植物生理生化指標(biāo)測定(精)

1、小黑豆相關(guān)生理指標(biāo)測定1. 表型變化:鮮重、株高、主根長和葉面積鮮重 :取處理好的植株,擦干根和葉外表水分,測量整株植物的重量,每個測 6個重復(fù)。株高 :取處理好的植株,測量從根和莖分隔處到植株最高點的高度,記錄,每個 測 6個重復(fù)。主根長 :取處理好的植株,測量從根和莖分隔處到主根最遠(yuǎn)點長度,記錄,每個 測 6個重復(fù)。葉面積 :取處理好的植株,選擇第二節(jié)段的葉片,測量葉面積,葉面積測量方法 是測每個葉片最寬處長度作為葉的長, 測葉片最窄處長度作為葉的寬, 葉片長和 寬的乘積即為葉外表積。每個測 6個重復(fù)。2. 總蛋白、可溶性糖、丙二醛(MDA 和 H2O2含量測定樣品處理:取 0.5g 樣品

2、(葉片要去除葉脈、根要先用清水清洗干凈 ,速在 液氮中凍存,在遇冷的研缽中加液氮研磨,然后參加 1.5ml 的 Tris-HCl (pH7.4 抽提, 將抽提液轉(zhuǎn)移到 2ml 的 EP 管中, 于 4, 12000rpm 離心 15min , 取上清, 保存在 -20下,上清液可用于總蛋白、丙二醛(MDA 、可溶性糖和 H2O2含 量測定?？偟鞍诇y定(Bradford 法 :樣品反響體系(800ul H2O+200ul Bradford+5ul樣 品 , 空 白對 照 為(800ul H2O+200ul Bradford 。 測 定 后 帶 入 標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線 Y=32.549X-0.224(

3、Y代表蛋白含量, X 代表 OD595 ,計算得出蛋白含量。可溶性糖測定:樣品反響體系(1ml 蒽酮 +180ul ddH2O+20ul樣品提取液 ; 空 白 對 照 (1ml 蒽 酮 +180ul ddH2O , 測 定 OD625后 帶 入 標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線 : Y=0.0345X+0.0204(Y代表 OD625, X 代表可溶性糖含量(ug 蒽酮配方:稱取 100mg 蒽酮溶于 100ml 稀硫酸(76ml 濃硫酸 +30mlH2O . 注意:濃硫酸參加水中時,一點一點遞加,小心濺出受傷。丙二醛 (MDA 測定:在酸性和高溫條件下, 丙二醛可與硫代巴比妥 (TBA 反響生成紅棕色的 3,

4、5,5-三甲基惡唑 2,4-二酮,在 532nm 處有最大吸收波長,但 該反響受可溶性糖的極大干擾,糖與 TBA 的反響產(chǎn)物在 532nm 處也有吸收,但 其最大吸收波長在 450nm 處。采用雙組分分光光度法,可計算出 MDA 含量。 MDA 的計算公式為:MDA (umol/L =6.45OD532-0.56OD450.反響體系為:400ul 0.6%TBA+350ul H2O+50ul樣品, 80水浴 10min 后, 測 OD532和 OD450。對照用 Tris-HCl.0.6%TBA配方:稱取硫代巴比妥 0.6g ,溶于少量 1M NaOH中,待其完全 溶解后用 10%TCA(稱取

5、 10gTCA 三氯乙酸,溶于 100ml 蒸餾水中,待其溶解 即可定容至 100ml 。H2O2測定(二甲酚橙法 :樣品反響體系(82ul 溶液 A+820ul溶液 B (A:B=1:10 +150ul樣品提取液 , 30水浴 30min ,測 OD560。標(biāo)準(zhǔn)曲線 為 :Y=0.01734X-0.0555(Y代表 OD560, X 代表 H2O2含量 溶液 A (200ml :FeSO4.7H2O 0.1835g; (NH42SO4 0.0872g; H2SO4(濃硫 酸 18M4.58ml ,加水定容。溶液 B (200ml :二甲酚橙 0.0234g ;山梨醇 6g ,加水定容到 20

6、0ml3. 可溶性蛋白、 SOD 、 POD 和 CAT 活性測定樣品處理:取 0.5g 樣品,速在液氮中凍存,在遇冷的研缽中加液氮研磨, 然后參加 1.5ml 的 Tris-HCl (pH7.0 (內(nèi)含有 20%甘油、 1mmol/L ASA(抗壞血 酸 、 1mmol/L DTT(二硫蘇糖醇 、 1mmol/L EDTA、 1mmol/L GSH(復(fù)原型谷 胱甘肽 、 5mmol/L MgCl2抽提,將抽提液轉(zhuǎn)移到 2ml 的 EP 管中,于 4, 12000rpm 離心 15min , 取上清, 保存在 -20下, 上清液可用于可溶性蛋白、 SOD 、 POD 和 CAT 含量測定。1m

7、mol/L的 ASA 配制:先配制 10mmol/L的母液稱取 176.13mg 的 ASA , 溶于 100ml 的 Tris-HCl (pH7.0中即可,然后稀釋 10倍即可。1mmol/L的 DTT 配制:先配制 10mmol/L的母液稱取 154.25mg 的 DDT 溶于 100 ml的 Tris-HCl (pH7.0中即可,然后稀釋 10倍即可。1mmol/L的 EDTA 配制:用 30mmol/L的 EDTA 稀釋 30倍即可。5mmol/L的 MgCl2配制:稱取 MgCl2.6H2O 的 101.5mg 溶于 100ml 的 Tris-HCl (pH7.0 ,即可。樣品提取液

8、的配制(200ml :取 10mmol/L的 ASA 母液 20ml , 10mmol/L的母液 DTT20ml , 取 30mmol/L的 EDTA 母液 7ml , 稱取 203mg 的 MgCl2.6H2O , 最后再量取 20ml 的甘油,將最終體積定容到 200ml ,即可?？?溶 性 蛋 白 測 定 (Bradford 法 :樣 品 反 應(yīng) 體 系 (800ul H2O+200ul Bradford+5ul樣品 ,空白對照為(800ul H2O+200ul Bradford 。測定后帶入標(biāo)準(zhǔn) 曲線 Y=32.549X-0.224(Y代表蛋白含量, X 代表 OD595 ,計算得出蛋

9、白含量。SOD 測定 :SOD 活性的測定是根據(jù)照光時,體系中產(chǎn)生氧自由基使硝基四 唑藍(lán)復(fù)原成藍(lán)色甲 (在 560nm 處有一吸收峰 , 而超氧化物歧化酶作為氧自由基 的去除劑可抑制此反響。 一個酶活單位定義為將硝基四唑藍(lán)的復(fù)原抑制到對照 一半 (50% 時所需的酶量。14.5mmol/L的 dl-甲硫氨酸(分子量 149.21 (現(xiàn)用現(xiàn)配 :稱取甲硫氨酸 216.4mg ,加少量 Tris-HCl(pH7.0溶解后,用 Tris-HCl(pH7.0定容到 100ml ,即 可。30mmol/L的 EDTA (292.25 (現(xiàn)用現(xiàn)配 :稱取 EDTA 藥品 876.75mg ,加 少量 Tr

10、is-HCl(pH7.0溶解后,用 Tris-HCl(pH7.0定容到 100ml ,即可。2.25mmol/L的 NBT (硝基四唑藍(lán) (817.6 (現(xiàn)用現(xiàn)配 :稱取 NBT 藥品 183.96mg ,加少量 Tris-HCl(pH7.0溶解后,用 Tris-HCl(pH7.0定容到 100ml ,即 可。60umol/L的核黃素 (376.36(現(xiàn)用現(xiàn)配 :先稱取 225.81mg 的核黃素,加少 量 50mM Tris-HCl(pH7.4溶解后, 用 50mM Tris-HCl(pH7.4定容到 10ml , 配制成 60mmol/L的母液,然后取 100ul 到 100ml 的 Tr

11、is-HCl(pH7.4中,即可配制成 60umol/L的核黃素。測酶活的反響介質(zhì) :測定前在 54ml 的 14.5mmol/L的 dl-甲硫氨酸中分別加 入 EDTA 、 NBT 和核黃素各 2ml ,此為反響混合液。酶活測定:在盛有 1.0ml 反響液的試管中,參加適量的酶液(50ul (以抑 制達(dá) 50%作用酶濃度為最正確 ?；靹蚝蠓旁谕该鞯脑嚬芗苌?于光照培養(yǎng)箱中準(zhǔn) 確照光 10min 后,迅速測定 560nm 處的光密度。以不加酶液照光液的為對照, 計算反響被抑制的百分比。按下式計算超氧化物歧化酶的活性 A ×N酶活力 =AO×W ×T ×V

12、 ×50%式中:酶活力單位為每 min 每g鮮重酶活單位數(shù);AO為對照試管溶液在 560nm 處的吸光度值 ; A 為對照試管溶液在 560nm 處的吸光值與參加酶液的反響液在 560nm 處 的吸光值的差 ; N為酶液總體積; W 為提取酶液的樣品鮮重 g ; T 為照光時間 (10min; V 為參加酶液的體積 (ml;POD 測定(愈創(chuàng)木酚法 :過氧化物酶廣泛分布于植物的各個組織器官中。 在有過氧化氫存在下, 過氧化物酶能使愈創(chuàng)木酚氧化, 生成茶褐色物質(zhì), 可用分 光光度計測量生成物的含量。反響混合液配制:在 50ml 的 50mmol/L的 Tris-HCl(pH7.0緩沖液

13、中參加 28ul 的愈創(chuàng)木酚,與磁力攪拌器上加熱攪拌直至愈創(chuàng)木酚溶解,再參加 19ul 的 30%的 H2O2,混合均勻, 4保存。酶活測定:取反響混合液 1.0ml , 參加 0.1ml 酶提取液, 2min 前后, 于 470nm 處測 OD 值,每隔 1min 讀數(shù)一次,以每分鐘 OD 值的變化表示酶活大小。 (測量 時再參加酶液CAT 測定(H2O2法反響緩沖液:20mM 的 H2O2,使用前在 25水浴中加熱 30min 。酶活測定:取反響液 1.4ml ,參加 100ul 酶液,每加完一管立即計時,并迅 速在波長 240nm 下測定 30S 、 1min30S 、 2min30S 時的吸光度,以 Tris-HCl 的 作為空白。以 1min 內(nèi) A240減少 0.1的酶量為 1個酶活單位。代入酶活力公式, 以 OD*V/0.1*v*t FW表示 CAT 活性,所有測定均重復(fù)三次。 OD 代表 空 白的吸光度 -樣品管的吸光度 ; V 代表酶提取液的總體積, v 代表測量是參加的樣 品體積; t 代表反響時間 min , FW 代表樣品鮮重。0.1mol/LH2O2 配方:稱取 1.1333g 的 30%的 H2O2, 參加 100ml 的 50mmo