食品理化檢驗(yàn) 維生素的測(cè)定

1、第十一章第十一章 食品中維生素的測(cè)定食品中維生素的測(cè)定Determination of Vitamin in Food一、概述一、概述 二、脂溶性維生素的測(cè)定（重點(diǎn)、難點(diǎn)）二、脂溶性維生素的測(cè)定（重點(diǎn)、難點(diǎn)） 三、水溶性維生素的測(cè)定（重點(diǎn)、難點(diǎn)）三、水溶性維生素的測(cè)定（重點(diǎn)、難點(diǎn)）一、概述一、概述 （一）維生素的分類及共性（一）維生素的分類及共性（二）常見維生素的生理功能（二）常見維生素的生理功能 （三）（三） 維生素的測(cè)定意義維生素的測(cè)定意義 （一）維生素的分類（一）維生素的分類 目前已發(fā)現(xiàn)的維生素約有二、三十種，按目前已發(fā)現(xiàn)的維生素約有二、三十種，按溶解性溶解性可可分為兩大類：分為兩大類：

2、脂溶性維生素：脂溶性維生素：A、D、E、K等等；水溶性維生素：水溶性維生素：B B、C C等（如等（如B1、B2、B6、B12和和C等）等）維生素都具有以下共同特點(diǎn)：維生素都具有以下共同特點(diǎn)： 這些化合物或其前體化合物都在天然食物中存在；這些化合物或其前體化合物都在天然食物中存在； 它們不能供給機(jī)體熱能；也不是構(gòu)成組織的基本原料；它們不能供給機(jī)體熱能；也不是構(gòu)成組織的基本原料； 主要功用是通過作為輔酶的成份調(diào)節(jié)代謝過程，需要量主要功用是通過作為輔酶的成份調(diào)節(jié)代謝過程，需要量 極小；極??； 它們一般在體內(nèi)不能合成，或合成量不能滿足生理需要，它們一般在體內(nèi)不能合成，或合成量不能滿足生理需要，必須經(jīng)

3、常從食物中攝??；必須經(jīng)常從食物中攝??； 長期缺乏任何一種維生素都會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的疾病。長期缺乏任何一種維生素都會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的疾病。維生素維生素A：是人體必需營養(yǎng)素，能促進(jìn)人體發(fā)育，防止眼膜是人體必需營養(yǎng)素，能促進(jìn)人體發(fā)育，防止眼膜 炎、夜盲癥等疾病。炎、夜盲癥等疾病。維生素維生素B B1 1：也叫硫胺素，對(duì)人體的功能主要是防腳氣病、神經(jīng)也叫硫胺素，對(duì)人體的功能主要是防腳氣病、神經(jīng) 炎，幫助消化，促進(jìn)發(fā)育。炎，幫助消化，促進(jìn)發(fā)育。維生素維生素B B2 2：對(duì)人體功能防口角炎、皮膚炎，防止怕光現(xiàn)象。對(duì)人體功能防口角炎、皮膚炎，防止怕光現(xiàn)象。維生素維生素C C：防壞血病，促進(jìn)外傷愈合，使機(jī)體增強(qiáng)抵抗力。防

4、壞血病，促進(jìn)外傷愈合，使機(jī)體增強(qiáng)抵抗力。維生素維生素D D：調(diào)節(jié)體內(nèi)礦物鹽的平衡，特別是對(duì)人體內(nèi)鈣、磷的調(diào)節(jié)體內(nèi)礦物鹽的平衡，特別是對(duì)人體內(nèi)鈣、磷的 代謝，并能防止軟骨病。代謝，并能防止軟骨病。 （二）常見維生素的生理功能（二）常見維生素的生理功能（三）維生素的測(cè)定意義（三）維生素的測(cè)定意義評(píng)價(jià)食品的營養(yǎng)價(jià)值；評(píng)價(jià)食品的營養(yǎng)價(jià)值；開發(fā)利用富含維生素的食品資源；開發(fā)利用富含維生素的食品資源；指導(dǎo)人們合理調(diào)整膳食結(jié)構(gòu)，防止維生素缺乏癥；指導(dǎo)人們合理調(diào)整膳食結(jié)構(gòu)，防止維生素缺乏癥；研究維生素在食品加工、貯存等過程中的穩(wěn)定性，指導(dǎo)制定研究維生素在食品加工、貯存等過程中的穩(wěn)定性，指導(dǎo)制定合理的生產(chǎn)工藝條

5、件及貯存條件，最大限度地保留各種維生合理的生產(chǎn)工藝條件及貯存條件，最大限度地保留各種維生素；素；監(jiān)督維生素強(qiáng)化食品的強(qiáng)化劑量，防止維生素?cái)z入過多引起監(jiān)督維生素強(qiáng)化食品的強(qiáng)化劑量，防止維生素?cái)z入過多引起中毒。中毒。二、脂溶性維生素的測(cè)定二、脂溶性維生素的測(cè)定v脂溶性維生素的理化性質(zhì)脂溶性維生素的理化性質(zhì)v脂溶性維生素的測(cè)定方法脂溶性維生素的測(cè)定方法 常與脂類物質(zhì)共存于食物中，攝食時(shí)一道被人體吸收。常與脂類物質(zhì)共存于食物中，攝食時(shí)一道被人體吸收。 1.1.溶解性：溶解性：不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有機(jī)溶劑；苯等有機(jī)溶劑； 2.2

6、.耐酸堿性：耐酸堿性：維生素維生素A A、D D對(duì)酸不穩(wěn)定，對(duì)堿穩(wěn)定；對(duì)酸不穩(wěn)定，對(duì)堿穩(wěn)定； 維生素維生素E E對(duì)酸穩(wěn)定，對(duì)堿不穩(wěn)定，但在抗氧化劑存在對(duì)酸穩(wěn)定，對(duì)堿不穩(wěn)定，但在抗氧化劑存在下或惰性氣體保護(hù)下，也能經(jīng)受堿的煮沸。下或惰性氣體保護(hù)下，也能經(jīng)受堿的煮沸。（一）脂溶性維生素的主要理化性質(zhì)（一）脂溶性維生素的主要理化性質(zhì) 3 3耐熱性、耐氧化性：耐熱性、耐氧化性： 耐熱性耐熱性 氧化性氧化性VA 好，能經(jīng)受煮沸好，能經(jīng)受煮沸 易被氧化易被氧化 （光、熱促其氧化）光、熱促其氧化） V D 好，能經(jīng)受煮沸好，能經(jīng)受煮沸 不易被氧化不易被氧化 V E 好，能經(jīng)受煮沸好，能經(jīng)受煮沸 在空氣中能慢

7、慢被氧化在空氣中能慢慢被氧化 （光、熱、堿促其氧化）（光、熱、堿促其氧化） 根據(jù)上述性質(zhì)，測(cè)定脂溶性維生素時(shí)，通常：根據(jù)上述性質(zhì)，測(cè)定脂溶性維生素時(shí)，通常：皂化樣品皂化樣品 類脂物和維生素分開類脂物和維生素分開 有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑提取脂溶性維生素提取脂溶性維生素(不皂化物不皂化物) 濃縮濃縮 溶于適當(dāng)溶于適當(dāng)?shù)娜軇┑娜軇?測(cè)定。測(cè)定。 （食物中脂溶性維生素常與脂肪共存，一道被人體吸（食物中脂溶性維生素常與脂肪共存，一道被人體吸收，所以要除去脂肪，防止干擾。）收，所以要除去脂肪，防止干擾。） 在皂化和濃縮時(shí)，為在皂化和濃縮時(shí)，為防止維生素的氧化分解防止維生素的氧化分解，常加，常加入入抗氧化劑抗氧化

8、劑(如焦性沒食子酸、如焦性沒食子酸、維生素維生素C等等)。 對(duì)于對(duì)于A、D、E共存的樣品，或雜質(zhì)含量高的樣品，共存的樣品，或雜質(zhì)含量高的樣品，在皂化提取后，還需進(jìn)行層析分離。在皂化提取后，還需進(jìn)行層析分離。常用的測(cè)定方法有常用的測(cè)定方法有: 薄層色譜法、分光光度法、氣相薄層色譜法、分光光度法、氣相色譜法、高效液相色譜法等。色譜法、高效液相色譜法等。高效液相色譜法：高效液相色譜法：快速、高效、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，快速、高效、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)， 是我國衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)分析方法是我國衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)分析方法 （二）脂溶性維生素的測(cè)定方法（二）脂溶性維生素的測(cè)定方法 食品中食品中VA和和VE的測(cè)定的測(cè)定 （GB5009.8

9、2-2003)維生素維生素A A：存在于動(dòng)物性脂肪中，主要來源于肝臟、魚干油、存在于動(dòng)物性脂肪中，主要來源于肝臟、魚干油、蛋類、乳類等動(dòng)物性食品中；蛋類、乳類等動(dòng)物性食品中；植物性食品中不合植物性食品中不合VA，但在深色果蔬中含有胡蘿，但在深色果蔬中含有胡蘿卜素，它在人體內(nèi)可轉(zhuǎn)變?yōu)椴匪兀谌梭w內(nèi)可轉(zhuǎn)變?yōu)閂A，故稱為，故稱為VA原原;包括包括A1和和A2。維生素維生素E E： （第一法）（第一法）HPLC測(cè)定測(cè)定VA和和VE 一、原理一、原理 食品樣品經(jīng)食品樣品經(jīng)皂化處理皂化處理后，用后，用有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑將食品中的將食品中的脂溶性維生素脂溶性維生素（如維生素（如維生素A A、維生素、維生素E

10、 E）從不可皂化）從不可皂化的部分的部分提取提取出來，經(jīng)過出來，經(jīng)過濃縮濃縮除去有機(jī)溶劑，再用適除去有機(jī)溶劑，再用適當(dāng)?shù)漠?dāng)?shù)娜軇┤芙馊軇┤芙夂?，用后，用HPLCHPLC法法C C1818反相柱將反相柱將V VA A和和V VE E分離，分離，經(jīng)紫外檢測(cè)器，經(jīng)紫外檢測(cè)器，用內(nèi)標(biāo)法用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定其含量。測(cè)定其含量。 二、樣品處理二、樣品處理 （1 1）皂化：）皂化： 稱取適量樣品（含稱取適量樣品（含VA30g,VE40g）于三）于三角瓶中，加角瓶中，加30mL無水乙醇，振搖使樣品分散；無水乙醇，振搖使樣品分散；加入加入5mL，100g/L抗壞血酸和抗壞血酸和2mL苯并苯并e芘溶芘溶液（內(nèi)標(biāo)）混勻，加

11、入液（內(nèi)標(biāo)）混勻，加入10mL氫氧化鉀氫氧化鉀(1:1) ，混，混勻，于沸水浴上勻，于沸水浴上 回流回流30min，使皂化完全（若有，使皂化完全（若有混濁現(xiàn)象，表示皂化完全），皂化后立即放入冰混濁現(xiàn)象，表示皂化完全），皂化后立即放入冰水中冷卻；水中冷卻； （2 2）提?。海┨崛。?將皂化液移入分液漏斗，先用將皂化液移入分液漏斗，先用50mL50mL水分水分2 2次洗次洗滌皂化瓶（若有渣，可經(jīng)過脫脂棉過濾），再用滌皂化瓶（若有渣，可經(jīng)過脫脂棉過濾），再用100mL100mL無水乙醚分無水乙醚分2 2次洗滌皂化瓶及殘?jiān)?，所有乙次洗滌皂化瓶及殘?jiān)幸颐严匆翰⑷敕忠郝┒分?，振搖兩分鐘（注意放醚洗液

12、并入分液漏斗中，振搖兩分鐘（注意放氣），靜止分層后，棄去水層；然后每次用氣），靜止分層后，棄去水層；然后每次用100mL100mL水將乙醚液洗至中性，需洗水將乙醚液洗至中性，需洗4-54-5次。次。 （3 3）濃縮：）濃縮： 將乙醚提取液經(jīng)無水硫酸鈉濾入將乙醚提取液經(jīng)無水硫酸鈉濾入150mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶內(nèi)，用約旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶內(nèi)，用約15mL 乙醚洗滌分液漏斗和無水硫酸鈉乙醚洗滌分液漏斗和無水硫酸鈉2次，洗液并入蒸發(fā)瓶中，次，洗液并入蒸發(fā)瓶中，于于55水水浴中減壓蒸餾浴中減壓蒸餾并回收乙醚，待瓶中并回收乙醚，待瓶中乙醚剩余約乙醚剩余約2mL時(shí)，取下蒸發(fā)瓶，時(shí)，取下蒸發(fā)瓶，用氮?dú)獯蹈梢颐?，隨即加入用氮?dú)?/p>

13、吹干乙醚，隨即加入2mL乙乙醇，充分混合、溶解提取物。將乙醇，充分混合、溶解提取物。將乙醇移入塑料離心管中，于離心機(jī)上醇移入塑料離心管中，于離心機(jī)上離心離心5min，上清液供色譜分析用。，上清液供色譜分析用。 三、所需主要儀器三、所需主要儀器 高效液相色譜（帶紫外分光檢測(cè)器）高效液相色譜（帶紫外分光檢測(cè)器） 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 高速離心機(jī)（帶離心管）高速離心機(jī)（帶離心管） 恒溫水浴鍋恒溫水浴鍋 紫外分光光度計(jì)紫外分光光度計(jì)說明：國標(biāo)中用其來標(biāo)定說明：國標(biāo)中用其來標(biāo)定VA和和VE的濃度的濃度 四、液相色譜分析四、液相色譜分析色譜參考條件：色譜參考條件：預(yù)柱：預(yù)柱：ODS 10m（4mmx4.5

14、cm)分析柱：分析柱：ODS 5m（4.6mmx25cm)流動(dòng)相：甲醇：水流動(dòng)相：甲醇：水98：2，混勻，臨用前脫氣；，混勻，臨用前脫氣；紫外檢測(cè)器波長：紫外檢測(cè)器波長：300nm，量程，量程0.02；進(jìn)樣量：進(jìn)樣量：20L;流速：流速：1.651.70mL/min測(cè)定（1）配制標(biāo)準(zhǔn)溶液）配制標(biāo)準(zhǔn)溶液VA標(biāo)準(zhǔn)溶液：標(biāo)準(zhǔn)溶液：將將VA標(biāo)準(zhǔn)品用無水乙醇溶解配制成濃度為標(biāo)準(zhǔn)品用無水乙醇溶解配制成濃度為1mg/ml;VE標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)溶液:用無水乙醇分別溶解用無水乙醇分別溶解-生育酚、生育酚、-生育酚、生育酚、-生育生育酚酚3種標(biāo)準(zhǔn)品，配制成濃度為種標(biāo)準(zhǔn)品，配制成濃度為1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)液；的標(biāo)準(zhǔn)液；內(nèi)

15、標(biāo)溶液內(nèi)標(biāo)溶液：將苯并：將苯并e芘用無水乙醇配制成濃度為芘用無水乙醇配制成濃度為10g/ml;（2）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線將一定量的將一定量的VA標(biāo)準(zhǔn)溶液、標(biāo)準(zhǔn)溶液、3種種VE標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液混和均勻，標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液混和均勻，對(duì)其混和液進(jìn)行色譜分析，以維生素峰面積和內(nèi)標(biāo)物峰面積之比對(duì)其混和液進(jìn)行色譜分析，以維生素峰面積和內(nèi)標(biāo)物峰面積之比為縱坐標(biāo)，以維生素濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（直線回歸方為縱坐標(biāo)，以維生素濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（直線回歸方程）。程）。（3 3）樣品測(cè)定）樣品測(cè)定取試樣濃縮液取試樣濃縮液20l注入色譜儀中，進(jìn)行檢測(cè)；注入色譜儀中，進(jìn)行檢測(cè)；定性：定性：用標(biāo)準(zhǔn)物色

16、譜峰的保留時(shí)間定性；用標(biāo)準(zhǔn)物色譜峰的保留時(shí)間定性；定量：定量：根據(jù)色譜圖求出某種維生素峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰根據(jù)色譜圖求出某種維生素峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰 面積的面積的比值，以此比值由回歸方程求出維生素含量；比值，以此比值由回歸方程求出維生素含量；五、結(jié)果計(jì)算五、結(jié)果計(jì)算X：某種維生素的含量，：某種維生素的含量，mg/100g：由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到的某種維生素含量，：由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到的某種維生素含量，g/mLV：樣品濃縮后定容體積：樣品濃縮后定容體積,mL m：樣品質(zhì)量，：樣品質(zhì)量，g1000100mX水溶性維生素的理化性質(zhì)水溶性維生素的理化性質(zhì)維生素維生素B B1 1的測(cè)定的測(cè)定維生素維生素B B2 2的測(cè)

17、定的測(cè)定維生素維生素C C的測(cè)定的測(cè)定 三、水溶性維生素的測(cè)定三、水溶性維生素的測(cè)定 易溶于水，不溶于大部分有機(jī)溶劑；易溶于水，不溶于大部分有機(jī)溶劑； 在酸性介質(zhì)中穩(wěn)定，在堿性條件下不穩(wěn)定；在酸性介質(zhì)中穩(wěn)定，在堿性條件下不穩(wěn)定； 易受空氣、光、熱、酶、金屬離子的影響。易受空氣、光、熱、酶、金屬離子的影響。 （一）水溶性維生素的主要理化性質(zhì)（一）水溶性維生素的主要理化性質(zhì)（二）維生素（二）維生素B B1 1的測(cè)定的測(cè)定 VB VB1 1又叫硫胺素、抗神經(jīng)炎素又叫硫胺素、抗神經(jīng)炎素 1 1、食品中、食品中VBVB1 1的存在形式的存在形式 常以游離態(tài)存在；常以游離態(tài)存在； 復(fù)合脂形式存在（磷蛋白）

18、；復(fù)合脂形式存在（磷蛋白）； 輔羧酶形式存在輔羧酶形式存在 VBVB1 1在酵母、米糠、麥胚、花生、黃豆以及綠色在酵母、米糠、麥胚、花生、黃豆以及綠色的蔬菜和牛乳、蛋黃中比較豐富，的蔬菜和牛乳、蛋黃中比較豐富，動(dòng)物組織不如植物動(dòng)物組織不如植物含量豐富。含量豐富。 VB1 1在在中性、堿性下不穩(wěn)定中性、堿性下不穩(wěn)定，易分解；，易分解； VB1 1在在酸性條件下穩(wěn)定酸性條件下穩(wěn)定，即使加熱酸性也穩(wěn)定；，即使加熱酸性也穩(wěn)定； VB1 1為白色結(jié)晶，微溶于為白色結(jié)晶，微溶于C2 2H5 5OH，不溶于乙醚，不溶于乙醚或或CHCl3 3，易溶于水易溶于水。2.VB2.VB1 1的性質(zhì)的性質(zhì) 3. 3.維

19、生素維生素B B1 1的測(cè)定方法的測(cè)定方法 紫外分光光度法紫外分光光度法: : 適用于適用于VBVB1 1含量高的樣品含量高的樣品, ,靈敏度和準(zhǔn)靈敏度和準(zhǔn) 確度較差確度較差; ; 高效液相色譜法高效液相色譜法 適用于食品中微量適用于食品中微量VBVB1 1的測(cè)定的測(cè)定 熒光法熒光法 世界各國都用熒光法測(cè)定世界各國都用熒光法測(cè)定; ; 熒光法熒光法是我國國家標(biāo)準(zhǔn)分析方法是我國國家標(biāo)準(zhǔn)分析方法（GB/T 5009.84-2003GB/T 5009.84-2003） 原理：原理： 硫胺素硫胺素在堿性鐵氰化鉀溶液中，在堿性鐵氰化鉀溶液中，被氧化成被氧化成一一種蘭色熒光物質(zhì)，即為種蘭色熒光物質(zhì)，即為硫

20、色素硫色素，在，在紫外光紫外光下，下，硫硫色素發(fā)出熒光色素發(fā)出熒光，在一定條件下，其，在一定條件下，其熒光強(qiáng)度與硫熒光強(qiáng)度與硫色素濃度成正比色素濃度成正比，即與硫胺素含量成正比。，即與硫胺素含量成正比。v（2）定量方法）定量方法標(biāo)準(zhǔn)曲線法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法： 配制一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度試樣測(cè)定熒光強(qiáng)度，繪制配制一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度試樣測(cè)定熒光強(qiáng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再在相同條件下測(cè)量未知試樣的熒光強(qiáng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，再在相同條件下測(cè)量未知試樣的熒光強(qiáng)度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出濃度。度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出濃度。(3). 操作步驟操作步驟 試樣處理 樣品勻漿（或粉碎）于低溫冰箱中冷凍保存。 提取 1) 水解 2) 酶解稱樣三角瓶三角瓶高

21、壓水解高壓水解鹽酸溶液鹽酸溶液調(diào)調(diào)pHpH值值乙酸鈉溶液乙酸鈉溶液酶解酶解淀粉酶淀粉酶定容定容 吸附劑采用的是吸附劑采用的是人造浮石人造浮石。將提取液加入將提取液加入人造浮石交換柱人造浮石交換柱中，中，VB1VB1被吸附上去，吸附上去后，再被吸附上去，吸附上去后，再用用熱水淋洗熱水淋洗，洗去雜質(zhì)，最后用熱，洗去雜質(zhì)，最后用熱的酸性氯化鉀（的酸性氯化鉀（25%KCl-HAC25%KCl-HAC）把）把VB1VB1洗脫下來，這樣就得到純洗脫下來，這樣就得到純VB1VB1。樣品樣品熱水熱水酸性氯化鉀酸性氯化鉀收集酸性氯化鉀定容收集酸性氯化鉀定容 凈化凈化 氧化氧化 靜置靜置 過濾過濾 脫水脫水反應(yīng)瓶

22、編號(hào)反應(yīng)瓶編號(hào)標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)A A瓶瓶標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)B B瓶瓶樣品樣品A A瓶瓶樣品樣品B B瓶瓶加標(biāo)準(zhǔn)液或加標(biāo)準(zhǔn)液或樣品液樣品液標(biāo)準(zhǔn)液標(biāo)準(zhǔn)液5ml5ml 標(biāo)準(zhǔn)液標(biāo)準(zhǔn)液5ml5ml 樣品液樣品液5ml5ml 樣品液樣品液5ml5ml加氫氧化鈉加氫氧化鈉3ml3ml3ml3ml加堿性鐵氰加堿性鐵氰化鉀化鉀3ml3ml3ml3ml加正丁醇加正丁醇10ml10ml10ml10ml10ml10ml10ml10ml 熒光強(qiáng)度測(cè)定熒光強(qiáng)度測(cè)定(通過熒光分光光度計(jì)可以測(cè)得通過熒光分光光度計(jì)可以測(cè)得) 激發(fā)波長激發(fā)波長365nm365nm；發(fā)射波長；發(fā)射波長435nm435nm； 激發(fā)波狹縫激發(fā)波狹縫5nm5nm；發(fā)射波

23、狹縫；發(fā)射波狹縫5nm5nm。（4 4）方法說明）方法說明 本方法適用于各類食物中硫胺素的測(cè)定，但本方法適用于各類食物中硫胺素的測(cè)定，但不適用于不適用于有有吸附吸附硫胺素能力的物質(zhì)和含有影響硫色素?zé)晒馕镔|(zhì)的樣品硫胺素能力的物質(zhì)和含有影響硫色素?zé)晒馕镔|(zhì)的樣品； 酸解、水解的目的：酸解、水解的目的：使結(jié)合型的使結(jié)合型的VBVB1 1成為游離型的成為游離型的； 紫外線會(huì)破壞硫色素，所以硫色素形成后，紫外線會(huì)破壞硫色素，所以硫色素形成后，反應(yīng)瓶反應(yīng)瓶要用要用黑布黑布遮蓋或在暗室中進(jìn)行熒光測(cè)定遮蓋或在暗室中進(jìn)行熒光測(cè)定，并且要，并且要迅速測(cè)定迅速測(cè)定； 維生素維生素B2又稱核黃素又稱核黃素測(cè)定方法主要有

24、：測(cè)定方法主要有： 微生物法、熒光法、微生物法、熒光法、HPLC法法 GB/T 5009.85-2003 熒光法（第一法）熒光法（第一法） 微生物法（第二法）微生物法（第二法）（三）維生素（三）維生素B2的測(cè)定的測(cè)定 熒光法測(cè)維生素?zé)晒夥y(cè)維生素B21.原理原理 核黃素在核黃素在440500nm波長光照射下發(fā)生黃綠色熒光。波長光照射下發(fā)生黃綠色熒光。在稀溶液中其熒光強(qiáng)度與核黃素的濃度成正比。在波長在稀溶液中其熒光強(qiáng)度與核黃素的濃度成正比。在波長525nm下測(cè)定其熒光強(qiáng)度。試液再下測(cè)定其熒光強(qiáng)度。試液再加入低亞硫酸鈉加入低亞硫酸鈉(Na2S2O4)，將，將核黃素還原為無熒光的物質(zhì)核黃素還原為無熒

25、光的物質(zhì)，然后再測(cè)定試，然后再測(cè)定試液中殘余熒光雜質(zhì)的熒光強(qiáng)度，兩者之差即為食品中核黃素液中殘余熒光雜質(zhì)的熒光強(qiáng)度，兩者之差即為食品中核黃素所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度。所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度。 為使為使VB2游離出來，采用需經(jīng)酸解和酶解游離出來，采用需經(jīng)酸解和酶解 為消除干擾，試樣通過氧化處理和柱層析處理。為消除干擾，試樣通過氧化處理和柱層析處理。2.測(cè)定步驟測(cè)定步驟（1）樣品提?。悠诽崛》Q樣三角瓶三角瓶高壓水解高壓水解鹽酸溶液鹽酸溶液調(diào)調(diào)pHpH值值氫氧化鈉溶液氫氧化鈉溶液酶解酶解淀粉酶淀粉酶定容定容蛋白酶蛋白酶（2）氧化去雜）氧化去雜樣品提取液樣品提取液具塞試管具塞試管水水雙氧水雙氧水冰乙酸冰乙酸高錳酸

26、鉀高錳酸鉀氧化去雜氧化去雜褪色褪色標(biāo)準(zhǔn)液按相同方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)液按相同方法進(jìn)行（3）柱層析）柱層析樣品液樣品液水水丙酮丙酮- -乙酸乙酸- -水混合液水混合液水水收集洗脫液收集洗脫液定容定容 * *標(biāo)準(zhǔn)液按相標(biāo)準(zhǔn)液按相同操作進(jìn)行同操作進(jìn)行（4）熒光測(cè)定）熒光測(cè)定激發(fā)光波長激發(fā)光波長440nm，發(fā)射光波長，發(fā)射光波長525nm，測(cè)，測(cè)量樣品管及標(biāo)準(zhǔn)管的量樣品管及標(biāo)準(zhǔn)管的熒光值熒光值。 待樣品及標(biāo)準(zhǔn)的熒光值測(cè)量后，在各管的剩余待樣品及標(biāo)準(zhǔn)的熒光值測(cè)量后，在各管的剩余液中加液中加0.1mL 20%低亞硫酸鈉低亞硫酸鈉溶液，立即混勻，溶液，立即混勻，在在20s內(nèi)內(nèi)測(cè)出各管的熒光值，作為各自的測(cè)出各管的熒光

27、值，作為各自的空白空白值值。3.3.計(jì)算計(jì)算X X：樣品中核黃素含量，：樣品中核黃素含量，mg/100gmg/100gA A：試樣熒光值：試樣熒光值B B：試樣空白熒光值：試樣空白熒光值C C：標(biāo)準(zhǔn)熒光值：標(biāo)準(zhǔn)熒光值D D：標(biāo)準(zhǔn)空白熒光值：標(biāo)準(zhǔn)空白熒光值m m：樣品質(zhì)量，：樣品質(zhì)量，g gm m1 1：標(biāo)準(zhǔn)管中核黃素含量：標(biāo)準(zhǔn)管中核黃素含量ggf f：稀釋倍數(shù)：稀釋倍數(shù)100/1000100/1000：樣品核黃素含量的換算系數(shù)：樣品核黃素含量的換算系數(shù)1000100)()(1fmDCmBAX維生素維生素C C是一種已糖醛基酸，有抗壞血病的作是一種已糖醛基酸，有抗壞血病的作用，所以被人們稱做用，

28、所以被人們稱做抗壞血酸抗壞血酸; ;廣泛存在于廣泛存在于植物組織中植物組織中，新鮮的水果、蔬菜新鮮的水果、蔬菜，特別是，特別是棗、辣椒、苦瓜、柿子葉、獼猴桃、柑橘等食品中含棗、辣椒、苦瓜、柿子葉、獼猴桃、柑橘等食品中含量較多。它是氧化還原酶之一，本身易被氧化，但在量較多。它是氧化還原酶之一，本身易被氧化，但在有些條件下有些條件下又是一種抗氧化劑又是一種抗氧化劑。 （三）維生素（三）維生素C的測(cè)定的測(cè)定維生素維生素C C具有較強(qiáng)的還原性，對(duì)光敏感，具有較強(qiáng)的還原性，對(duì)光敏感，氧化后氧化后的產(chǎn)物的產(chǎn)物稱為稱為脫氫抗壞血酸脫氫抗壞血酸，仍然具有生理活性；進(jìn)一步，仍然具有生理活性；進(jìn)一步水解水解則則生

29、成生成2 2，3 -3 -二酮古樂糖酸二酮古樂糖酸，失去生理作用。，失去生理作用。在食品中維生素在食品中維生素C C就是以就是以還原型、脫氫型和二酮古樂糖還原型、脫氫型和二酮古樂糖酸型酸型這這3 3種形式存在的；食品分析中的所謂種形式存在的；食品分析中的所謂總抗壞血酸總抗壞血酸是指抗壞血酸和脫氫抗壞血酸二者的總量，是指抗壞血酸和脫氫抗壞血酸二者的總量，不包括不包括2 2，3 -3 -二酮古樂糖酸和進(jìn)一步氧化的產(chǎn)物。二酮古樂糖酸和進(jìn)一步氧化的產(chǎn)物。 維生素維生素C C 的測(cè)定方法的測(cè)定方法測(cè)定維生素測(cè)定維生素C C 的方法有：的方法有：熒光法，高效液相色譜法，2，4 二硝基苯肼比色法， 2 2，

30、6 6 二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法，等 GB/T 5009.862003 GB/T 5009.862003 蔬菜、水果及其制品中蔬菜、水果及其制品中總抗壞血酸總抗壞血酸含含量測(cè)定方法量測(cè)定方法 第一法：熒光法第一法：熒光法 第二法第二法：2 2，4 4二硝基苯肼比色法二硝基苯肼比色法原理：原理： 試樣中試樣中還原型抗壞血酸還原型抗壞血酸經(jīng)活性炭氧化為經(jīng)活性炭氧化為脫氫脫氫抗壞血酸抗壞血酸后，與后，與鄰苯二胺鄰苯二胺反應(yīng)生成有熒光的反應(yīng)生成有熒光的喹唔喹唔啉啉，其熒光強(qiáng)度與抗壞血酸的濃度在一定條件下，其熒光強(qiáng)度與抗壞血酸的濃度在一定條件下成正比，以此測(cè)定食品中抗壞血酸和脫氫抗壞血成正比，以此測(cè)

31、定食品中抗壞血酸和脫氫抗壞血酸的總量。酸的總量。 注意：脫氫抗壞血酸可與硼酸結(jié)合生成復(fù)合物，而不與鄰注意：脫氫抗壞血酸可與硼酸結(jié)合生成復(fù)合物，而不與鄰苯二胺苯二胺反應(yīng)生成熒光物質(zhì)，由此可以消除雜質(zhì)的干擾。反應(yīng)生成熒光物質(zhì)，由此可以消除雜質(zhì)的干擾。（空白試驗(yàn)）（空白試驗(yàn)） （第一法）熒光法（測(cè)總抗壞血酸）（第一法）熒光法（測(cè)總抗壞血酸）偏磷酸偏磷酸冰醋酸溶液：稱取冰醋酸溶液：稱取15g偏磷酸，加入偏磷酸，加入40mL冰醋冰醋酸，加水稀釋至酸，加水稀釋至500mL過濾后，貯存于冰箱中；過濾后，貯存于冰箱中；硫酸：硫酸：0.15mol/L偏磷酸偏磷酸乙酸乙酸硫酸溶液：稱取硫酸溶液：稱取15g偏磷酸，

32、加入偏磷酸，加入40mL冰醋酸，用冰醋酸，用0.015molL-1硫酸稀釋至硫酸稀釋至500mL；乙酸鈉溶液：稱取乙酸鈉溶液：稱取500g乙酸鈉溶解并稀釋至乙酸鈉溶解并稀釋至1L；硼酸硼酸乙酸鈉溶液：稱取硼酸乙酸鈉溶液：稱取硼酸9g，加入，加入35mL乙酸鈉溶液，乙酸鈉溶液，用水稀釋至用水稀釋至1000mL；鄰苯二胺溶液：稱取鄰苯二胺溶液：稱取20mg鄰苯二胺鹽酸鹽溶于鄰苯二胺鹽酸鹽溶于100mL水水中；中；抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取0.500g抗壞血酸溶于偏磷酸抗壞血酸溶于偏磷酸冰醋酸溶液中，定容至冰醋酸溶液中，定容至500mL容量瓶中，吸取上述溶液容量瓶中，吸取上

33、述溶液5mL，再用偏磷酸再用偏磷酸冰醋酸溶液定容至冰醋酸溶液定容至50mL；抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)使用溶液：抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)使用溶液：100g/mL百里酚藍(lán)指示劑百里酚藍(lán)指示劑(麝香草酚藍(lán)麝香草酚藍(lán))：變色范圍：變色范圍pH1.2(紅紅)2.8(黃黃)；活性炭：取活性炭：取50g活性炭加入活性炭加入250mL10%鹽酸，加熱至沸，減鹽酸，加熱至沸，減壓過濾，用蒸餾水沖洗活性炭，檢查濾液中無鐵離子為止，于壓過濾，用蒸餾水沖洗活性炭，檢查濾液中無鐵離子為止，于110120烘干。烘干。熒光分光光度計(jì)熒光分光光度計(jì)或具有或具有350nm及及430nm 波長的波長的熒光計(jì)；搗碎機(jī)。熒光計(jì)；搗碎機(jī)。 試樣的制備：試樣的

34、制備：稱取稱取100100克鮮樣克鮮樣, ,加加100mL100mL偏磷酸偏磷酸- -乙酸溶液，乙酸溶液，倒入搗碎機(jī)內(nèi)打成勻漿，先取少量樣品加入倒入搗碎機(jī)內(nèi)打成勻漿，先取少量樣品加入1 1滴百里酚藍(lán)，滴百里酚藍(lán)，若顯紅色若顯紅色(pH=1.2)(pH=1.2)，即用偏磷酸，即用偏磷酸冰醋酸溶液定容至冰醋酸溶液定容至100mL100mL；若顯黃色若顯黃色(pH=2.8)(pH=2.8)，即用偏磷酸，即用偏磷酸冰醋酸冰醋酸硫酸溶液定容硫酸溶液定容至至100mL100mL，定容后過濾備用。，定容后過濾備用。 測(cè)定：測(cè)定： 氧化處理：氧化處理：將上述濾液及抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)使用液各將上述濾液及抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)使

35、用液各100ml轉(zhuǎn)入三轉(zhuǎn)入三角瓶中加入角瓶中加入12g活性炭振搖活性炭振搖12分鐘，過濾。即試樣氧化分鐘，過濾。即試樣氧化液和標(biāo)準(zhǔn)氧化液，待測(cè)定。液和標(biāo)準(zhǔn)氧化液，待測(cè)定。各取各取10mL標(biāo)準(zhǔn)氧化液標(biāo)準(zhǔn)氧化液于于2個(gè)個(gè)100mL容量瓶中，分別標(biāo)明容量瓶中，分別標(biāo)明“標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)”及及“標(biāo)準(zhǔn)空白標(biāo)準(zhǔn)空白”各取各取10mL試樣氧化液試樣氧化液于于2個(gè)個(gè)100mL容量瓶中，分別標(biāo)明容量瓶中，分別標(biāo)明“試試樣樣”及及“試樣空白試樣空白”于于“標(biāo)準(zhǔn)空白標(biāo)準(zhǔn)空白”及及“試樣空白試樣空白”中各加中各加5mL硼酸硼酸-乙酸鈉溶乙酸鈉溶液，液，混合搖動(dòng)混合搖動(dòng)15min，用水稀釋至，用水稀釋至100mL，在，在4冰箱

36、中放冰箱中放置置23小時(shí)，即得小時(shí)，即得“標(biāo)準(zhǔn)空白標(biāo)準(zhǔn)空白”溶液及溶液及“試樣空白試樣空白”溶液，溶液，備用。備用。于于“試樣試樣”及及“標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)”中各加中各加5mL /L乙酸鈉溶液，用水稀乙酸鈉溶液，用水稀釋至釋至100mL,即得即得“試樣試樣”溶液及溶液及“標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)”溶液，備用。溶液，備用。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備： 取上述取上述“標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)”溶液（抗壞血酸含量溶液（抗壞血酸含量10g/mL）0.5、1.0、1.5和和2.0mL標(biāo)準(zhǔn)系列，取雙份分別置于標(biāo)準(zhǔn)系列，取雙份分別置于10mL帶蓋試管中，再帶蓋試管中，再用水補(bǔ)充至用水補(bǔ)充至2.0mL。（平行。（平行2次，做標(biāo)準(zhǔn)曲線）次，做標(biāo)準(zhǔn)曲

37、線） 取中取中“標(biāo)準(zhǔn)空白標(biāo)準(zhǔn)空白”溶液，溶液，“樣品空白樣品空白”溶液及溶液及 “樣品樣品”溶溶液各液各2mL，分別置于，分別置于10mL帶蓋試管中。在暗室中迅速向各試帶蓋試管中。在暗室中迅速向各試管中加入管中加入5mL鄰苯二胺溶液，振搖混合，在室溫下反應(yīng)鄰苯二胺溶液，振搖混合，在室溫下反應(yīng)35min，于激發(fā)光波長于激發(fā)光波長338nm、發(fā)射光波長、發(fā)射光波長420nm處測(cè)定熒光強(qiáng)度。標(biāo)處測(cè)定熒光強(qiáng)度。標(biāo)準(zhǔn)系列熒光強(qiáng)度分別減去標(biāo)準(zhǔn)空白熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)準(zhǔn)系列熒光強(qiáng)度分別減去標(biāo)準(zhǔn)空白熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的抗壞血酸含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或進(jìn)行相關(guān)計(jì)算，的抗壞血酸含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

38、或進(jìn)行相關(guān)計(jì)算，其直線回歸方程供計(jì)算時(shí)使用。其直線回歸方程供計(jì)算時(shí)使用。（5）結(jié)果計(jì)算：）結(jié)果計(jì)算：式中式中 X-試樣中抗壞血酸及脫氫抗壞血酸總含量，試樣中抗壞血酸及脫氫抗壞血酸總含量，mg/100g； c-由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得或由回歸方程算得試樣溶液濃度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得或由回歸方程算得試樣溶液濃度，g/mL m-試樣的質(zhì)量，試樣的質(zhì)量，g； V-熒光反應(yīng)所用試樣體積，熒光反應(yīng)所用試樣體積，mL； F-試樣溶液的稀釋倍數(shù)。試樣溶液的稀釋倍數(shù)。1000100FmcVX（第二法）（第二法）2 2，4 4二硝基苯肼比色法二硝基苯肼比色法1.1.原理原理 先將樣品中的還原型抗壞血酸用活性炭氧化先將樣品中的還

39、原型抗壞血酸用活性炭氧化為脫氫抗壞血酸，加為脫氫抗壞血酸，加2，4二硝基苯肼生成紅色二硝基苯肼生成紅色脎，根據(jù)脎在硫酸溶液中的含量與總抗壞血酸含脎，根據(jù)脎在硫酸溶液中的含量與總抗壞血酸含量成正比進(jìn)行比色測(cè)定。量成正比進(jìn)行比色測(cè)定。2.2.試劑試劑v 提取提取Vc用：用：20g/L草酸，草酸，10 g/L草酸草酸v 氧化處理用：活性炭（經(jīng)氧化處理用：活性炭（經(jīng)HCl處理無鐵離子）處理無鐵離子）v 控制氧化用：控制氧化用：20g/L硫脲、硫脲、10g/L硫脲硫脲v 顯色用：顯色用：20g/L2，4二硝基苯肼溶液，硫酸二硝基苯肼溶液，硫酸v 1mg/mL抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液3.3.主要儀

40、器主要儀器v 恒溫箱或恒溫水浴鍋恒溫箱或恒溫水浴鍋v 紫外可見分光光度計(jì)紫外可見分光光度計(jì)v 組織搗碎機(jī)組織搗碎機(jī)4.4.操作步驟操作步驟樣品中樣品中Vc的提取和處理的提取和處理提?。悠分苽洌┨崛。悠分苽洌﹙ 干樣：干樣：樣品（樣品（1-4g）+適量適量10 g/L草酸，磨成勻漿，用草酸，磨成勻漿，用10 g/L草酸定容至草酸定容至100mL容量瓶。過濾，得提取液。容量瓶。過濾，得提取液。v 鮮樣：鮮樣：樣品樣品+等量的等量的20 g/L草酸，搗碎成勻漿，取草酸，搗碎成勻漿，取1040g勻漿，用勻漿，用10 g/L草酸定容至草酸定容至100mL容量瓶。過濾，得容量瓶。過濾，得提取液。提取液。注意：不易過濾的樣品，可離心沉淀后取上清液再過濾。注意：不易過濾的樣品，可離心沉淀后取上清液再過濾。氧化處理氧化處理取取25mL提取液提取液+2g活性炭，振搖活性炭，振搖1min，過濾。，過濾。要棄去初濾液；要棄去初濾液；取取10mL氧化提取液氧化提取液+10mL20g/L硫脲；硫脲；此