蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上第四節(jié) 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)一、兩性離解和等電點蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的，在其分子表面帶有很多可解離基團，如羧基、氨基、酚羥基、咪唑基、胍基等。此外，在肽鏈兩端還有游離的-氨基和-羧基，因此蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，可以與酸或堿相互作用。溶液中蛋白質(zhì)的帶電狀況與其所處環(huán)境的pH 有關。當溶液在某一特定的pH 條件下，蛋白質(zhì)分子所帶的正電荷數(shù)與負電荷數(shù)相等，即凈電荷數(shù)為零，此時蛋白質(zhì)分子在電場中不移動，這時溶液的pH 稱為該蛋白質(zhì)的等電點，此時蛋白質(zhì)的溶解度最小。由于不同蛋白質(zhì)的氨基酸組成不同，所以蛋白質(zhì)都有其特定的等電點，在同一pH 條件下所帶凈電荷數(shù)不同。如果蛋白質(zhì)中堿性氨基酸

2、較多，則等電點偏堿，如果酸性氨基酸較多，等電點偏酸。酸堿氨基酸比例相近的蛋白質(zhì)其等電點大多為中性偏酸，約在5.0 左右。1、兩性解離蛋白質(zhì)可以在酸性環(huán)境中與酸中和成鹽，而游離成正離子，即蛋白質(zhì)分子帶正電，在電場中向陰極移動；在堿性環(huán)境中與堿中和成鹽而游離成負離子，即蛋白質(zhì)分子帶負電，在電場中向陽極移動。以“P”代表蛋白質(zhì)分子，以NH2 和COOH分別代表其堿性和酸性解離基團，隨pH變化，蛋白質(zhì)的解離反應可簡示如下： 蛋白質(zhì)的陰離子蛋白質(zhì)的陽離子蛋白質(zhì)的兼性離子（等電點） （pH>pI） （pH=pI ） （pH<pI）移向陽極 不移動 移向陰極2、等電點沉淀和電泳等電點沉淀蛋白質(zhì)在

3、等電點時，以兩性離子的形式存在，其總電荷數(shù)為零，這樣的蛋白質(zhì)顆粒在溶液中因為沒有相同電荷而相互排斥的影響，所以極易借靜電引力迅速結合成較大的聚集體，因而易發(fā)生沉淀析出。這一性質(zhì)常在蛋白質(zhì)分離、提純時應用。在等電點時，除了蛋白質(zhì)的溶解度最小外，其導電性、粘度、滲透壓以及膨脹性均為最小。電泳蛋白質(zhì)顆粒在溶液中解離成帶電的顆粒，在直流電場中向其所帶電荷相反的電極移動。這種大分子化合物在電場中定向移動的現(xiàn)象稱為電泳。蛋白質(zhì)電泳的方向、速度主要決定于其所帶電荷的正負性，電荷數(shù)以及分子顆粒的大小。蛋白質(zhì)混合液中，各種蛋白質(zhì)的分子量不同，因而在電場中移動的方向和速度也各不相同。根據(jù)這一原理，就可以從混合液將

4、各種蛋白質(zhì)分離開來。因此電泳法通常用于實驗室、生產(chǎn)或臨床診斷來分析分離蛋白質(zhì)混合物或作為蛋白質(zhì)純度鑒定的手段。如將蛋白質(zhì)溶液點在浸了緩沖液的支持物上進行電泳，不同組分形成帶狀區(qū)域，稱為區(qū)帶電泳。其中用濾紙做支持物的稱紙上電泳（如下圖）。這種方法比較簡便，為一般實驗室所采用。近年來，用醋酸纖維薄膜作支持物進行電泳，速度快，分析效果好，定量比較準確，已逐漸取代紙上電泳。清蛋白 1 2 球蛋白圖 我國正常人血清蛋白質(zhì)紙上電泳圖二、膠體性質(zhì)由于蛋白質(zhì)的分子量很大，又由于其分子表面有許多極性基團，親水性極強，易溶于水成為穩(wěn)定的親水膠體溶液。故它在水中能夠形成膠體溶液。蛋白質(zhì)溶液具有膠體溶液的典型性質(zhì)，如

5、丁達爾現(xiàn)象、布郎運動等。由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過半透膜，因此可以應用透析法將非蛋白的小分子雜質(zhì)除去。1、蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性與它的分子量大小、所帶的電荷和水化作用有關。其主要決定因素如下：第一是水化膜，因為蛋白質(zhì)分子顆粒表面帶有很多親水基，如NH2、COOH、OH、 SH、CONH2等。對水有較強的吸引力，水又是一種極性分子，當水與蛋白質(zhì)相遇時，就很容易被蛋白質(zhì)吸住，在蛋白質(zhì)外面形成一層水膜。第二是表面電荷層，蛋白質(zhì)是兩性離子，顆粒表面帶有電荷，在酸性溶液帶正電荷，在堿性溶液中帶負電荷，同性電荷互相排斥。由于水膜和電荷的存在，把蛋白質(zhì)顆粒相互隔開，使顆粒之間不會因

6、碰撞而聚成大顆粒，這樣蛋白質(zhì)的溶液就比較穩(wěn)定，不易沉淀。如果改變?nèi)芤旱臈l件，將影響蛋白質(zhì)的溶解性質(zhì)在適當?shù)臈l件下，蛋白質(zhì)能夠從溶液中沉淀出來。2、蛋白質(zhì)的膜過濾分離純化蛋白質(zhì)在水中形成的膠體溶液，由于顆粒大，不能通過半透膜可用羊皮紙、火棉膠、玻璃紙等來分離純化蛋白質(zhì)，這個方法稱透析法。具體的操作是將含有小分子雜質(zhì)的蛋白質(zhì)放入一個透析袋中，然后將此袋放入流動的清水中進行透析，此時小分子化合物不斷地從透析袋中滲出，而大分子蛋白質(zhì)留在袋內(nèi)，經(jīng)過一定時間后，就可達到純化目的，這是實驗室或工業(yè)生產(chǎn)上提純蛋白質(zhì)時廣泛應用的方法。三、沉淀作用1、概念蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性決定于其顆粒表面的水化膜和電荷，當這

7、兩個因素遭到破壞后，蛋白質(zhì)溶液就失去穩(wěn)定性，并發(fā)生凝聚作用，沉淀析出，這種作用稱為蛋白質(zhì)的沉淀作用。蛋白質(zhì)的沉淀作用，在理論上和實際應用均有一定的意義，一般為達到兩種不同的目的：第一，為了分離制備有活性的天然蛋白制品。第二，為了從制品中除去雜蛋白，或者制備失去活性的蛋白質(zhì)制品。蛋白質(zhì)的沉淀作用有兩種類型：（1）可逆沉淀：蛋白質(zhì)結構和性質(zhì)都沒有發(fā)生變化，在適當?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱為非變性沉淀。一般是在溫和條件下，通過改變?nèi)芤旱膒H或電荷狀況，使蛋白質(zhì)從膠體溶液中沉淀分離。（可逆沉淀是分離和純化蛋白質(zhì)的基本方法，如等電點沉淀法、鹽析法和有機溶劑沉淀法等。）（2）不可逆沉

8、淀：在蛋白質(zhì)的沉淀過程中，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀不可能再重新溶解于水，強烈沉淀條件下，不僅破壞了蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質(zhì)的結構和性質(zhì)。由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質(zhì)的結構和性質(zhì)的變化，所以又稱為變性沉淀。2、生產(chǎn)上常用的幾種沉淀蛋白質(zhì)方法（1）用中性鹽沉淀蛋白質(zhì)分離提取蛋白質(zhì)常用硫酸銨（NH4）2SO4、硫酸鈉(Na2SO4)、氯化鈉(NaCl)、硫酸鎂(MgSO4)等中性鹽來沉淀蛋白質(zhì)，這種沉淀蛋白質(zhì)的方法叫鹽析法。有的蛋白質(zhì)溶液中同時含有幾類不同的蛋白質(zhì)，由于不同類的蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀所需要的鹽的濃度不一樣，因而可以用不同的鹽濃度把幾類混合在一起的蛋白質(zhì)分段沉淀析出而加以分離，這種方法稱

9、為分段鹽析。實例分析：血清中加硫酸銨至50%飽和度，則球蛋白先沉淀析出；繼續(xù)再加硫酸銨至飽和，則清蛋白（白蛋白）沉淀析出。鹽析法在實踐中得到廣泛應用，微生物發(fā)酵生產(chǎn)酶制劑就是采用鹽析法的作用原理，從發(fā)酵液中把目的酶分離提取出來的。（2）用水溶性有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)甲醇(CH3OH)、乙醇(CH3CH2OH)、丙酮(CH3COCH3)等有機溶劑是良好的蛋白質(zhì)沉淀劑。因其與水的親和力比蛋白質(zhì)強，故能迅速而有效地破壞蛋白質(zhì)膠體的水膜，從而使蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性大大降低。但一般都要與等電點法配合，即pH調(diào)至等電點，然后再加有機溶劑破壞水膜，則蛋白質(zhì)沉淀效果更好。在對蛋白質(zhì)的影響方面，與鹽析法不同。有機溶劑

10、長時間作用于蛋白質(zhì)會引起變性。因此，用這種方法進行操作時需要注意：（1）低溫操作。提取液和有機溶劑都需要事先冷卻。向提取液中加入有機溶劑時，要邊加邊攪拌，防止局部過熱，引起變性。（2）有機溶劑與蛋白質(zhì)接觸時間不能過長。在沉淀完全的前提下，時間越短越好，要及時分離沉淀，除去有機溶劑。有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)在生產(chǎn)實踐和科學實驗中應用很廣，例如食品級的酶制劑的生產(chǎn)、中草藥注射液和胰島素的制備大都用有機溶劑分離沉淀蛋白質(zhì)。下面討論的幾種方法，在發(fā)生沉淀的同時，蛋白質(zhì)隨之變性失活。因此，它們的使用場合與前述兩種不同。（3）用重金屬鹽沉淀蛋白質(zhì)重金屬鹽中的硝酸銀（AgNO3）、氯化汞（HgCl2）、醋酸鉛Pb

11、（CH3COO-）2、三氯化鐵（FeCl3）、是蛋白質(zhì)的沉淀劑。其沉淀作用的反應式如下：金屬蛋白質(zhì)復合物實例分析：醫(yī)療工作中常用汞試劑的稀水溶液消毒滅菌。服用大量富含蛋白質(zhì)的牛乳或雞蛋清達到解毒。（4）用生物堿試劑沉淀蛋白質(zhì)單寧酸、苦味酸、磷鎢酸、磷鉬酸、鞣酸、三氯醋酸及水楊磺酸等，亦是蛋白質(zhì)的沉淀劑。這是因為這些酸的帶負電荷基團與蛋白質(zhì)帶正電荷基團結合而發(fā)生不可逆沉淀反應的緣故。蛋白質(zhì)復合鹽生化檢驗工作中。常用此類試劑沉淀蛋白質(zhì)。（5）熱凝固沉淀蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)受熱變性后，在有少量鹽類存在或?qū)H調(diào)至等電點，則很容易發(fā)生凝固沉淀。原因可能由于變性蛋白質(zhì)的空間結構解體，疏水基團外露，水膜破壞，同時

12、由于等電點破壞了帶電狀態(tài)等而發(fā)生絮結沉淀。四、蛋白質(zhì)變性蛋白質(zhì)的性質(zhì)與它們的結構密切相關。某些物理或化學因素，能夠破壞蛋白質(zhì)的結構狀態(tài)，引起蛋白質(zhì)理化性質(zhì)改變并導致其生理活性喪失。這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的變性(denaturation)。變性蛋白質(zhì)通常都是固體狀態(tài)物質(zhì)，不溶于水和其它溶劑，也不可能恢復原有蛋白質(zhì)所具有的性質(zhì)。所以，蛋白質(zhì)的變性通常都伴隨著不可逆沉淀。引起變性的主要因素是熱、紫外光、激烈的攪拌以及強酸和強堿等。1、概念天然蛋白質(zhì)分子由于受各種物理和化學因素的影響，有序的空間結構被破壞，致使蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和生物學性質(zhì)都有所改變，但并不導致蛋白質(zhì)一級結構的破壞。這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的變性

13、作用。變性的蛋白質(zhì)叫做變性蛋白質(zhì)，變性蛋白質(zhì)的分子量不變。2、變性因素物理因素。如：加熱、紫外線照射、X射線照射、超聲波、高壓、劇烈搖蕩、攪拌、表面起泡等?；瘜W因素。如：強酸、強堿、脲素、重金屬鹽、三氯醋酸、乙醇、胍、表面活性劑、生物堿試劑等，都可引起蛋白質(zhì)的變性。3、變性的原因可概括如下：蛋白質(zhì)分子的副鍵破壞，致使其空間結構發(fā)生變化。蛋白質(zhì)的結構發(fā)生扭轉(zhuǎn)，使疏水基團暴露在分子表面?；顫娀鶊F，如-COOH、-OH、-NH2等與某些化學試劑發(fā)生反應。 4、變性蛋白質(zhì)的性質(zhì)變性蛋白質(zhì)與天然蛋白質(zhì)有明顯的不同，主要表現(xiàn)在：理化性質(zhì)發(fā)生了變化 如旋光性改變，溶解度降低，粘度增加，光吸收性質(zhì)增強，結晶性

14、破壞，滲透壓降低，易發(fā)生凝集、沉淀。由于側鏈基團外露，顏色反應增強了。生化性質(zhì)發(fā)生了變化 變性蛋白質(zhì)比天然蛋白質(zhì)易被蛋白酶水解。因此，蛋白質(zhì)煮熟食用比生吃好消化。生物活性喪失 這是蛋白質(zhì)變性的最重要的明顯標志之一。例如酶變性失去催化作用，血紅蛋白失去運輸氧的功能，胰島素失去調(diào)節(jié)血糖的生理功能，抗原失去免疫功能等等。5、變性的可逆性蛋白變性隨其性質(zhì)和程度的不同，有可逆的，有不可逆的，如胰蛋白酶加熱及血紅蛋白加酸等變性作用，在輕度時為可逆變性。一般變性后的蛋白質(zhì)即凝固而沉淀，在凝固之前，常呈絮狀而懸浮，稱為絮結作用，只絮結而未凝固的蛋白質(zhì)一般都有可逆性，但已凝固的蛋白質(zhì)，則不易恢復其原來的性質(zhì)，即

15、發(fā)生不可逆變性。6、蛋白質(zhì)變性作用的實踐意義蛋白質(zhì)變性作用不僅廣泛應用于生產(chǎn)實踐，而且在理論上對闡明蛋白質(zhì)結構與功能的關系等問題具有重要意義。蛋白質(zhì)變性作用有有利的一面，也有不利的一面。有利的方面可充分利用，不利的方面則需竭力阻止。五、蛋白質(zhì)的紫外吸收大部分蛋白質(zhì)均含有帶芳香環(huán)的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。這三種氨基酸的在280nm 附近有最大吸收值。因此，大多數(shù)蛋白質(zhì)在280nm 附近顯示強的吸收。利用這個性質(zhì)，可以對蛋白質(zhì)進行定性鑒定。六、蛋白質(zhì)的顏色反應蛋白質(zhì)的顏色反應，可以用來定性、定量測定蛋白質(zhì)。1、雙縮脲反應蛋白質(zhì)溶液中加入NaOH或KOH及少量的硫酸銅溶液，會顯現(xiàn)從淺紅色到藍紫色的

16、一系列顏色反應。這是由于蛋白質(zhì)分子中肽鍵結構的反應，肽鍵越多產(chǎn)生的顏色越紅。所謂雙縮脲是指二分子尿素加熱到1800C脫氨縮合的產(chǎn)物，此化合物也具有同樣的顏色反應，蛋白質(zhì)分子中含有許多和雙縮脲結構相似的肽鍵，所以稱蛋白質(zhì)的反應為雙縮脲反應。尿素雙縮脲雙縮脲銅鉀氫氧化物雙縮脲通?？捎么朔磻獊矶ㄐ澡b定蛋白質(zhì)，也可根據(jù)反應產(chǎn)生的顏色在540nm處進行比色分析，定量測定蛋白質(zhì)的含量。2、黃色反應 加濃硝酸于蛋白質(zhì)溶液中即有白色沉淀生成，再加熱則變黃，遇堿則使顏色加深而呈橙黃，這是由于蛋白質(zhì)中含有酪氨酸、苯丙氨酸及色氨酸，這些氨基酸具有苯基，而苯基與濃硝酸起硝化作用，產(chǎn)生黃色的硝基取代物，遇到堿又形成鹽，后者呈橙黃色的緣故。皮膚接觸到硝酸變成黃色，也是這個道理。3、乙醛酸反應 蛋白質(zhì)溶液中加入乙醛酸，混合后，緩慢地加入濃硫酸，硫酸沉在底部，液體分為兩層，在兩層界面處出現(xiàn)紫色環(huán)，這是蛋白質(zhì)中的色氨酸與乙醛酸反應引起的顏色反應，故此法可用于檢查蛋白質(zhì)中是否含有色氨酸。4、米倫反應 含有酪氨酸的蛋白質(zhì)溶液，加入米倫試劑（硝酸汞、亞硝酸汞、硝酸及亞硝酸的混合液）后加熱即顯磚紅色