細(xì)胞的傳代凍存復(fù)蘇

1、細(xì)胞傳代、凍存與復(fù)蘇細(xì)胞傳代、凍存與復(fù)蘇細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念n 傳代：傳代：n細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長(zhǎng)一定時(shí)間后，被分開接種到新的培養(yǎng)器皿中。n 原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)n取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。n 原代培養(yǎng)細(xì)胞的生命歸宿n原代培養(yǎng)期n傳代期傳代期n衰退期n有限細(xì)胞系，無(wú)限細(xì)胞系 n細(xì)胞系 cell linen細(xì)胞株 cell strainn初代培養(yǎng)物開始第一次傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞，即稱之為細(xì)胞系。如細(xì)胞系的生存期有限，則稱之為有限細(xì)胞系（Finite Cell Line）；已獲無(wú)限繁殖能力能持續(xù)生存的細(xì)胞系，稱連續(xù)細(xì)胞系或無(wú)限細(xì)胞系（Infinite Cell Lin

2、e）。n從一個(gè)經(jīng)過(guò)生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系用單細(xì)胞分離培養(yǎng)或通過(guò)篩選的方法，由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群，稱細(xì)胞株。 培養(yǎng)細(xì)胞的特性n 培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)方式n貼附生長(zhǎng)：n 必須貼附于支持物表面才能生長(zhǎng)。見(jiàn)于各種實(shí)體瘤細(xì)胞n懸浮生長(zhǎng)：n 于懸浮狀態(tài)下即可生長(zhǎng)，不需要貼附于支持物表面。見(jiàn)于各種造血系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞 每代貼附生長(zhǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程n游離期n貼壁期n潛伏期n對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期n停止期（平臺(tái)期）n游離期：n細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮 狀態(tài)也稱懸浮期。此時(shí)細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。n10分鐘一4小時(shí)n貼壁期：n細(xì)胞附著于底物上，游離期 結(jié)束。細(xì)胞株平均在10分鐘一4小時(shí)貼壁。n底物：膠原、玻璃、塑料、其它細(xì)胞等n血清

3、中有促使細(xì)胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生長(zhǎng)基質(zhì)），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細(xì)胞再與吸附有促貼壁因子的附著。n進(jìn)口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長(zhǎng)基質(zhì)（化學(xué)合成的功能基團(tuán)）n潛伏期n此時(shí)細(xì)胞有生長(zhǎng)話動(dòng)，而無(wú)細(xì)胞分裂。細(xì)胞株潛伏期 一般為624小時(shí)。n對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：n細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng)，活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。n停止期（平臺(tái)期）：n細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂n機(jī)制：接觸抑制、密度依賴性培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的條件n1 細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需要n2 細(xì)胞的生存環(huán)境n 溫度: 37 n O2n CO2: 5% CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3-n pH:

4、7.2-7.4n 滲透壓n 3 無(wú)污染n 4 無(wú)毒 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)用品：實(shí)驗(yàn)用品：n超凈工作臺(tái)，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸nCO2培養(yǎng)箱n倒置顯微鏡n酶標(biāo)儀、微孔板震蕩器n液氮罐n自動(dòng)雙重純水蒸餾器，純水儀n耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動(dòng)吸引器，培養(yǎng)板， 凍存管n壓力蒸汽消毒器：壓力蒸汽消毒器：濕熱消毒，用途廣n電熱干燥箱：電熱干燥箱：干熱消毒（160 ，2小時(shí)）。主要用干玻璃n器皿消毒 n濾器：濾器：過(guò)濾除菌：大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、 n酶液等均采用濾過(guò)法除菌 n超凈工作臺(tái)：超凈工作臺(tái)：為細(xì)胞操作提供無(wú)菌環(huán)境n紫外燈紫外燈 ：紫外線消毒。 主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺(tái)、塑料

5、n培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒 超凈臺(tái)n n超凈工作臺(tái)的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣遁過(guò)高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過(guò)工作臺(tái)面，使工作臺(tái)內(nèi)構(gòu)成無(wú)菌環(huán)境。 濾 器 CO2培養(yǎng)箱nCO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37 ，5CO2 。n使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題：n 用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋微松，以保證通氣。n 保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒n（90 ，14 h)。n箱內(nèi)火菌蒸餾水3000毫升蒸餾水槽中以保持箱內(nèi)濕度，避兔培養(yǎng)液蒸發(fā)。自動(dòng)雙重純水蒸餾器 純水儀酶標(biāo)儀 微孔板震蕩器培 養(yǎng) 板 培養(yǎng)瓶 n浸泡（自來(lái)水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（浸泡（自來(lái)水）、刷洗（洗

6、衣粉）、酸泡（24小時(shí)）、小時(shí)）、n流水沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、流水沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、50烘干烘干n常用玻璃器皿清洗n胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離n胰蛋白酶液濃度越高，作用越強(qiáng)，但超過(guò)一定限度會(huì)損傷細(xì)胞。n胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無(wú)Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是0.25 。用濾器過(guò)濾除菌。n胰蛋白酶液消化時(shí)間：2-10分鐘。n用含血清培養(yǎng)液終止其對(duì)細(xì)胞的消化作用 消化液：培養(yǎng)基n培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。n天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基：n天然培養(yǎng)基

7、有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。n優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好n缺點(diǎn)：來(lái)源受限。成分復(fù)雜，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。易發(fā)生支原體污染 n合成培養(yǎng)基:n合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計(jì)出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。n合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無(wú)機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。n優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定。成本低 n缺點(diǎn)： 缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長(zhǎng)需要。 n人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如

8、血清）。 n血清中含有：n多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）n多種金屬離子； n激素；n促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。n各種生長(zhǎng)因子n轉(zhuǎn)移蛋白n不明成分n一般說(shuō)來(lái)含5小牛血清的培養(yǎng)基對(duì)大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死但支持細(xì)胞生長(zhǎng)一般需加 10血清n對(duì)于血清支持細(xì)因生長(zhǎng)的生物學(xué)效應(yīng)已得到證明，但對(duì)血清中的復(fù)雜成分至今尚未完全清楚n血清中不僅存在促細(xì)胞生長(zhǎng)因子，同對(duì)也存在細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子或毒性因子，因此在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞所反映的生物學(xué)特性是細(xì)胞和復(fù)雜血清因子的綜合反應(yīng)。n在生長(zhǎng)因子、蛋白質(zhì)工程、基因表達(dá)調(diào)控等研究領(lǐng)域，迫切需要用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞n無(wú)血清培養(yǎng)基的主要研制策略

9、：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補(bǔ)充各種必需因子，如激素、生長(zhǎng)因子 、結(jié)合蛋白 、貼壁和擴(kuò)展因子 等。n無(wú)血清培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補(bǔ)充成分組成。n1975年，Sato首次成功地用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)了垂體細(xì)胞株，近20多年來(lái)已報(bào)道了幾十種細(xì)胞系在無(wú)血清培養(yǎng)基中成功地生長(zhǎng)和增殖。n無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基的使用保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和穩(wěn)定性，減少了細(xì)胞污染，簡(jiǎn)化了提純和鑒定各種細(xì)胞產(chǎn)物的程序。n向無(wú)清培養(yǎng)液中能促進(jìn)細(xì)胞系生長(zhǎng)的補(bǔ)加物都是獨(dú)特的。適用于某種細(xì)胞株的培養(yǎng)液，很可能不適合另一種細(xì)胞株的生長(zhǎng)。即使同源組織的不同細(xì)胞株，所需補(bǔ)加物也不同。 無(wú)血清培養(yǎng)基尚處于研究階段，難以推廣。 目前，絕大多數(shù)人工

10、合成培養(yǎng)基使用時(shí)還需添加血清 n血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。n常用血清有胎牛血潔、新生牛血清、小牛血情、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。n優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無(wú)沉淀物，無(wú)細(xì)菌、支原體、病毒污染。n血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）：56 ，30 分鐘n血清的消毒：過(guò)濾除菌n抗菌素的使用：n在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細(xì)菌的生長(zhǎng)。n通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。n慶大霉素：每毫升100單位方便、廣譜、穩(wěn)定完全培養(yǎng)基的組成n基礎(chǔ)培養(yǎng)基 80一95n血清 5一20n碳酸氫鈉 2.0 g/Ln青、鏈霉素 各

11、100卑位毫升培養(yǎng)基的配制 RPMI-1640培養(yǎng)粉 1袋 碳酸氫鈉 2.0 g 青、鏈霉素 各100單位毫升 加三蒸水 至 1000ml, 過(guò)濾除菌。 調(diào)節(jié)pH值至7.2 加血清（終濃度 10） 細(xì)胞傳代方法n 根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的恃點(diǎn)，傳代方法有3種。1.懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代n 離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。n 直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時(shí)，將上清培養(yǎng)液去除1/2一2/3，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。2 半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代（Hela細(xì)胞）n此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使紉胞從瓶壁脫落下來(lái)，進(jìn)行傳代。3貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代

12、n 采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代方法：n1. 吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液n2.加入1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個(gè)瓶底為準(zhǔn)）靜置2-10 min（顯微鏡下動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)）。n3. 吸去胰蛋白酶液，加入培養(yǎng)液。n4. 用吸管吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液。n5. 吸取1/101/40細(xì)胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。n6. 加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細(xì)胞懸液的新培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。n7. 將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞計(jì)數(shù)n血細(xì)胞計(jì)數(shù)器：手工計(jì)數(shù)細(xì)胞nCoulter計(jì)數(shù)儀：人工計(jì)數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞活力測(cè)定n細(xì)胞活力測(cè)定是腫瘤體外研究中應(yīng)用最廣的技術(shù)手段之

13、一。 n任何培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)生長(zhǎng)的細(xì)胞都由死細(xì)胞和活細(xì)胞組成，從形態(tài)上區(qū)別死、活細(xì)胞是困難的。n1. 細(xì)胞克隆形成率實(shí)驗(yàn)： 單個(gè)細(xì)胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細(xì)胞群體形成肉眼可見(jiàn)的克隆?？寺⌒纬勺溆脕?lái)表示細(xì)胞的增殖能力。 n克隆形成率比克隆形成數(shù)接種細(xì)胞數(shù)n缺點(diǎn)：操作繁瑣n優(yōu)點(diǎn)：精確、可靠n2.臺(tái)盼藍(lán)法n活細(xì)胞不被染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色，用活細(xì)胞占細(xì)胞中的百分比表示細(xì)胞恬力 n已淘汰n3. 四唑鹽（MTT）比色法四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍(lán)，n四唑鹽比色法的原理：活細(xì)胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍(lán)紫色產(chǎn)物（formazan)，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒(méi)有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能

14、溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值nMTT法簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細(xì)胞毒牲試驗(yàn)、腫瘤放射敏感性實(shí)驗(yàn)等。n操作步驟n（1）單細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板；103-104細(xì)胞/孔，每孔培養(yǎng)基總量200微升（96孔培養(yǎng)板每孔容積370微升），37、5nCO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時(shí)間（根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康臎Q定培養(yǎng)時(shí)間）n（2）加入2毫克毫升的MTT液（50微升孔）；繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)。n（3）吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSO液（150微升孔），將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩10分鐘，使結(jié)晶物溶解。n（4）酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD值（檢測(cè)波長(zhǎng)570納米）

15、。記錄結(jié)果，繪制 什么時(shí)候傳代？什么時(shí)候傳代？細(xì)胞消化的最佳程度細(xì)胞消化的最佳程度細(xì)胞凍存和復(fù)蘇n細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少入力、經(jīng)費(fèi)，減少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化。凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融n當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。n n 如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反結(jié)晶就大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過(guò)程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。慢凍程序n標(biāo)準(zhǔn)程序：n 當(dāng)溫度在-25 以上時(shí)， 12 /minn 當(dāng)溫度達(dá)-25

16、以下時(shí)， 510 /minn 當(dāng)溫度達(dá)-100時(shí)，可迅速放入液氮中n 細(xì)胞凍存器n簡(jiǎn)易程序：n 將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過(guò)線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降12 的速度，在40分鐘內(nèi)降至液氮表面，停30分鐘后，直接投人液氮中。低溫保護(hù)劑的應(yīng)用n在細(xì)胞凍存時(shí)加入溫保護(hù)劑，能大大提高凍存效果。n常用的低溫保護(hù)劑是DMSO，它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對(duì)水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過(guò)程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。細(xì)胞凍存方法n1預(yù)先配制凍存液： 含20%血清培養(yǎng)基10% DMS