分析化學(xué)高效液相色譜法

1、高效液譜法High Performance Liquid Chromatography分析化學(xué)教研室高效液譜法概述1基本原理2各類高效液譜法3固定相4相5高效液譜儀6小結(jié)習(xí)題及解答v 高效液譜法：以經(jīng)典液譜為基礎(chǔ)，在氣譜的理論和實驗方法基礎(chǔ)上建立的一種分離分析方法。v 簡稱：HPLC；HRLC；SPLC； UPLC超高效液Chromatography）譜（Ultra Performance Liquidv 與經(jīng)典LC相比高效 高效填料：35m 高壓泵輸液 高靈敏度的檢測器:檢測一、概 述 HPLC與GC區(qū)別GCHPLC 能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點較低的樣品，占有機物的20% 不受樣品揮發(fā)性和熱

2、穩(wěn)定性的限制，占有機物的80%分析對象 液體，種類較多，選擇余地廣相差別 惰性氣體一、概 述HPLC儀器示意圖一、概 述Agilent 1100一、概 述HPLC儀器圖SHIMAZUWATERSAGILENT一、概 述application一、概 述高效液譜法概述1基本原理2各類高效液譜法3固定相4相5高效液譜儀6v 范氏方程（van Deemter equation)：GC：H = A + B/u + CuH = B/u + Cu填充柱開口毛細管柱HPLC：H = A + Cu B = 2g × Dm：T（一般2530度）；(液體作比GC的小1055；u（3-5倍uoopptt 忽

3、略B/u相），D二、基本原理Dµ TmhmGC和HPLC的H-u圖1 B/u2 Cu3 A4 HPLC的uopt5 GC的uopt二、基本原理范氏方程（van Deemter equation)H = A + CuA=2d C=Cm+Csmv HPLC：µ Tdp 2dp 2D= Csm=C µCmmhDmDm影響因素： 選球形固定相，高壓、勻漿法 d C選粒徑小的化學(xué)鍵合相（35um)相 （1ml/min)選粘度小、低流速的 T低柱溫（2530 度為宜）二、基本原理高效液譜法概述1基本原理2各類高效液固定相譜法34相5高效液譜儀6三、各類高效液譜法液固吸附色譜S

4、C）1液液分配色譜LC）2化學(xué)鍵合譜法（BPC）3三、各類高效液譜法v 液固吸附色譜法分離機理:組分性中心與相競爭吸附劑表面活固定相:硅膠相:底劑（烷烴）+極性調(diào)節(jié)劑出柱順序：強極性組分后出柱，弱極性組分先出柱例如：TLC三、各類高效液譜法v 液液分配色譜法分離機制：利用組分在兩相中分配系數(shù)的差異分類: 固定液極性 >相極性 極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱 適用對象：極性大組分正譜NPLC 固定液極性 <相極性 極性大的組分先出柱，極性小的組分后出柱 適用對象：極性小組分反譜RPLC三、各類高效液譜法化學(xué)鍵合譜法(bonded phase chromatography,BP

5、C)固定液的官能團通過化學(xué)反應(yīng)鍵合在載體表面離子抑制離子對正合相反合相三、各類高效液譜法1.反合譜法(RBPC)分離機制：疏溶劑理論等固定相：非極性的鍵合相如:十八烷基硅烷鍵合相（ODS；C18柱)相：極性大的如:甲醇-相乙腈-水相極性與k的關(guān)系:極性，洗脫能力，k，組分tR極性大的組分先出柱應(yīng)用：非極性-中等極性組分(80%)三、各類高效液譜法2.正合譜法(NBPC)分離機制：定向作用力、誘導(dǎo)作用力、或氫鍵作用力的差別固定相：極性大的基或氨基鍵合相相：極性小的底劑（烷烴）+ 極性調(diào)節(jié)劑相極性與k的關(guān)系：相極性，洗脫能力，組分tR，k結(jié)構(gòu)相近組分，極性大的組分后出柱三、各類高效液譜法3.離子對

6、色譜法(IPC,PIC)正相與反相，正相應(yīng)用較少反相分離機制：在相中加入離子對試劑，使形成不帶電的中性離子對，從而增加了樣品離子在非極性固定相中的溶解度，K增加，分離機理：相固定相B+H+BH+RSO- +Na+3RSO3NaBH+.RSO-3中性離子對BH+.RSO- 3增加了在非極性固定相中溶解度。 三、各類高效液譜法常用離子對試劑：分析對象離子對試劑例如堿烷基磺酸鈉C5、C6、C7、C8磺酸鈉,SDS酸胺鹽胺磷酸鹽（TBA）三、各類高效液譜法4.離子抑制色譜法(ISC)分離機制：通過調(diào)節(jié)相的pH，抑制組分離解，增加它在固定相中的溶解度，以達到分離有機弱酸，弱堿的目的適用范圍：3.0pKa

7、7.0的弱酸7.0pKa8.0的弱堿抑制劑:弱酸（HAc）、弱堿（NH3·H2O）或緩沖液（磷酸鹽和乙酸鹽）概述1基本原理2各類高效液譜法3固定相4相5高效液譜儀6HPLCv 液-固色譜固定相§ 硅膠無定形全多孔硅膠球形全多孔硅膠YWGYQG§ 高多孔微球YSG特點：柱選擇性好，峰形好，柱效低四、固定相v 化學(xué)鍵合相（化學(xué)反應(yīng)的方法將固定液結(jié)合在載體上， 具有吸附、分配雙重作用）特點：§ 不易流失;熱穩(wěn)定性好;化學(xué)性能穩(wěn)定pH2-8不變質(zhì)；§ 載樣量大;適于梯度洗脫分類:非極性鍵合相：ODS中等極性鍵合相：醚基鍵合相可作正相、反譜，視相極性而定

8、極性鍵合相：氨基（強極性）、基（中等極性）四、固定相v 非極性鍵合相：ODS，十八烷基硅烷鍵合相，表面為非極性基團。另一種C8.載體：全多孔YWG，YQG、堆積硅球表面覆蓋度：參加反應(yīng)的硅醇基數(shù)目占硅膠表面硅醇基總數(shù)的比例。其大小，決定鍵合分配還是吸附占主導(dǎo)作用。鍵合基團鍵長：鍵長，載樣量，k使用注意事項：pH 2-8.四、固定相概述1基本原理2各類高效液譜法3固定相4相高效液5譜儀6HPLC五、相v 要求：與固定液不反應(yīng);對樣品有良好溶解度(k2-5);粘度小(用甲醇，不用乙醇）;與檢測器匹配。n × a - 1 ×k2R =a1 + k24分配系數(shù)比容量因子k與固定相性

9、質(zhì)和相種類有關(guān)與相配比有關(guān)溶劑的強度和選擇：溶劑強度，洗脫能力，k.反P534 表205.合相通常溶劑的強度因子見五、相v 正相洗脫v 反相洗脫相的極性小于固定相的洗脫相的極性大于固定相的洗脫v 洗脫方式:等度洗脫(isocratic elution)恒定配比的溶劑系統(tǒng)洗脫梯度洗脫(gradient elution)在一個分析周期內(nèi)不斷改變相的比例 五、相概述1基本原理2各類高效液譜法3固定相4相5高效液譜儀6HPLC六、高效液譜儀HPLC進樣器色譜柱高效液譜儀輸液泵檢測器工作站六、高效液譜儀v 輸液泵進樣器色譜柱檢測器工作站§ 泵：恒壓泵恒流泵:柱塞往復(fù)泵(動畫SWF）六、高效液譜

10、儀Agilent二元泵示意圖六、高效液譜儀v 輸液泵進樣器色譜柱檢測器工作站動畫SWF六、高效液譜儀v 輸液泵進樣器色譜柱檢測器工作站色譜柱：由柱管(不銹)和固定相組成2-4.6mm1-1.5mm 20-50mmL10-25cmL10-20cm L3-25cm分析柱常量柱常微量柱柱色譜柱柱效的評價。第一輪C實驗。六、高效液譜儀輸液泵進樣器色譜柱檢測器工作站1.2.3.4.檢測器:紫外檢測器熒光檢測器蒸發(fā)光散射檢測器其它檢測器（電化學(xué)，化學(xué)發(fā)光，示差折光等）原理：lambert-Beer law（見動畫，SWF）由光源、流通池（一般8ul）、檢測元件等特點：靈敏度高1071012；不破壞樣品；弱

11、點：樣品有紫外吸收，檢測波長須大于截止波長。相（截止波長nm：水190，乙腈210，甲醇210，正已烷210，乙醚220，四氫呋喃220）分類：固定波長，可變波長，DAD紫外檢測器最為常用熒光檢測器適用于能產(chǎn)生熒光或其衍生物能發(fā)熒光物質(zhì)檢測限1010 g/ml,體內(nèi)藥分常用蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD)通用型用于揮發(fā)性低于相的任何樣品組分熒光檢測器及蒸發(fā)光散射檢測器六、高效液譜儀v 輸液泵進樣器色譜柱檢測器工作站六、高效液譜儀色譜光譜圖波長(nm)T/min六、高效液譜儀v 輸液泵進樣器色譜柱檢測器工作站W(wǎng)ATERSWATERS2414RID2465ECD2424ELSD2489UVD六、高效液譜儀超高效液譜儀()掌握熟悉 HPLC中色譜條件的選擇. 化學(xué)鍵合譜法.了解 HPLC的特點. HPLC的儀器結(jié)構(gòu)及各部件.小結(jié) 范氏方程在HPLC的表達形式. 分離度影響因素 正譜和反譜.譜中固定相的極性 小于 反相1的極性.HPLC中范