆可稱為成纖維細(xì)胞。時(shí)皆可稱為成纖維細(xì)胞。1617 上皮型細(xì)胞：上皮型細(xì)胞： 扁平不規(guī)則多角形，彼此緊密相連。生長(zhǎng)時(shí)呈膜狀移動(dòng)，扁平不規(guī)則多角形，彼此緊密相連。生長(zhǎng)時(shí)呈膜狀移動(dòng)，細(xì)胞很少單獨(dú)行動(dòng)。細(xì)胞很少單獨(dú)行動(dòng)。 起源于內(nèi)、外胚層的細(xì)胞如皮膚表皮及其衍生物、消化起源于內(nèi)、外胚層的細(xì)胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)。18 游走細(xì)胞型：游走細(xì)胞型： 散在生長(zhǎng)，不連成片，散在生長(zhǎng)，不連成片，呈活躍游走或變形運(yùn)呈活躍游走或變形運(yùn)動(dòng)，方向不規(guī)則。動(dòng)，

9、方向不規(guī)則。 此型細(xì)胞不穩(wěn)定，有此型細(xì)胞不穩(wěn)定，有時(shí)難以和其他細(xì)胞相時(shí)難以和其他細(xì)胞相區(qū)別區(qū)別。19 多型細(xì)胞型： 有一些細(xì)胞，如神經(jīng)有一些細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞難以確定其規(guī)律細(xì)胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。歸于此類。20（三）培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖過(guò)程（三）培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖過(guò)程21 培養(yǎng)細(xì)胞的生命周期培養(yǎng)細(xì)胞的生命周期 是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長(zhǎng)的時(shí)間。是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長(zhǎng)的時(shí)間。 種類、供體的年齡等。種類、供體的年齡等。 人胚成纖維細(xì)胞可傳3050代，約150300個(gè)增殖周期，能維待一年左右，最后衰老凋亡（Apoptosis）。小鼠的胚胎成纖維細(xì)胞

10、僅可傳幾代 供體為成體或衰老個(gè)體，則生存時(shí)間較短； 肝細(xì)胞或腎細(xì)胞，生存時(shí)間更短，僅能傳幾代或十幾代。 當(dāng)細(xì)胞發(fā)生遺傳改變，如獲永生性或惡性轉(zhuǎn)化時(shí)，細(xì)胞的生存期才可能發(fā)生改變。22 生命周期的三個(gè)階段生命周期的三個(gè)階段 原代培養(yǎng)期原代培養(yǎng)期 傳代期傳代期 衰退期衰退期 23 原代培養(yǎng)：原代培養(yǎng)：從體內(nèi)取出組織從體內(nèi)取出組織, ,分離出細(xì)胞、接種培養(yǎng)分離出細(xì)胞、接種培養(yǎng) 到到 第一次傳代。第一次傳代。原代培養(yǎng)（原代培養(yǎng)（Primary CulturePrimary Culture）期）期 原代培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)原組織細(xì)胞在原代培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)原組織細(xì)胞在形態(tài)結(jié)構(gòu)形態(tài)結(jié)構(gòu)和和功能上功能上相似性大相似性大

11、。 特點(diǎn)特點(diǎn) 細(xì)胞群是異質(zhì)的（細(xì)胞群是異質(zhì)的（HeterogeneousHeterogeneous） 細(xì)胞克隆形成率（細(xì)胞克隆形成率（Cloning EfficiencyCloning Efficiency）低，即細(xì)胞獨(dú)立生）低，即細(xì)胞獨(dú)立生存性差。存性差。 由于原代培養(yǎng)細(xì)胞和體內(nèi)細(xì)胞性狀相似性大，是檢測(cè)藥物很由于原代培養(yǎng)細(xì)胞和體內(nèi)細(xì)胞性狀相似性大，是檢測(cè)藥物很好的實(shí)驗(yàn)對(duì)象好的實(shí)驗(yàn)對(duì)象24 原代培養(yǎng)分為兩種方法原代培養(yǎng)分為兩種方法 直接接種組織塊直接接種組織塊 由組織分離出細(xì)胞后接種由組織分離出細(xì)胞后接種2526組織塊接種：牛胎兒成纖維細(xì)胞27 傳代期：傳代期： 原代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后一經(jīng)傳代

12、后便改稱做細(xì)胞系細(xì)胞系（Cell Line）。此期的持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)。 在培養(yǎng)條件較好培養(yǎng)條件較好情況下，細(xì)胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型。 為保持二倍體細(xì)胞性質(zhì)，細(xì)胞應(yīng)在原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)期期或傳代后早期凍存凍存。 一般情況下當(dāng)傳代1050次左右，細(xì)胞細(xì)胞增殖增殖逐漸緩慢逐漸緩慢，以至完全停止，細(xì)胞進(jìn)入第三期。28 衰退期：衰退期： 增殖很慢增殖很慢或或不增殖不增殖，最后衰退，最后衰退凋亡凋亡。 少數(shù)情況下，細(xì)胞可能發(fā)生少數(shù)情況下，細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化自發(fā)轉(zhuǎn)化（Spontaneous Transformation）。轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化的標(biāo)志標(biāo)志之一是細(xì)胞可能獲得之一是細(xì)胞可能獲得永生性永生性（Immort

13、ality）或或惡性性質(zhì)惡性性質(zhì)（Malignancy）。這樣的細(xì)胞群這樣的細(xì)胞群體稱體稱無(wú)限細(xì)胞系無(wú)限細(xì)胞系（Infinite Cell Line），也稱連續(xù)細(xì)胞系也稱連續(xù)細(xì)胞系（Continuous Cell Line）。 無(wú)限細(xì)胞系的形成主要發(fā)生在無(wú)限細(xì)胞系的形成主要發(fā)生在第二期末，或第三期初第二期末，或第三期初階段。階段。細(xì)胞獲不死性后，核型大多變成異倍體細(xì)胞獲不死性后，核型大多變成異倍體（Heteroploid）。29細(xì)胞的一代生存期細(xì)胞的一代生存期1潛伏期潛伏期（Latent Phase） 2指數(shù)增生期（指數(shù)增生期（Logarithmic growth Phase） 3停滯期停滯期

14、（Stagnate Phase） 301潛伏期（潛伏期（Latent Phase） 細(xì)胞接種培養(yǎng)后，先是細(xì)胞接種培養(yǎng)后，先是懸浮期懸浮期。此時(shí)細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體。此時(shí)細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。呈圓球形。 接著細(xì)胞貼附于底物表面，稱接著細(xì)胞貼附于底物表面，稱貼壁貼壁， 各種細(xì)胞各種細(xì)胞貼附速度不同貼附速度不同，這與細(xì)胞的，這與細(xì)胞的種類、培養(yǎng)基成分種類、培養(yǎng)基成分和和底物的理化性質(zhì)底物的理化性質(zhì)等密切相關(guān)。等密切相關(guān)。 經(jīng)過(guò)延展過(guò)程變成經(jīng)過(guò)延展過(guò)程變成極性細(xì)胞極性細(xì)胞 可運(yùn)動(dòng)，基本無(wú)增殖?？蛇\(yùn)動(dòng)，基本無(wú)增殖。 細(xì)胞細(xì)胞接種密度大時(shí)潛伏期短。接種密度大時(shí)潛伏期短。 當(dāng)細(xì)胞分裂相開(kāi)始出現(xiàn)并逐漸增多時(shí)，

15、標(biāo)志細(xì)胞已進(jìn)入當(dāng)細(xì)胞分裂相開(kāi)始出現(xiàn)并逐漸增多時(shí)，標(biāo)志細(xì)胞已進(jìn)入指數(shù)增生期。指數(shù)增生期。31不同的細(xì)胞貼壁的時(shí)間不同不同的細(xì)胞貼壁的時(shí)間不同如如巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等等粘附能力強(qiáng)粘附能力強(qiáng), 能在數(shù)分能在數(shù)分鐘至數(shù)十分鐘內(nèi)粘附到固相表面鐘至數(shù)十分鐘內(nèi)粘附到固相表面 如如神經(jīng)元細(xì)胞、羊水細(xì)胞，粘附能力弱神經(jīng)元細(xì)胞、羊水細(xì)胞，粘附能力弱, 需要數(shù)小需要數(shù)小時(shí)乃至更長(zhǎng)的時(shí)間才能粘附到固相表面時(shí)乃至更長(zhǎng)的時(shí)間才能粘附到固相表面可可利用利用此特點(diǎn)（粘附：快、牢；慢、弱）此特點(diǎn)（粘附：快、牢；慢、弱） 分離分離、純化細(xì)胞純化細(xì)胞 3233貼附過(guò)程 ：3步貼附因子粘附細(xì)胞開(kāi)始附著細(xì)胞進(jìn)一步

16、牢固附著伸展34 細(xì)胞貼壁影響因素 生物因素：生物因素：血清、培養(yǎng)液中的促附著因子血清、培養(yǎng)液中的促附著因子 機(jī)械機(jī)械、物理等物理等其他因素：其他因素： 流動(dòng)：培養(yǎng)液流動(dòng)可阻止細(xì)胞附著流動(dòng)：培養(yǎng)液流動(dòng)可阻止細(xì)胞附著 離心：促進(jìn)附著離心：促進(jìn)附著 低溫：可抑制附著低溫：可抑制附著35 加速細(xì)胞貼壁的措施 包被培養(yǎng)皿底面：包被培養(yǎng)皿底面：對(duì)對(duì)分化程度高、生長(zhǎng)能力差分化程度高、生長(zhǎng)能力差的細(xì)的細(xì)胞可在胞可在培養(yǎng)瓶皿表面包被培養(yǎng)瓶皿表面包被有利于細(xì)胞粘附和生長(zhǎng)的有利于細(xì)胞粘附和生長(zhǎng)的生物活性物質(zhì)生物活性物質(zhì) 如如:-通過(guò)其所帶電荷先吸附培養(yǎng)皿通過(guò)其所帶電荷先吸附培養(yǎng)皿底部底部, 培養(yǎng)的細(xì)胞再與其結(jié)合。

17、培養(yǎng)的細(xì)胞再與其結(jié)合。 血清內(nèi)血清內(nèi)含有多種能夠含有多種能夠促進(jìn)細(xì)胞粘附促進(jìn)細(xì)胞粘附的的成分成分 減少接種減少接種時(shí)細(xì)胞懸液的時(shí)細(xì)胞懸液的量，量，待細(xì)胞粘附和貼壁之后，待細(xì)胞粘附和貼壁之后，再補(bǔ)充足夠的培養(yǎng)液再補(bǔ)充足夠的培養(yǎng)液36 培養(yǎng)液中離子成分及其濃度 如，培養(yǎng)液中的如，培養(yǎng)液中的Ca含量過(guò)低時(shí)不利于含量過(guò)低時(shí)不利于 細(xì)胞的粘附、貼壁和鋪展細(xì)胞的粘附、貼壁和鋪展 合適的培養(yǎng)溫度37 細(xì)胞鋪展細(xì)胞鋪展（伸展）（伸展） (spread) 進(jìn)行進(jìn)行生命活動(dòng)生命活動(dòng)的一種的一種基本的生長(zhǎng)特點(diǎn)基本的生長(zhǎng)特點(diǎn)或生長(zhǎng)行為或生長(zhǎng)行為 鋪展?fàn)顩r鋪展?fàn)顩r制約制約細(xì)胞的細(xì)胞的分裂增殖分裂增殖活動(dòng)活動(dòng) 鋪展的過(guò)程

18、鋪展的過(guò)程 細(xì)胞先由圓形變?yōu)閳A餅形細(xì)胞先由圓形變?yōu)閳A餅形(放射狀鋪展細(xì)胞放射狀鋪展細(xì)胞) 逐漸鋪開(kāi)伸展逐漸鋪開(kāi)伸展成為扁平的極性細(xì)，鋪展的越好與生長(zhǎng)基質(zhì)的表面接觸面成為扁平的極性細(xì)，鋪展的越好與生長(zhǎng)基質(zhì)的表面接觸面越大越大 極性細(xì)胞極性細(xì)胞就是細(xì)胞就是細(xì)胞在體外在體外的的特征性細(xì)胞形態(tài)特征性細(xì)胞形態(tài) 鋪展?fàn)顩r鋪展?fàn)顩r與與細(xì)胞的生長(zhǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)有密切關(guān)系有密切關(guān)系 只有當(dāng)只有當(dāng)細(xì)胞鋪展細(xì)胞鋪展到到合適合適的的程度程度DNA合成合成才開(kāi)始才開(kāi)始進(jìn)行進(jìn)行382， 指數(shù)增生期（指數(shù)增生期（Logarithmic growth Phase） 是細(xì)胞是細(xì)胞增值最旺盛增值最旺盛的階段，是細(xì)胞一代中活力最好的時(shí)

19、的階段，是細(xì)胞一代中活力最好的時(shí)期期,是進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)最好的和最主要的階段。是進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)最好的和最主要的階段。 以細(xì)胞以細(xì)胞分裂指數(shù)分裂指數(shù)（Mitotic Index：MI）作為）作為判定判定細(xì)胞生細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛與否長(zhǎng)旺盛與否的重要的重要標(biāo)志標(biāo)志。即每。即每1000個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù)。個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù)。 體外培養(yǎng)細(xì)胞分裂指數(shù)受細(xì)胞種類、培養(yǎng)液成分、體外培養(yǎng)細(xì)胞分裂指數(shù)受細(xì)胞種類、培養(yǎng)液成分、pH、培養(yǎng)箱溫度等多種因素的影響。一般細(xì)胞的分、培養(yǎng)箱溫度等多種因素的影響。一般細(xì)胞的分裂指數(shù)介于裂指數(shù)介于0.1%0.5%，原代細(xì)胞分裂指數(shù)低，永，原代細(xì)胞分裂指數(shù)低，永生細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分裂指數(shù)可高達(dá)生

20、細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分裂指數(shù)可高達(dá)3%5%。pH和和培養(yǎng)液血清含量變動(dòng)對(duì)細(xì)胞分裂指數(shù)有很大影響培養(yǎng)液血清含量變動(dòng)對(duì)細(xì)胞分裂指數(shù)有很大影響 392， 指數(shù)增生期（指數(shù)增生期（Logarithmic growth Phase） 接觸抑制接觸抑制（Contact Inhibition） 由于細(xì)胞增殖細(xì)胞增殖而的相互接觸相互接觸，進(jìn)而抑制抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和增運(yùn)動(dòng)和增殖殖，這種現(xiàn)象稱接觸抑制（Contact Inhibition）。 惡性細(xì)胞則無(wú)接觸抑制現(xiàn)象，因此接觸抑制可作為區(qū)別惡性細(xì)胞則無(wú)接觸抑制現(xiàn)象，因此接觸抑制可作為區(qū)別正常與癌細(xì)胞標(biāo)志之一。正常與癌細(xì)胞標(biāo)志之一。 接觸抑制是創(chuàng)面愈合過(guò)程中一個(gè)十分有趣的

21、現(xiàn)象。當(dāng)周接觸抑制是創(chuàng)面愈合過(guò)程中一個(gè)十分有趣的現(xiàn)象。當(dāng)周邊的上皮向創(chuàng)面中央爬行時(shí)邊的上皮向創(chuàng)面中央爬行時(shí),一旦上皮細(xì)胞互相接觸一旦上皮細(xì)胞互相接觸,就就停止分化和增殖。該現(xiàn)象就叫停止分化和增殖。該現(xiàn)象就叫接觸抑制接觸抑制。因此。因此,創(chuàng)面上創(chuàng)面上不會(huì)出現(xiàn)多余的皮贅。這也是一種十分巧妙和不會(huì)出現(xiàn)多余的皮贅。這也是一種十分巧妙和神秘神秘的的調(diào)控現(xiàn)象。調(diào)控現(xiàn)象。 40接觸抑制接觸抑制（Contact inhibition） 細(xì)胞相互接觸時(shí)，將停細(xì)胞相互接觸時(shí)，將停止增長(zhǎng)；止增長(zhǎng)； 細(xì)胞停留在細(xì)胞周期的細(xì)胞停留在細(xì)胞周期的G0G0期；期； 轉(zhuǎn)化的細(xì)胞卻可以繼續(xù)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞卻可以繼續(xù)生長(zhǎng)導(dǎo)致細(xì)胞重疊堆積

22、生長(zhǎng)導(dǎo)致細(xì)胞重疊堆積生長(zhǎng)。生長(zhǎng)。413停滯期（停滯期（Stagnate Phase）：）： 細(xì)胞數(shù)量數(shù)量達(dá)飽和密度飽和密度后，細(xì)胞遂停止增殖停止增殖，進(jìn)入停滯期。此時(shí)細(xì)胞數(shù)量細(xì)胞數(shù)量不再增加，故也稱平頂期（Plateau）。 停滯期細(xì)胞雖不增殖，但仍有代謝活動(dòng)，培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)漸趨耗盡，代謝產(chǎn)物積累、pH降低。 此時(shí)需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細(xì)胞會(huì)中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡。傳代過(guò)晚（已有中毒跡象）能影響下一代細(xì)胞的機(jī)能狀態(tài)。在這種情況下，雖進(jìn)行了傳代，因細(xì)胞已受損，需要恢復(fù)，至少還要再傳12兩代，通過(guò)換液淘汰掉死細(xì)胞和使受損輕微的細(xì)胞得以恢復(fù)后，才能再用。42第二節(jié)第二節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞

23、培養(yǎng)43主主 要要 內(nèi)內(nèi) 容容（一）細(xì)胞培養(yǎng)所需條件（一）細(xì)胞培養(yǎng)所需條件（二）細(xì)胞培養(yǎng)所需用品（二）細(xì)胞培養(yǎng)所需用品（三）細(xì)胞培養(yǎng)液（三）細(xì)胞培養(yǎng)液（四）細(xì)胞的原代、繼代培養(yǎng)（四）細(xì)胞的原代、繼代培養(yǎng)（五）細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇（五）細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇（六）細(xì)胞污染（六）細(xì)胞污染44（一）細(xì)胞培養(yǎng)所需條件（一）細(xì)胞培養(yǎng)所需條件 1 營(yíng)養(yǎng)需要營(yíng)養(yǎng)需要 2 細(xì)胞的生存環(huán)境細(xì)胞的生存環(huán)境 溫度溫度: 37 O2 CO2: 5% CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3- pH: 7.2-7.4 滲透壓滲透壓 濕度濕度 3 無(wú)污染無(wú)污染 4 無(wú)毒無(wú)毒45（二）細(xì)胞培養(yǎng)所需用品：（二）細(xì)胞培養(yǎng)所需用品

24、： 無(wú)菌間、超凈工作臺(tái)，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸，紫外燈 CO2培養(yǎng)箱 倒置顯微鏡 液氮罐 自動(dòng)雙重純水蒸餾器，純水儀 耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動(dòng)吸引器，培養(yǎng)板， 凍存管461 1超凈工作臺(tái)超凈工作臺(tái)(Hood): A.水平流超凈工作臺(tái)水平流超凈工作臺(tái)(Horizontal air flow) B.垂直流超凈工作臺(tái)垂直流超凈工作臺(tái)(Lateral air flow)C.層流空氣超凈工作臺(tái)層流空氣超凈工作臺(tái)(Laminar air flow)47水平流超凈工作臺(tái)背送風(fēng)，但病毒是不實(shí)用的，容易對(duì)人有害48垂直流超凈工作臺(tái)4950超凈工作臺(tái)的清潔維護(hù)：超凈工作臺(tái)的清潔維護(hù)： 保持工作臺(tái)上

25、無(wú)死角，讓空氣得到充分過(guò)濾，即試驗(yàn)完畢后，將所有的用品收藏起來(lái)用品收藏起來(lái)，工作臺(tái)上只留只留有酒精燈酒精燈及橡皮頭橡皮頭。工作前和工作完畢都要用酒精擦桌面，如果桌面滴有培養(yǎng)液等物，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后應(yīng)先用水擦，然后用酒精再擦。還需定期檢測(cè)工作臺(tái)濾器過(guò)濾的效率。51整個(gè)接種操作應(yīng)在近火焰處進(jìn)行，且動(dòng)作要迅速正正 確確 錯(cuò)錯(cuò) 誤誤52接種過(guò)程中盡可能達(dá)到懸空要求接種過(guò)程中盡可能達(dá)到懸空要求防止操作帶來(lái)的污染正正 確確 錯(cuò)錯(cuò) 誤誤53接種時(shí)不得用手接觸瓶蓋內(nèi)壁或瓶口接種時(shí)不得用手接觸瓶蓋內(nèi)壁或瓶口正正 確確 錯(cuò)錯(cuò) 誤誤54瓶蓋朝上放，接種完畢后立即蓋好瓶口瓶蓋朝上放，接種完畢后立即蓋好瓶口正正 確確 錯(cuò)錯(cuò)

26、誤誤552，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37 ，100%濕度，濕度，5CO2 。使用使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題 用用螺旋口瓶螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋微松微松，以保證通氣。，以保證通氣。 保持培養(yǎng)箱內(nèi)保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈空氣干凈。 定期消毒定期消毒（90 ，14 h)。 箱內(nèi)箱內(nèi)滅菌蒸餾水滅菌蒸餾水3000毫升蒸餾水，毫升蒸餾水， 以保持箱內(nèi)濕度，避免培養(yǎng)液蒸以保持箱內(nèi)濕度，避免培養(yǎng)液蒸發(fā)。發(fā)。56濕度以第二天第濕度以第二天第一次開(kāi)門(mén)，能看一次開(kāi)門(mén)，能看到玻璃門(mén)上的水到玻璃門(mén)上的水珠珠573 3消毒設(shè)

27、備：消毒設(shè)備： A.A.高壓消毒鍋（高壓消毒鍋（AutoclaveAutoclave）：）：110 C110 C，15 lb15 lb，20 20 分鐘，分鐘，適合于橡皮、紙、布、塑料制品和液體（適合于橡皮、紙、布、塑料制品和液體（9 lb9 lb， 10 10 分鐘）等。分鐘）等。消毒后必須在烤箱中低溫烤干。消毒后必須在烤箱中低溫烤干。 B.B.干熱消毒箱：干熱消毒箱：150-200 C150-200 C， 2 -32 -3小時(shí)。小時(shí)。 適合于玻璃器皿、金屬器械等。適合于玻璃器皿、金屬器械等。C.C.酒精消毒酒精消毒：解剖器械、塑料器皿、動(dòng)物皮毛解剖器械、塑料器皿、動(dòng)物皮毛 等，酒精濃度為等

28、，酒精濃度為75759595 。 58高壓消毒鍋高壓消毒鍋59 D. D. 濾膜過(guò)濾：濾膜過(guò)濾：正壓過(guò)濾正壓過(guò)濾: : 蠕動(dòng)泵通入培液；通入氣體。 負(fù)壓過(guò)濾：負(fù)壓過(guò)濾：用水泵或油泵抽濾。 濾膜孔徑為濾膜孔徑為0.22m0.22m，為延長(zhǎng)濾膜壽命可同時(shí)添，為延長(zhǎng)濾膜壽命可同時(shí)添加加0.45 m0.45 m和和1.2 m 1.2 m 濾膜。濾膜。60濾 膜 濾 器61兩種：1，一次性濾器；2，買濾膜自己裝（需要消毒）624. 4. 蒸餾器與去離子純水系統(tǒng)：蒸餾器與去離子純水系統(tǒng)： 1 1）用三蒸水，通過(guò)去離子純水）用三蒸水，通過(guò)去離子純水 系統(tǒng)，電阻需達(dá)到系統(tǒng)，電阻需達(dá)到170170萬(wàn)歐姆萬(wàn)歐姆以

29、上。以上。 2 2）專門(mén)的去離子水系統(tǒng)）專門(mén)的去離子水系統(tǒng)5. 5. 倒置相差顯微鏡：倒置相差顯微鏡： 需用需用相差鏡頭相差鏡頭和和濾光片濾光片，集光器的選擇應(yīng)與接物鏡，集光器的選擇應(yīng)與接物鏡的放大倍數(shù)一致。的放大倍數(shù)一致。63純水系統(tǒng)純水系統(tǒng) 64倒置相差顯微鏡1，物鏡朝上2，工作距離大3，相差干涉655，培養(yǎng)器皿，培養(yǎng)器皿66培養(yǎng)板與培養(yǎng)瓶培養(yǎng)板與培養(yǎng)瓶675，恒溫水浴箱，血，恒溫水浴箱，血清滅活，細(xì)胞解凍清滅活，細(xì)胞解凍686，移液管，移液管6970717 7，低速離心機(jī)，低速離心機(jī)72 RPMI-1640RPMI-1640（標(biāo)準(zhǔn)型）、（標(biāo)準(zhǔn)型）、DMEM-DMEM-高糖高糖（標(biāo)準(zhǔn)型）、

30、（標(biāo)準(zhǔn)型）、DMEM-DMEM-低糖（標(biāo)準(zhǔn)型）、低糖（標(biāo)準(zhǔn)型）、McCoys 5AMcCoys 5A、M199M199、F12F12等等73Gibco干粉培養(yǎng)液液體培養(yǎng)液1，培養(yǎng)在使用之前需要加入的成分：血清、H2CO3, 丙酮酸鈉、抗生素等74Hyclone胎牛血清Gibco胎牛血清血清使用前要根據(jù)需要的量進(jìn)行分裝，避免反復(fù)凍融，血清保存要放置2075培養(yǎng)液的選擇培養(yǎng)液的選擇沒(méi)有一定的標(biāo)準(zhǔn)，有幾點(diǎn)建議可供參考沒(méi)有一定的標(biāo)準(zhǔn)，有幾點(diǎn)建議可供參考 選擇培養(yǎng)選擇培養(yǎng)這種細(xì)胞這種細(xì)胞首選的培養(yǎng)液。可以查閱參考文獻(xiàn)，或在購(gòu)買細(xì)首選的培養(yǎng)液。可以查閱參考文獻(xiàn)，或在購(gòu)買細(xì)胞株時(shí)咨詢。胞株時(shí)咨詢。 其它實(shí)驗(yàn)

31、室其它實(shí)驗(yàn)室慣用的培養(yǎng)液慣用的培養(yǎng)液不妨一試，許多培養(yǎng)液可以適合多種細(xì)胞。不妨一試，許多培養(yǎng)液可以適合多種細(xì)胞。 用用多種培養(yǎng)液多種培養(yǎng)液培養(yǎng)目的細(xì)胞，觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)，可以用生長(zhǎng)曲線、集培養(yǎng)目的細(xì)胞，觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)，可以用生長(zhǎng)曲線、集落形成率等指標(biāo)判斷，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基，這是最客觀的落形成率等指標(biāo)判斷，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基，這是最客觀的方法，但比較繁瑣。方法，但比較繁瑣。 總之，首選總之，首選MEM做粘附細(xì)胞培養(yǎng)、做粘附細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，各種目的無(wú)血清培養(yǎng)的首選是各種目的無(wú)血清培養(yǎng)的首選是AIM V培養(yǎng)基（培養(yǎng)基（SFM）。）。76血清

32、使用注意事項(xiàng)血清使用注意事項(xiàng)血清必須貯存于血清必須貯存于20 20 -70-70，若存放于，若存放于44，請(qǐng)勿超過(guò)一個(gè)月。，請(qǐng)勿超過(guò)一個(gè)月。血清血清解凍步驟解凍步驟( (逐步解凍法逐步解凍法): -20): -20或或7070至至44冰箱冰箱溶解一天，至溶解一天，至室溫室溫下全溶后再分裝。在溶解過(guò)程中須下全溶后再分裝。在溶解過(guò)程中須規(guī)則搖晃均勻規(guī)則搖晃均勻( (小心勿造成氣小心勿造成氣泡泡) )，使溫度與成分均一，減少沉淀的發(fā)生。勿直接由，使溫度與成分均一，減少沉淀的發(fā)生。勿直接由2020直接至直接至3737解凍，因溫度改變太大，容易造成解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生

33、沉淀。而發(fā)生沉淀。熱滅活（熱滅活（heat-inactivationheat-inactivation）是指）是指56, 30 56, 30 分鐘分鐘加熱已完全解凍之加熱已完全解凍之血清。目的是使血清中之血清。目的是使血清中之補(bǔ)體成份補(bǔ)體成份(complement) (complement) 去活化。除非必須，去活化。除非必須，一般不建議作此熱處理一般不建議作此熱處理，因?yàn)闀?huì)造成沉淀物顯著增多，且會(huì)影響血清，因?yàn)闀?huì)造成沉淀物顯著增多，且會(huì)影響血清之品質(zhì)。之品質(zhì)。勿將血清置于勿將血清置于3737太久，若在太久，若在3737放置太久，血清會(huì)變得混濁，同時(shí)放置太久，血清會(huì)變得混濁，同時(shí)血清中許多較血

34、清中許多較不穩(wěn)定之成份不穩(wěn)定之成份亦會(huì)因此受到破壞，而影響血清之品質(zhì)亦會(huì)因此受到破壞，而影響血清之品質(zhì)77 補(bǔ)體系統(tǒng)原指血清中引起免疫性細(xì)胞溶解（抗體包裹細(xì)胞溶解）的不耐熱因子；現(xiàn)指至少由20種截然不同的血清蛋白組成的完整功能相關(guān)系統(tǒng)。補(bǔ)體系統(tǒng)主要的功能是通過(guò) 在病原體表面的作用，破壞其細(xì)胞膜或者“調(diào)理”病原體表面供巨噬細(xì)胞吞食，此外還能引起發(fā)炎反應(yīng)。 加熱可以滅活補(bǔ)體系統(tǒng)。激活的補(bǔ)體參與溶解細(xì)胞事件，刺激平滑肌收縮，細(xì)胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在進(jìn)行免疫學(xué)研究、培養(yǎng)ES細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時(shí)，推薦使用熱滅活血清。 78 凝絮物：發(fā)生之原因有許多種，但普遍之原因是血清中

35、之脂蛋白(lipoprotein) 變性及解凍后血清中存在之血纖維蛋白(fibrin) 造成，這些凝絮沉淀物不會(huì)影響血清本身之品質(zhì)。若欲減少這些凝絮沉淀物，可用離心3000 rpm, 5 min 去除，或離心后上清液可以加入培養(yǎng)基中一起過(guò)濾。不建議用過(guò)濾步驟去除這些凝絮沉淀物，因?yàn)闀?huì)阻塞過(guò)濾膜。 顯微鏡下觀察之“小黑點(diǎn)”：通常經(jīng)過(guò)熱處理之血清，沉淀物的形成會(huì)顯著的增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察像是“小黑點(diǎn)”，常會(huì)誤認(rèn)為血清遭受污染，而將血清放在37中欲培養(yǎng)此“微生物“，但在37環(huán)境下，又會(huì)使此沉淀物增多，更會(huì)誤認(rèn)為微生物之增殖，但以培養(yǎng)細(xì)菌之培養(yǎng)基檢測(cè)，又沒(méi)有污染。一般而言，此小黑點(diǎn)應(yīng)不會(huì)影響

36、細(xì)胞之生長(zhǎng)，但若懷疑此血清之品質(zhì)，應(yīng)立即停用，更換另一批號(hào)的血清。 血清沉淀物血清沉淀物 79谷氨酰胺 L谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的。脫掉氨基后，L谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來(lái)源能量來(lái)源、參與蛋白質(zhì)的合成蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝核酸代謝。L谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后會(huì)降解降解，但是確切的降解率一直沒(méi)有最終確定。L谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成氨的形成，而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性。 配制方法為 ：谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mM的溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂螅☉?yīng)加溫30），過(guò)濾除菌，分裝小瓶，-20-20保存保存，使用時(shí)可向100ml培養(yǎng)液中加入0.5-2ml谷氨酰胺濃縮液，

37、終濃度為1-4mM 8081l 由組織中分離細(xì)胞和細(xì)胞傳代l 常用的有胰蛋白酶和乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)兩種溶液，單獨(dú)或混合使用82 胰蛋白酶溶液胰蛋白酶溶液 主要作用：使細(xì)胞間的主要作用：使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解蛋白質(zhì)水解，使細(xì)胞相互離散，使細(xì)胞相互離散 消化細(xì)胞時(shí)，加入一些消化細(xì)胞時(shí)，加入一些血清血清或含血清的培養(yǎng)液，能終止消或含血清的培養(yǎng)液，能終止消化作用化作用 EDTA4Na EDTA4Na 溶液溶液 一種化學(xué)螯合劑，對(duì)細(xì)胞有一定的離散作用，而且毒性小，一種化學(xué)螯合劑，對(duì)細(xì)胞有一定的離散作用，而且毒性小，價(jià)格低廉，使用方便價(jià)格低廉，使用方便 常用工作液濃度為常用工作液濃度為0.02%0

38、.02%。 注意：注意：使用使用EDTA EDTA 處理細(xì)胞后，要用平衡鹽液沖洗干凈，處理細(xì)胞后，要用平衡鹽液沖洗干凈，因殘留的因殘留的EDTA EDTA 會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)83（四）細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)（四）細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)84取材：取材：用用頸椎脫位法頸椎脫位法使使孕鼠孕鼠迅速死亡。把迅速死亡。把整個(gè)孕鼠整個(gè)孕鼠浸入盛有浸入盛有7575乙醇乙醇的燒杯中數(shù)秒鐘的燒杯中數(shù)秒鐘消毒消毒，取出后放在大平皿中攜入，取出后放在大平皿中攜入超凈臺(tái)超凈臺(tái)。用消過(guò)毒的。用消過(guò)毒的剪刀剪刀在軀干中部環(huán)行剪開(kāi)在軀干中部環(huán)行剪開(kāi)皮膚，剖腹取出皮膚，剖腹取出子宮子宮置于無(wú)菌平皿中。用消置于無(wú)菌平皿中。

39、用消過(guò)毒的剪刀過(guò)毒的剪刀剪開(kāi)子宮，剪開(kāi)子宮，取出取出鼠胎，鼠胎，剪去剪去頭、爪，頭、爪，以以平衡鹽溶液平衡鹽溶液洗去血洗去血污污切割：切割：用用PBSPBS將取出的將取出的組織塊組織塊清洗三次，然后用眼科手術(shù)剪刀仔細(xì)將清洗三次，然后用眼科手術(shù)剪刀仔細(xì)將組組織反復(fù)剪碎織反復(fù)剪碎，直到成，直到成1mm1mm3 3左右的小塊左右的小塊，再用，再用平衡鹽溶液平衡鹽溶液清洗，洗到組清洗，洗到組織塊發(fā)白為止。靜置數(shù)分鐘，使組織塊自然沉淀到管底，棄去上清織塊發(fā)白為止。靜置數(shù)分鐘，使組織塊自然沉淀到管底，棄去上清消化、接種培養(yǎng)：消化、接種培養(yǎng)：加入加入0.250.25胰蛋白酶消化液胰蛋白酶消化液（5-105-

40、10倍量倍量），與組織），與組織塊混勻。置塊混勻。置3737水浴，觀察消化情況水浴，觀察消化情況（每隔幾分鐘搖動(dòng)一下試管），（每隔幾分鐘搖動(dòng)一下試管），靜止，吸去上清，加入靜止，吸去上清，加入5 510ml10ml細(xì)胞培養(yǎng)液細(xì)胞培養(yǎng)液，用吸管吹打混勻，移入二，用吸管吹打混勻，移入二個(gè)培養(yǎng)瓶中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)個(gè)培養(yǎng)瓶中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)85全量換液和半量換液全量換液和半量換液 換液時(shí)機(jī)的選擇：培養(yǎng)液培養(yǎng)液pH值：細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，代謝產(chǎn)生酸性物值：細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，代謝產(chǎn)生酸性物質(zhì)積累增多，質(zhì)積累增多， pH值下降，營(yíng)養(yǎng)液酸化變黃。值下降，營(yíng)養(yǎng)液酸化變黃。細(xì)胞狀態(tài)細(xì)胞狀態(tài)細(xì)細(xì) 胞胞 換

41、換 液液8687消化法傳代培養(yǎng)步驟8889冷凍細(xì)胞注意事項(xiàng)冷凍細(xì)胞注意事項(xiàng)凍存液配制凍存液配制 : 現(xiàn)用現(xiàn)配，DMSO是易燃物凍存液體積凍存液體積：要小，0.5-1 ml凍存細(xì)胞數(shù)凍存細(xì)胞數(shù)：與正常傳代細(xì)胞數(shù)目要相當(dāng)，避免復(fù)蘇后細(xì)胞傳代比例發(fā)生變化凍存速度凍存速度： 降溫緩慢 4C，1030 min -20C，1 - 2 h -80C，1 hour 過(guò)夜 -196C，1- 2 year 完善記錄完善記錄：凍存細(xì)胞名稱，PD，凍存日期，凍 存人，存放位置，其它特殊信息等90細(xì)胞凍存管，做好標(biāo)記919293（六）細(xì)（六）細(xì) 胞胞 污污 染染 細(xì)菌污染 真菌污染 細(xì)菌和真菌的清除 支原體污染 支原體

42、的清除94細(xì)菌污染 細(xì)胞培養(yǎng)常見(jiàn)的污染細(xì)胞培養(yǎng)常見(jiàn)的污染 最常見(jiàn)的有革蘭氏陽(yáng)性菌，如枯草桿菌以及大腸桿菌、最常見(jiàn)的有革蘭氏陽(yáng)性菌，如枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見(jiàn)。常見(jiàn)。 培養(yǎng)細(xì)胞受細(xì)菌污染后，會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)細(xì)胞受細(xì)菌污染后，會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，培養(yǎng)液變混濁，pH改改變變。 污染后細(xì)胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最污染后細(xì)胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡。后變圓脫落死亡。 95真菌污染真菌污染 真菌污染后，細(xì)胞生長(zhǎng)變慢，但最后由于營(yíng)養(yǎng)耗盡及真菌污染后，細(xì)胞生長(zhǎng)變慢，但最后由于營(yíng)養(yǎng)耗盡及

43、毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡。毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡。 96白色念珠菌（倒置顯微鏡下） 中間長(zhǎng)梭型的是正在分裂的念珠菌 97細(xì)菌和真菌的清除細(xì)菌和真菌的清除 使用抗生素使用抗生素 抗生素對(duì)殺滅細(xì)菌較有效?？股貙?duì)殺滅細(xì)菌較有效。 聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥效果好。聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥效果好。 預(yù)防用藥比污染后再用藥效果好，一般用雙抗生素。預(yù)防用藥比污染后再用藥效果好，一般用雙抗生素。 污染后清除用藥需采用大于常用量污染后清除用藥需采用大于常用量5 51010倍藥物沖洗倍藥物沖洗法，于加藥后作用法，于加藥后作用24244848小時(shí)，再換常規(guī)培養(yǎng)液。此小時(shí)，再換常規(guī)培養(yǎng)液。此法在污染早期有效。法在污染早期有效

44、。989595以上是以下四種支原體：以上是以下四種支原體：口腔支原體（口腔支原體（M.oraleM.orale）精氨酸支原體（精氨酸支原體（M.argininiM.arginini）豬鼻支原體（豬鼻支原體（M.hyorhinisM.hyorhinis）牛萊氏無(wú)膽甾原體（牛萊氏無(wú)膽甾原體（A.laidlawiiA.laidlawii）危害：危害：世界性問(wèn)題，平均發(fā)生率達(dá)到世界性問(wèn)題，平均發(fā)生率達(dá)到11%11%能改變細(xì)胞的能改變細(xì)胞的DNA,RNADNA,RNA及蛋白表達(dá)及蛋白表達(dá)不能通過(guò)可視法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)不能通過(guò)可視法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)率影響較小，不易引起注意污染對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)率影響較小，不易引起注意污染來(lái)源：來(lái)源：操作環(huán)境不良操作環(huán)境不良操作人員的疏失操作人員的疏失實(shí)驗(yàn)器具不潔等實(shí)驗(yàn)器具不潔等已受污染的細(xì)胞已受污染的細(xì)胞已受污染的培養(yǎng)基、血清已受污染的培養(yǎng)基、血清支原體污染支原體污染99熒光染色法熒光染色法電鏡檢查電鏡檢查：掃描電鏡掃描電鏡、透射電鏡透射電鏡支原體培養(yǎng)支原體培養(yǎng)聚合酶鏈反聚合酶鏈反應(yīng)應(yīng)(PCR)法法支原體污染檢測(cè)支原體污染檢測(cè)100細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液常常細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液常常仍清亮但仍清亮但變黃變黃,細(xì)胞生長(zhǎng)變緩細(xì)胞生長(zhǎng)變緩，部分細(xì)部分細(xì)胞發(fā)生脫落等等胞發(fā)生脫落等等，細(xì)胞間隙可見(jiàn)鋪滿細(xì)沙樣小點(diǎn)，細(xì)胞間隙可見(jiàn)鋪滿細(xì)沙樣小點(diǎn)。支原體污染表現(xiàn)支原體污染表