質(zhì)立DNA的酶切鑒定及瓊脂糖凝膠電泳ppt課件

1、實(shí)驗(yàn)三實(shí)驗(yàn)三 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的酶切鑒定的酶切鑒定及瓊脂糖凝膠電泳及瓊脂糖凝膠電泳1. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵髮?shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?學(xué)習(xí)和掌握限制性內(nèi)切酶的特性、酶學(xué)習(xí)和掌握限制性內(nèi)切酶的特性、酶解和瓊脂糖凝膠電泳的操作方法，并解和瓊脂糖凝膠電泳的操作方法，并了解限制性內(nèi)切酶是了解限制性內(nèi)切酶是DNA重組技術(shù)的重組技術(shù)的關(guān)鍵工具，瓊脂糖凝膠電泳是分別鑒關(guān)鍵工具，瓊脂糖凝膠電泳是分別鑒定定DNA片段的有效方法。片段的有效方法。 2. 相關(guān)根底知識(shí)相關(guān)根底知識(shí) 限制性核酸內(nèi)切酶：是一類能識(shí)別雙限制性核酸內(nèi)切酶：是一類能識(shí)別雙鏈鏈DNA分子特異性核酸序列的分子特異性核酸序列的DNA水水解酶。是體外剪切基因片段的重要

2、工解酶。是體外剪切基因片段的重要工具，所以經(jīng)常與核酸聚合酶、銜接酶具，所以經(jīng)常與核酸聚合酶、銜接酶以及末端修飾酶等一同稱為工具酶。以及末端修飾酶等一同稱為工具酶。限制性核酸內(nèi)切酶不僅是限制性核酸內(nèi)切酶不僅是DNA重組中重組中重要的工具，而且還可以用于基因組重要的工具，而且還可以用于基因組酶切圖譜的鑒定。酶切圖譜的鑒定。1) 寄主控制的限制與修飾景象寄主控制的限制與修飾景象2) 核酸限制性內(nèi)切酶的類型核酸限制性內(nèi)切酶的類型3) 核酸限制性內(nèi)切酶的根本特性核酸限制性內(nèi)切酶的根本特性4) 同裂酶和同尾酶同裂酶和同尾酶5) 核酸限制性內(nèi)切酶的命名法核酸限制性內(nèi)切酶的命名法6) 影響核酸限制性內(nèi)切酶活性

3、的要素影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的要素1) 寄主控制的限制與修飾景象寄主控制的限制與修飾景象限制與修飾系統(tǒng)是細(xì)胞的一種防衛(wèi)手段。限制與修飾系統(tǒng)是細(xì)胞的一種防衛(wèi)手段。 各各種細(xì)菌都能合成一種或幾種可以切割種細(xì)菌都能合成一種或幾種可以切割DNA雙雙鏈的核酸內(nèi)切酶，它們以此來(lái)限制外源鏈的核酸內(nèi)切酶，它們以此來(lái)限制外源DNA存在于本身細(xì)胞內(nèi)，但合成這種酶的細(xì)胞本存在于本身細(xì)胞內(nèi)，但合成這種酶的細(xì)胞本身的身的DNA不受影響，由于這種細(xì)胞還合成了不受影響，由于這種細(xì)胞還合成了一種修飾酶，對(duì)本身的一種修飾酶，對(duì)本身的DNA進(jìn)展了修飾，限進(jìn)展了修飾，限制性酶對(duì)修飾過(guò)的制性酶對(duì)修飾過(guò)的DNA不能起作用。這種景不能

4、起作用。這種景象被稱為寄主控制的限制與修飾景象。象被稱為寄主控制的限制與修飾景象。2)限制性核酸內(nèi)切酶的類型及特性限制性核酸內(nèi)切酶的類型及特性按限制酶的組成、與修飾酶活性關(guān)按限制酶的組成、與修飾酶活性關(guān)系以及切斷核酸的情況不同，分為系以及切斷核酸的情況不同，分為三類：三類： 型型 型型* 型型第一類第一類I I型限制性內(nèi)切酶能識(shí)別專注型限制性內(nèi)切酶能識(shí)別專注的核苷酸順序，并在識(shí)別點(diǎn)附近的一些的核苷酸順序，并在識(shí)別點(diǎn)附近的一些核苷酸上切割核苷酸上切割DNADNA分子中的雙鏈，但是切分子中的雙鏈，但是切割的核苷酸順序沒(méi)有專注性，是隨機(jī)的。割的核苷酸順序沒(méi)有專注性，是隨機(jī)的。這類限制性內(nèi)切酶在這類限

5、制性內(nèi)切酶在DNADNA重組技術(shù)或基因重組技術(shù)或基因工程中用途不大，無(wú)法用于分析工程中用途不大，無(wú)法用于分析DNADNA構(gòu)造構(gòu)造或克隆基因。這類酶如或克隆基因。這類酶如EcoBEcoB、EcoKEcoK等。等。 第二類第二類(II(II型型) )限制性內(nèi)切酶能識(shí)別專注的核限制性內(nèi)切酶能識(shí)別專注的核苷酸順序，并在該順序內(nèi)的固定位置上切割苷酸順序，并在該順序內(nèi)的固定位置上切割雙鏈。由于這類限制性內(nèi)切酶的識(shí)別和切割雙鏈。由于這類限制性內(nèi)切酶的識(shí)別和切割的核苷酸都是專注的。因此，這種限制性內(nèi)的核苷酸都是專注的。因此，這種限制性內(nèi)切酶是切酶是DNADNA重組技術(shù)中最常用的工具酶之一。重組技術(shù)中最常用的工

6、具酶之一。這種酶識(shí)別的專注核苷酸順序最常見(jiàn)的是這種酶識(shí)別的專注核苷酸順序最常見(jiàn)的是4 4個(gè)或個(gè)或6 6個(gè)核苷酸，少數(shù)也有識(shí)別個(gè)核苷酸，少數(shù)也有識(shí)別5 5個(gè)核苷酸以個(gè)核苷酸以及及7 7個(gè)、個(gè)、8 8個(gè)、個(gè)、9 9個(gè)、個(gè)、1010個(gè)和個(gè)和1111個(gè)核苷酸的。個(gè)核苷酸的。 II II 型限制性內(nèi)切酶的識(shí)別順序是一個(gè)回文型限制性內(nèi)切酶的識(shí)別順序是一個(gè)回文對(duì)稱順序，即有一個(gè)中心對(duì)稱軸，從這個(gè)軸對(duì)稱順序，即有一個(gè)中心對(duì)稱軸，從這個(gè)軸朝二個(gè)方向朝二個(gè)方向“讀都完全一樣。這種酶的切讀都完全一樣。這種酶的切割可以有兩種方式：割可以有兩種方式：粘性末端；是交錯(cuò)切割，結(jié)果構(gòu)成兩條單鏈末端，粘性末端；是交錯(cuò)切割，結(jié)果

7、構(gòu)成兩條單鏈末端，這種末端的核苷酸順序是互補(bǔ)的，可構(gòu)成氫鍵，這種末端的核苷酸順序是互補(bǔ)的，可構(gòu)成氫鍵，所以稱為粘性末端。所以稱為粘性末端。如如EcoRIEcoRI的識(shí)別順序?yàn)椋旱淖R(shí)別順序?yàn)椋?5 5 G GAA|TT_C 3AA|TT_C 3 3 3 C_TT|AA C_TT|AAG 5G 5垂直線表示中心對(duì)稱軸，從兩側(cè)垂直線表示中心對(duì)稱軸，從兩側(cè)“讀核苷酸順序讀核苷酸順序都是都是GAATTCGAATTC或或CTTAAGCTTAAG，這就是回文順序，這就是回文順序palindromepalindrome。_ _和和表示在雙鏈上交錯(cuò)切割的位表示在雙鏈上交錯(cuò)切割的位置，切割后生成置，切割后生成5

8、5GG和和AATTC3AATTC3、3 3CTTAACTTAA和和G5G5二個(gè)二個(gè)DNADNA片段，各有一個(gè)單片段，各有一個(gè)單鏈末端，二條單鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的，其斷裂的磷酸二酯鏈末端，二條單鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的，其斷裂的磷酸二酯鍵以及氫鍵可經(jīng)過(guò)鍵以及氫鍵可經(jīng)過(guò)DNADNA銜接酶的作用而銜接酶的作用而“粘合。粘合。IIII型酶切割方式的另一種是在同一位置型酶切割方式的另一種是在同一位置上切割雙鏈，產(chǎn)生平頭末端。例如上切割雙鏈，產(chǎn)生平頭末端。例如EcoRV EcoRV 的識(shí)別位置是：的識(shí)別位置是： 5 5 GAT GAT|ATC 3|ATC 33 3 CTA CTA|TAG 5|TAG 5 切割后構(gòu)成切割后構(gòu)成5

9、5 GAT GAT和和ATC 3ATC 3、 3 3 CTA CTA和和TAG 5TAG 5。這種末端同。這種末端同樣可以經(jīng)過(guò)樣可以經(jīng)過(guò)DNADNA銜接酶銜接起來(lái)。銜接酶銜接起來(lái)。平頭末端：平頭末端：第三類第三類 IIIIII型限制性內(nèi)切酶也有專注型限制性內(nèi)切酶也有專注的識(shí)別順序，但不是對(duì)稱的回文順序的識(shí)別順序，但不是對(duì)稱的回文順序, ,在識(shí)在識(shí)別順序旁邊幾個(gè)核苷酸對(duì)的固定位置上切別順序旁邊幾個(gè)核苷酸對(duì)的固定位置上切割雙鏈。但這幾個(gè)核苷酸對(duì)不是特異性的。割雙鏈。但這幾個(gè)核苷酸對(duì)不是特異性的。因此，這種限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的一因此，這種限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的一定長(zhǎng)度定長(zhǎng)度DNADNA片段，具

10、有各種單鏈末端。因此片段，具有各種單鏈末端。因此不能運(yùn)用于基因克隆。不能運(yùn)用于基因克隆。同裂酶：同裂酶：有時(shí)兩種限制性內(nèi)切酶的識(shí)別核苷有時(shí)兩種限制性內(nèi)切酶的識(shí)別核苷酸順序和切割位置都一樣，其差別酸順序和切割位置都一樣，其差別只在于當(dāng)識(shí)別順序中有甲基化的核只在于當(dāng)識(shí)別順序中有甲基化的核苷酸時(shí)，一種限制性內(nèi)切酶可以切苷酸時(shí)，一種限制性內(nèi)切酶可以切割，另一種那么不能。例如割，另一種那么不能。例如Hpa和和Msp的識(shí)別順序都是的識(shí)別順序都是5GCG_G3，假設(shè)其中，假設(shè)其中有有5-甲基胞嘧啶，那么只需甲基胞嘧啶，那么只需Hpa可以切割。這些有一樣切點(diǎn)的酶稱可以切割。這些有一樣切點(diǎn)的酶稱為同裂酶同切酶或

11、異源同工酶。為同裂酶同切酶或異源同工酶。 3 同裂酶和同尾酶：同裂酶和同尾酶：有時(shí)兩種酶切割序列不完全一樣，但卻能有時(shí)兩種酶切割序列不完全一樣，但卻能產(chǎn)生一樣的粘性末端，這類酶被稱為同尾產(chǎn)生一樣的粘性末端，這類酶被稱為同尾酶，可以經(jīng)過(guò)酶，可以經(jīng)過(guò)DNADNA銜接酶將這類末端銜接銜接酶將這類末端銜接起來(lái)，但原來(lái)的酶切位點(diǎn)將被破壞，有時(shí)起來(lái)，但原來(lái)的酶切位點(diǎn)將被破壞，有時(shí)能夠會(huì)產(chǎn)生一個(gè)新的酶切位點(diǎn)。如能夠會(huì)產(chǎn)生一個(gè)新的酶切位點(diǎn)。如Xba1Xba1、Nhe1Nhe1、Spe1Spe1以及以及StylStyl切割的切割的DNADNA序列不同，序列不同，但均給出一樣的但均給出一樣的“CTAGCTAG粘性

12、末端。這些粘性末端。這些粘性末端銜接后，以上的酶將不能再切割，粘性末端銜接后，以上的酶將不能再切割，但卻產(chǎn)生了一個(gè)新的但卻產(chǎn)生了一個(gè)新的4 4核苷酸的酶切位點(diǎn)，核苷酸的酶切位點(diǎn)，即即 Bfa1 Bfa1的酶切位點(diǎn)。的酶切位點(diǎn)。同尾酶：同尾酶：4) 限制性核酸內(nèi)切酶的命名法限制性核酸內(nèi)切酶的命名法用屬名的頭一個(gè)字母和種名的頭兩個(gè)字用屬名的頭一個(gè)字母和種名的頭兩個(gè)字母表示寄主菌的物種稱號(hào)，如母表示寄主菌的物種稱號(hào)，如E. coli 用用Eco表示，所以用斜體字。表示，所以用斜體字。用一個(gè)字母代表菌株或型，如流感嗜血用一個(gè)字母代表菌株或型，如流感嗜血菌菌Rd菌株用菌株用d，即，即Hind。假設(shè)一種特

13、殊的寄主菌株，具有幾個(gè)不假設(shè)一種特殊的寄主菌株，具有幾個(gè)不同的限制與修飾體，那么以羅馬數(shù)字同的限制與修飾體，那么以羅馬數(shù)字表示，如表示，如Hind, Hind，Hind等。等。5) 影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的要素影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的要素(1) DNA的純度；的純度；(2) DNA的甲基化程度；的甲基化程度；(3) 酶切消化反響的溫度；酶切消化反響的溫度；(4) DNA的分子構(gòu)造；的分子構(gòu)造；(5) 溶液中離子濃度及種類；溶液中離子濃度及種類；(6) 緩沖液的緩沖液的 pH值。值。瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳是利用瓊脂糖溶化再凝固后瓊脂糖凝膠電泳是利用瓊脂糖溶化再凝固后能構(gòu)成

14、帶有一定孔隙的固體基質(zhì)的特性，其能構(gòu)成帶有一定孔隙的固體基質(zhì)的特性，其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場(chǎng)的作用下密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場(chǎng)的作用下及中性及中性pH的緩沖條件下帶負(fù)電的核酸分子就的緩沖條件下帶負(fù)電的核酸分子就可以向陽(yáng)極遷移?？梢韵蜿?yáng)極遷移。影響影響DNA在瓊脂糖中遷移率的要素：在瓊脂糖中遷移率的要素：DNA分分子的大小、子的大小、DNA的構(gòu)象、電壓、電場(chǎng)方向、的構(gòu)象、電壓、電場(chǎng)方向、堿基組成、嵌入的燃料以及電泳緩沖液的組堿基組成、嵌入的燃料以及電泳緩沖液的組成。成。瓊脂糖凝的濃度影響給定大小的線狀瓊脂糖凝的濃度影響給定大小的線狀DNA的遷移率，因此采用不同濃度的的遷移率，因此采用

15、不同濃度的凝膠可以分別不同大小范圍的凝膠可以分別不同大小范圍的DNA片片段。段。0.8%的瓊脂糖凝膠能很好地分辨的瓊脂糖凝膠能很好地分辨1-25kb的片段；的片段；0.5% 的瓊脂糖凝膠用的瓊脂糖凝膠用于分辨較大片段的于分辨較大片段的DNA (20-100kb；對(duì)于小片段的對(duì)于小片段的DNA(0.2-2kb) 可用可用1.5%或更高濃度的凝膠進(jìn)展分別。不或更高濃度的凝膠進(jìn)展分別。不過(guò)，以上這些并不是絕對(duì)的，由于有過(guò)，以上這些并不是絕對(duì)的，由于有時(shí)我們需求同時(shí)分別多種分子量相差時(shí)我們需求同時(shí)分別多種分子量相差較大的片段，因此所用瓊脂糖凝膠的較大的片段，因此所用瓊脂糖凝膠的濃度要視情況而定。濃度要

16、視情況而定。EBEB：即：即3,8-3,8-二氨基二氨基-5-5-乙基乙基-6-6-苯基菲錠苯基菲錠溴鹽溴鹽, (Ethidium Bromide), (Ethidium Bromide)。它可以插。它可以插入入DNADNA分子中的堿基對(duì)之間而與分子中的堿基對(duì)之間而與DNADNA結(jié)合。結(jié)合。由于由于EBEB分子的插入，在紫外光的照射下，分子的插入，在紫外光的照射下，凝膠電泳中的凝膠電泳中的DNADNA條帶呈現(xiàn)出紅色熒光，條帶呈現(xiàn)出紅色熒光，易于檢測(cè)?？梢詸z測(cè)易于檢測(cè)?？梢詸z測(cè)10ng 10ng 的的DNADNA。留意：留意：EBEB是一種誘變劑，操作時(shí)一定要是一種誘變劑，操作時(shí)一定要留意平安操

17、作，必需戴塑料或乳膠手套。留意平安操作，必需戴塑料或乳膠手套。3. 3. 實(shí)驗(yàn)資料與儀器實(shí)驗(yàn)資料與儀器質(zhì)粒質(zhì)粒 pCMV-Myc-T10 pCMV-Myc-T10NEB NEB 規(guī)范分子量片段規(guī)范分子量片段(1kb DNA Ladder)(1kb DNA Ladder)EcoR1 EcoR1 和和 Xho1 Xho1 核酸內(nèi)切酶核酸內(nèi)切酶TakaraTakaraEcoR 1EcoR 1和和 Xho 1 Xho 1酶解緩沖液酶解緩沖液(10(10H buffer)H buffer)瓊脂糖瓊脂糖 TBETBE或或TAETAE緩沖液緩沖液(10(10) ) 溴化乙啶染色液溴化乙啶染色液(10mg/m

18、l)(10mg/ml) 上樣液上樣液(6(6) )：0.25% 0.25% 溴酚蘭，溴酚蘭，4040(W/V)(W/V)蔗蔗糖糖 水溶液或水溶液或3030的甘油。的甘油。InsertEcoR1Xho11.9kb質(zhì)粒質(zhì)粒0.5 g的的1kb DNA Ladder 0.8%TAE瓊脂糖凝膠，瓊脂糖凝膠，EB染色染色 1 kb DNA Ladder1 kb DNA Ladder不能對(duì)不能對(duì)DNADNA質(zhì)量進(jìn)展準(zhǔn)確定量分析，質(zhì)量進(jìn)展準(zhǔn)確定量分析，但可以經(jīng)過(guò)與相近的條帶但可以經(jīng)過(guò)與相近的條帶進(jìn)展比較估算出大約的數(shù)進(jìn)展比較估算出大約的數(shù)據(jù)。每條帶大約的量如下?lián)Ｃ織l帶大約的量如下按按0.5g0.5g上樣量

19、計(jì)。應(yīng)上樣量計(jì)。應(yīng)按按1212條帶計(jì)算，由于條帶計(jì)算，由于3kb3kb的的量是其它片段量的近三量是其它片段量的近三倍：倍： 片段堿基對(duì)質(zhì)量110,00242 ng28,00142 ng36,00150 ng45,00142 ng54,00133 ng63,001125 ng72,00048 ng81,50036 ng91,00042 ng10a51742 ng*10b50042 ng*EcoR I 酶切位點(diǎn)：酶切位點(diǎn)：GAATT_CXho I 酶切位點(diǎn)：酶切位點(diǎn)：CTCGA_G10H buffer: 500mM Tris-HCl(pH7.5) 100mM MgCl2 10mM Dithioth

20、reitol 1000mM NaCl酶活性的定義：酶活性的定義：一個(gè)活性單位一個(gè)活性單位U)U)，是指在，是指在5050l l反響體系反響體系中，中，37oC37oC的條件下，經(jīng)過(guò)的條件下，經(jīng)過(guò)1 1小時(shí)的反響時(shí)間，小時(shí)的反響時(shí)間，將將1 1g DNA g DNA 完全酶解所需求的酶量。完全酶解所需求的酶量。由于不同的酶所要求的最適反響條件不同，由于不同的酶所要求的最適反響條件不同，所以一定要運(yùn)用與酶相匹配的緩沖系統(tǒng)。所以一定要運(yùn)用與酶相匹配的緩沖系統(tǒng)。普通按照銷售酶的公司所提供的相應(yīng)緩沖普通按照銷售酶的公司所提供的相應(yīng)緩沖液。雙酶切或多酶切時(shí)要思索相容性緩沖液。雙酶切或多酶切時(shí)要思索相容性緩

21、沖液?jiǎn)栴}，普通公司會(huì)給用戶提供這方面的液?jiǎn)栴}，普通公司會(huì)給用戶提供這方面的信息。信息。電泳儀，電泳槽，紫外透射儀，電泳儀，電泳槽，紫外透射儀，凝膠成像儀，一次性塑料手套等凝膠成像儀，一次性塑料手套等4. 實(shí)驗(yàn)方法和步驟實(shí)驗(yàn)方法和步驟 * * 緩沖液隨不同的酶而不同緩沖液隨不同的酶而不同, ,本實(shí)驗(yàn)用本實(shí)驗(yàn)用 H bufferH buffer。置于置于3737水浴酶解水浴酶解0.5-10.5-1小時(shí)。酶解完成后，分小時(shí)。酶解完成后，分別參與別參與1010l 3l 3倍的上樣緩沖液倍的上樣緩沖液, , 然后各取然后各取1515l l進(jìn)展電泳分析。進(jìn)展電泳分析。1) 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的酶解自提質(zhì)粒的酶

22、解自提質(zhì)粒pCMV-Myc-T102) 瓊脂糖凝膠的制備瓊脂糖凝膠的制備瓊脂糖凝膠液的制備：稱取瓊脂糖凝膠液的制備：稱取0.8g瓊脂糖，瓊脂糖，置于三角瓶中，參與置于三角瓶中，參與100ml TBE或或TAE任務(wù)液，瓶口倒扣一個(gè)小燒杯等，將該任務(wù)液，瓶口倒扣一個(gè)小燒杯等，將該三角瓶置于微波爐加直至瓊脂溶解。三角瓶置于微波爐加直至瓊脂溶解。3膠板的制備膠板的制備取有機(jī)玻璃內(nèi)槽，洗凈、晾干；取紙膠取有機(jī)玻璃內(nèi)槽，洗凈、晾干；取紙膠條條(寬約寬約1cm)，將有機(jī)玻璃內(nèi)槽置于一，將有機(jī)玻璃內(nèi)槽置于一程度位置模具上，放好梳子。程度位置模具上，放好梳子。 將冷卻至將冷卻至65左右的瓊脂糖凝膠液，小左右的瓊

23、脂糖凝膠液，小心地倒在有機(jī)玻璃內(nèi)槽上，控制灌膠速心地倒在有機(jī)玻璃內(nèi)槽上，控制灌膠速度和量，使膠液緩慢地展開(kāi)，直到在整度和量，使膠液緩慢地展開(kāi)，直到在整個(gè)有機(jī)玻璃板外表構(gòu)成均勻的膠層。個(gè)有機(jī)玻璃板外表構(gòu)成均勻的膠層。室溫下靜置室溫下靜置30min左右，待凝固完全后，左右，待凝固完全后，悄然拔出梳子，在膠板上即構(gòu)成相互隔悄然拔出梳子，在膠板上即構(gòu)成相互隔開(kāi)的上樣孔。制好膠后將鋪膠的有機(jī)玻開(kāi)的上樣孔。制好膠后將鋪膠的有機(jī)玻璃內(nèi)槽放在含有璃內(nèi)槽放在含有0.5-1TAETris-乙酸乙酸 或或TBETris-硼酸任務(wù)液的電泳槽中硼酸任務(wù)液的電泳槽中運(yùn)用。運(yùn)用。4加樣加樣用微量加樣器將上述樣品分別參與膠板

24、用微量加樣器將上述樣品分別參與膠板的樣品孔內(nèi)。每加完一個(gè)樣品，換一個(gè)的樣品孔內(nèi)。每加完一個(gè)樣品，換一個(gè)加樣頭。加樣時(shí)應(yīng)防止碰壞樣品孔周圍加樣頭。加樣時(shí)應(yīng)防止碰壞樣品孔周圍的凝膠面以及穿透凝膠底部，本實(shí)驗(yàn)樣的凝膠面以及穿透凝膠底部，本實(shí)驗(yàn)樣品孔容量約品孔容量約1520 l。1 kb DNA ladder共共10條帶條帶: 在第一在第一個(gè)上樣孔或最后一個(gè)上樣孔內(nèi)參與個(gè)上樣孔或最后一個(gè)上樣孔內(nèi)參與6l 的的 1 kb DNA ladder50ng/l 。5電泳帶上手套操作電泳帶上手套操作加完樣后的凝膠板即可通電進(jìn)展電泳；加完樣后的凝膠板即可通電進(jìn)展電泳；建議在建議在80100V的電壓下電泳；的電壓下

25、電泳；當(dāng)溴酚蘭挪動(dòng)到間隔膠板下沿約當(dāng)溴酚蘭挪動(dòng)到間隔膠板下沿約1cm處停處停頓電泳；頓電泳；將凝膠放入溴化乙啶將凝膠放入溴化乙啶EB任務(wù)液任務(wù)液0.5g/ml左右中染色約左右中染色約20min。為了獲得電泳分別為了獲得電泳分別DNA片段的最大分辨片段的最大分辨率，電場(chǎng)強(qiáng)度不應(yīng)高于率，電場(chǎng)強(qiáng)度不應(yīng)高于5V/cm兩電極兩電極間的間隔。電泳溫度視需求而定，對(duì)間的間隔。電泳溫度視需求而定，對(duì)大分子的分別，以低溫較好，也可在室大分子的分別，以低溫較好，也可在室溫下進(jìn)展。在瓊脂糖凝膠濃度低于溫下進(jìn)展。在瓊脂糖凝膠濃度低于0.5%時(shí)，由于膠太稀，最好在時(shí)，由于膠太稀，最好在4進(jìn)展進(jìn)展電泳以添加凝膠硬度。電泳以添加凝膠硬度。6察看與拍照察看與拍照在紫外燈在紫外燈(310nm波長(zhǎng)波長(zhǎng))