試從各個(gè)方面對紫外可見分子吸收光度法和分子熒光光度法進(jìn)行全面比較最好舉一應(yīng)用實(shí)例說明

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上 紫外可見分光光度法與分子熒光光度法的全面比較 本文將從定義，產(chǎn)生，儀器結(jié)構(gòu)，常見類型，原理，靈敏度，選擇性，線性范圍，影響因素，誤差來源，注意事項(xiàng)，分析方法，應(yīng)用及應(yīng)用實(shí)例進(jìn)行全面比較！ 1、 定義：紫外可見分光光度法：利用某些物質(zhì)的分子吸收200800納米光譜區(qū)的輻射引起分子中價(jià)電子躍遷，產(chǎn)生分子吸收光譜來進(jìn)行分析的方法。分子熒光光度法：利用物質(zhì)吸收較短波長的光能后發(fā)射較長波長特征光譜的性質(zhì)，對物質(zhì)定性或定量分析的方法?？梢詮陌l(fā)射光譜或激發(fā)光譜進(jìn)行分析。2、 產(chǎn)生：紫外可見分光光度法：由于分子吸收紫外-可見光區(qū)的電磁輻射，分子中價(jià)電子（或外層電子）的能級(jí)躍遷而產(chǎn)生

2、（吸收能量=兩個(gè)躍遷能級(jí)之差）分子熒光光度法：物質(zhì)分子吸收特定波長的光能后，由基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài)。處于激發(fā)態(tài)的物質(zhì)分子是不穩(wěn)定的，可能通過輻射（發(fā)光）或非輻射的形式放出多余的能量，由激發(fā)態(tài)重新回到基態(tài)。3、 儀器結(jié)構(gòu)：紫外可見分光光度法：輻射源。必須具有穩(wěn)定的、有足夠輸出功率的、能提供儀器使用波段的連續(xù)光譜，如鎢燈、鹵鎢燈（波長范圍3502500納米） ，氘燈或氫燈（180460納米），或可調(diào)諧染料激光光源等。單色器。它由入射、出射狹縫、透鏡系統(tǒng)和色散元件（棱鏡或光柵）組成，是用以產(chǎn)生高純度單色光束的裝置，其功能包括將光源產(chǎn)生的復(fù)合光分解為單色光和分出所需的單色光束。試樣容器，又稱吸收池。供盛放

3、試液進(jìn)行吸光度測量之用，分為石英池和玻璃池兩種，前者適用于紫外到可見區(qū)，后者只適用于可見區(qū)。容器的光程一般為 0.510厘米。檢測器，又稱光電轉(zhuǎn)換器。常用的有光電管或光電倍增管。顯示裝置。這部分裝置發(fā)展較快。較高級(jí)的光度計(jì) ，常備有微處理機(jī) 、熒光屏顯示和記錄儀等 ，可將圖譜、數(shù)據(jù)和操作條件都顯示出來。分子熒光光度法：激發(fā)光源、單色器、樣品池、檢測器和記錄顯示部分。1. 光源 能發(fā)射紫外到可見區(qū)波長的光、強(qiáng)度大、穩(wěn)定。常用的有溴鎢燈、高壓汞燈、氙燈。2. 單色器，兩個(gè)單色器。3. 樣品池 通常用石英制成。4. 檢測器：光電倍增管。 4、 常見類型：紫外可見分光光度法：1.單光束。簡單，價(jià)廉，適

4、于在給定波長處測量吸光度或透光度，一般不能作全波段光譜掃描，要求光源和檢測器具有很高的穩(wěn)定性。 2.雙光束 自動(dòng)記錄，快速全波段掃描?？上庠床环€(wěn)定、檢測器靈敏度變化等因素的影響，特別適合于結(jié)構(gòu)分析。儀器復(fù)雜，價(jià)格較高。3.雙波長。將不同波長的兩束單色光(1、2) 快束交替通過同一吸收池而后到達(dá)檢測器。產(chǎn)生交流信號(hào)。無需參比池。l=12nm。兩波長同時(shí)掃描即可獲得導(dǎo)數(shù)光譜。分子熒光光度法：1. 光電熒光計(jì) 用濾光片作單色器（激發(fā)濾光片和熒光光片），溴鎢燈或高壓汞燈作光源，光電管為檢測器。2. 熒光分光光度計(jì) 用氙燈作光源、光柵作單色器，光電倍增管為檢測器?？蛇B續(xù)掃描激發(fā)光譜和熒光光譜。五、原

5、理： 紫外可見分光光度法：紫外 - 可見吸收光譜通常由一個(gè)或幾個(gè)寬吸收譜帶組成。最大吸收波長（max）表示物質(zhì)對輻射的特征吸收或選擇吸收，它與分子中外層電子或價(jià)電子的結(jié)構(gòu)（ 或成鍵、非鍵和反鍵電子 ）有關(guān)。朗伯-比爾定律是分光光度法和比色法的基礎(chǔ)。這個(gè)定律表示：當(dāng)一束具有I0強(qiáng)度的單色輻射照射到吸收層厚度為b，濃度為c的吸光物質(zhì)時(shí)，輻射能的吸收依賴于該物質(zhì)的濃度與吸收層的厚度。其數(shù)學(xué)表達(dá)式為： 式中的A叫做吸光度；I0為入射輻射強(qiáng)度；I為透過吸收層的輻射強(qiáng)度；（II0）稱紫藤為透射率T；是一個(gè)常數(shù)，叫做摩爾吸光系數(shù)，值愈大，分光光度法測定的靈敏度愈高。分子熒光光度法：分子吸收能量后，從基態(tài)最低

6、振動(dòng)能級(jí)躍遷到第一電子激發(fā)態(tài)或更高電子激發(fā)態(tài)的不同振動(dòng)能級(jí)（這一過程速度很快，大約10-15 s），成為激發(fā)單重態(tài)分子。激發(fā)態(tài)分子不穩(wěn)定，可以通過以下幾種途徑釋放能量返回基態(tài)。1. 振動(dòng)馳豫 。這一過程只能發(fā)生在同一電子能級(jí)內(nèi)，即分子通過碰撞以熱的形式損失部分能量，從較高振動(dòng)能級(jí)下降到該電子能級(jí)的最低振動(dòng)能級(jí)上。由于這一部分能量以熱的形式釋放，而不是以光輻射形式發(fā)出，故振動(dòng)馳豫屬于無輻射躍遷。 2. 內(nèi)轉(zhuǎn)換 。即激發(fā)態(tài)分子將多余的能量轉(zhuǎn)變?yōu)闊崮?，從較高電子能級(jí)降至較低的電子能級(jí)。內(nèi)轉(zhuǎn)換也屬于無輻射躍遷。3. 熒光。較高激發(fā)態(tài)分子經(jīng)無輻射躍遷降至第一電子激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)后，仍不穩(wěn)定，停留

7、較短時(shí)間后（約10-8 s，稱作熒光壽命），以光輻射形式放出能量，回到基態(tài)各振動(dòng)能級(jí)，這時(shí)所發(fā)射的光稱為熒光。當(dāng)然也可以無輻射躍遷形式返回基態(tài)。 4. 系間竄躍 有些物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子通過振動(dòng)馳豫和內(nèi)轉(zhuǎn)換下降到第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)后，有可能經(jīng)過另一個(gè)無輻射躍遷轉(zhuǎn)移至激發(fā)三重態(tài)，這一過程伴隨著自旋方向的改變，稱為系間竄躍。對于大多數(shù)物質(zhì)，系間竄躍是禁阻的。如果分子中有重原子（如I、Br等）存在，由于自旋-軌道的強(qiáng)偶合作用，電子自旋方向可以改變，系間竄躍就變得容易了。熒光的檢測： 光源發(fā)出的紫外可見光通過激發(fā)單色器分出不同波長的激發(fā)光，照射到樣品溶液上，激發(fā)樣品產(chǎn)生熒光。樣品發(fā)出的熒光為寬帶

8、光譜，需通過發(fā)射單色器分光后再進(jìn)入檢測器，檢測不同發(fā)射波長下的熒光強(qiáng)度F。由于激發(fā)光不可能完全被吸收，可透過溶液，為了防止透射光對熒光測定的干擾，常在與激發(fā)光垂直的方向檢測熒光（因熒光是向各個(gè)方向發(fā)射的）。 激發(fā)與熒光光譜的形成： 任何熒光物質(zhì)，都具有兩種特征光譜，即激發(fā)光譜(excitation spectrum)和熒光發(fā)射光譜(fluorescence emission spectrum)。 熒光光譜，又稱發(fā)射光譜。保持激發(fā)光波長不變（即固定激發(fā)單色器），依次改變熒光發(fā)射波長，測定樣品在不同波長處發(fā)射的熒光強(qiáng)度F。以發(fā)射波長為橫坐標(biāo)，以熒光強(qiáng)度F為縱坐標(biāo)作圖，得到熒光發(fā)射光譜。熒光發(fā)射光譜

9、上熒光強(qiáng)度最大值所對應(yīng)的波長就是最大發(fā)射波長。六、靈敏度：紫外可見分光光度法：靈敏度很高，達(dá)0.00001-0.mol/L；分子熒光光度法：由于分子熒光是從入射光的直角方向入射，因而靈敏度要比紫外可見高2-4個(gè)數(shù)量級(jí)，它的測定下限在0.1-0.001ug/mL。七、選擇性：紫外可見分光光度法：一個(gè)物質(zhì)若含有生色基團(tuán)，它就會(huì)產(chǎn)生紫外和可見吸收，反過來根據(jù)紫外-可見吸收光譜便可判斷某些官能團(tuán)的存在，即進(jìn)行官能團(tuán)的鑒別，紫外-可見吸收光譜的獲得是建立在測定出物質(zhì)對不同波長光（單色光）吸收的基礎(chǔ)上的。選擇性較高。分子熒光光度法：一個(gè)物質(zhì)只要能產(chǎn)生熒光，則可以根據(jù)熒光光譜判別物質(zhì)的種類（前提是量子產(chǎn)率達(dá)

10、到要求），因而選擇性較高 ，但由于不是所有物質(zhì)都有熒光光譜，應(yīng)用有一定限制。八、線性范圍：紫外可見分光光度法：線性范圍即為符合比爾定律的濃度范圍。分子熒光光度法：線性關(guān)系只有在極稀的溶液中（一般來說，溶液的吸光度不得高于0.05）才成立。9、 特點(diǎn)：紫外可見分光光度法：儀器設(shè)備和操作都比較簡單，費(fèi)用少，分析速度快，靈敏度較高，最低檢出限可達(dá)10-6g/ml，有較好的選擇性，可在多組分共存的條件下對一種物質(zhì)進(jìn)行檢測，精密度和準(zhǔn)確度高，應(yīng)用范圍廣泛。醫(yī)藥、化工、環(huán)境、冶金、地質(zhì)等。分子熒光光度法：靈敏度高；選擇性強(qiáng)；取樣量少，操作簡單；應(yīng)用不夠廣泛。10、 影響因素：紫外可見分光光度法：1.共軛效

11、應(yīng)，共軛效應(yīng)越強(qiáng)，能量差越小，最大吸收波長想長波方向，吸收強(qiáng)度也增大。2.立體化學(xué)校應(yīng)，包括空間位阻和跨環(huán)效應(yīng)，均有影響。3.溶劑的影響，在溶液中物質(zhì)是溶劑化的，影響了溶質(zhì)分子的自由轉(zhuǎn)動(dòng)，引起光譜結(jié)構(gòu)精細(xì)結(jié)構(gòu)的消失。4.體系PH的影響，無論是酸性堿性，體系的PH對紫外可見光譜的影 響是普遍的現(xiàn)象。分子熒光光度法：1.躍遷類型，物質(zhì)必須在紫外可見區(qū)有強(qiáng)吸收和高熒光效率才能產(chǎn)生熒光。具有pp* 躍遷的分子才有強(qiáng)吸收。pp* 躍遷的e大。2. 共軛效應(yīng)：大多數(shù)能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)都含有芳香環(huán)或雜環(huán)，具有共軛的pp* 躍遷。其共軛程度愈大，熒光效率也愈大，且最大激發(fā)和發(fā)射波長都向長波長方向移動(dòng)，如苯、萘、

12、蒽三種物質(zhì)。3.剛性平面結(jié)構(gòu)：當(dāng)熒光分子共軛程度相同時(shí)，分子的剛性和共平面性越大，熒光效率越大。有些物質(zhì)本身不發(fā)熒光或熒光較弱，但和金屬離子形成配合物后，如果剛性和共平面性增加，就可以發(fā)熒光或增強(qiáng)熒光。如8-羥基喹啉是弱熒光物質(zhì)，與Mg2+、Al3+ 等金屬離子形成的配合物的熒光增強(qiáng)，利用這一特點(diǎn)可以間接測定金屬離子。4. 取代基團(tuán) 。熒光分子上的各種取代基對分子的熒光光譜和熒光強(qiáng)度都有很大影響。給電子取代基如NH2、OH、OCH3、CN、NHR、NR2等，能增加分子的電子共軛程度，使熒光效率提高。而-COOH、NO2、C=O、F、Cl等吸電子取代基，可減弱分子電子共軛性，使熒光減弱甚至熄滅。

13、還有一類取代基則對熒光的影響不明顯，如R。5.溫度。溫度對被測溶液的熒光強(qiáng)度有明顯的影響。當(dāng)溫度升高時(shí)，介質(zhì)粘度減小，分子運(yùn)動(dòng)加快，分子間碰撞幾率增加，從而使分子無輻射躍遷增加，熒光效率降低。故降低溫度有利于提高熒光效率及熒光強(qiáng)度。6. 溶劑：同一種熒光物質(zhì)在不同的溶劑中，其熒光光譜的位置和熒光強(qiáng)度可能會(huì)有一定的差別，尤其是那些分子中含有極性取代基的熒光物質(zhì)，它們的熒光光譜易受溶劑的影響。6.溶液的酸度（pH值）對熒光物質(zhì)的影響可以分兩個(gè)方面： 1若熒光物質(zhì)本身是弱酸或弱堿時(shí)，溶液pH值改變，物質(zhì)分子和其離子間的平衡也隨之發(fā)生變化，而不同形體具有其各自特定的熒光光譜和熒光效率。例如苯胺。2.

14、對于金屬離子與有機(jī)試劑生成的熒光配合物，溶液pH值的改變會(huì)影響配合物的組成，從而影響它們的熒光性質(zhì)。例如Ga3+離子與鄰-二羥基偶氮苯，在pH34的溶液中形成1:1配合物，能產(chǎn)生熒光。而在pH67的溶液中，則形成1:2的配合物，不產(chǎn)生熒光。11、 誤差來源：紫外可見分光光度法：偏離比爾定律、儀器本身的測量誤差。偏離比爾定律的原因：1，比爾定律本身的局限，僅在單色光下成立。2，非單色入射光引起的偏離。比爾定律僅在入射光為單色光時(shí)才成立事實(shí)上單色器很難將光源的連續(xù)光色散成其正的單色光，而是具有較窄波長范圍的復(fù)合光，光通量為0.015nm 。還有溶液的化學(xué)偏離。由于被測物質(zhì)在溶液中發(fā)生締合、離解、互

15、變異構(gòu)，生成逐級(jí)配合物等化學(xué)原因造成對比爾定律的偏離。分子熒光光度法：熒光熄滅：由于熒光物質(zhì)分子間或與其它物質(zhì)相互作用，引起熒光強(qiáng)度顯著下降的現(xiàn)象叫做熒光熄滅（quenching）或猝滅。引起熒光熄滅的物質(zhì)稱為熒光熄滅劑，如鹵素離子、重金屬離子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物和羧基化合物等。十二、注意事項(xiàng)：紫外可見分光光度法：顯色溫度，顯色時(shí)間，溶劑的影響，合適的PH。分子熒光光度法：激發(fā)波長的選擇，激發(fā)時(shí)間的選擇，常閉物質(zhì)的選擇等。十三、分析方法：紫外可見分光光度法：定性分析：根據(jù)吸收光譜的形狀，吸收峰的數(shù)目， 用經(jīng)驗(yàn)規(guī)則計(jì)算max,與測定的max比較 ； 比較未知物與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在相同化學(xué)環(huán)境

16、與測量條件下的紫外-可見吸收光譜，若吸收光譜的形狀、吸收峰的數(shù)目、 max()、max完全相同，就可以確定未知物與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)具有相同的生色團(tuán)與助色團(tuán)，但并不能斷定兩者為同一化合物。結(jié)構(gòu)分析：根據(jù)官能團(tuán)特征波普來判斷。定量分析：比爾定律，可利用工作曲線求解，多組分同時(shí)測定時(shí)，可用吸光度加和性求解。分子熒光光度法：定性分析：熒光物質(zhì)的特征光譜包括激發(fā)光譜和熒光光譜，因此用它鑒定物質(zhì)比吸收光譜可靠。定量分析：標(biāo)準(zhǔn)曲線法和直接比較法。十四、應(yīng)用： 紫外可見分光光度法：無機(jī)陰、陽離子的測定 利用高靈敏、高選擇性的有機(jī)顯色劑，與被測無機(jī)離子發(fā)生配合或氧化還原反應(yīng)，可測定周期表中絕大多數(shù)元素兩組分的同時(shí)測定例

17、：臨床中麻醉劑：普魯卡因丁卡因注射液，它含有兩種成分：鹽酸普魯卡因和鹽酸丁卡因這兩種化合物結(jié)構(gòu)相似，最大吸收波長分別為291和312nm。但鹽酸丁卡因的毒性比前者大10倍，因此配制時(shí)應(yīng)嚴(yán)格限制其含量，可采用雙波長，利用吸光度具有加和性來測定和求解，以減少二種化合物吸收峰重疊而產(chǎn)生的測量誤差。 有機(jī)化合物的定量分析 直接法。若有機(jī)化合物本身在結(jié)構(gòu)上含有雙鍵或芳環(huán)，即含有共軛電子，則可直接測定其含量。如微量氨基酸的測定。氨基酸的吸收波長在280nm左右，且 較小,低含量的氨基酸很難用直接法準(zhǔn)確測定。可用茚三酮與各種氨基酸反應(yīng)，生成無色還原型茚三酮，過量的茚三酮又與還原型茚三酮和氨縮合生成紫藍(lán)色產(chǎn)物

18、，稱為Ruhemann紫，lmax=570nm，利用此反應(yīng)可測微量的氨基酸。 分子熒光光度法：有機(jī)物的熒光分析：由于熒光分析的高靈敏度、高選擇性，使它在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、衛(wèi)生檢驗(yàn)、藥物分析、環(huán)境檢測及食品分析等方面有廣泛的應(yīng)用。 芳香族及具有芳香結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，在紫外光照射下能產(chǎn)生熒光。因此，熒光分析法可直接用于這類有機(jī)物的測定，如：多環(huán)胺類、萘酚類、嘌呤類、吲哚類、多環(huán)芳烴類、具有芳環(huán)或芳雜環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸及蛋白質(zhì)等，約有200多種。食品中維生素含量的測定是食品分析的常規(guī)項(xiàng)目，幾乎所有種類的維生素都可以用熒光法進(jìn)行分析。多環(huán)芳烴普遍存在于大氣、水、土壤、動(dòng)植物及加工食品中，大家所熟知的苯并a芘是致癌活性最

19、強(qiáng)的一種，通過萃取或色譜分離后，可采用熒光法進(jìn)行測定。該方法準(zhǔn)確可靠，測定最低濃度可達(dá) 0.1 mg/ml。應(yīng)用實(shí)例：食品中VB2（核黃素）的測定 其測定原理是VB2在440500 nm波長的光照射下，發(fā)出黃綠色熒光，在波長525 nm下測定其熒光強(qiáng)度，在稀溶液中其熒光強(qiáng)度與VB2的濃度成正比。為消除試液中共存熒光雜質(zhì)的干擾，可在測定過熒光強(qiáng)度的溶液中加入連二亞硫酸鈉（Na2S2O4），將VB2還原為無熒光的物質(zhì)，然后再測定試液中殘余的熒光雜質(zhì)的熒光強(qiáng)度，兩者之差即為食品中VB2的熒光強(qiáng)度。該方法被作為食品分析的國家標(biāo)準(zhǔn)分析方法。 無機(jī)元素的熒光分析： 能產(chǎn)生熒光的無機(jī)物較少，對其進(jìn)行分析通常是將待測元素與熒光試劑反應(yīng)，生成具有熒光特性的配合物，進(jìn)行間接測定。目前利用該法可進(jìn)行熒光分析的無機(jī)元素已近70種。常見的有鉻、鋁、鈹、硒、鍺、鎘等及部分稀土元素。例如Al3+與桑色素或8-羥基喹啉的配合物就可產(chǎn)生熒光，從而用于鋁的測定。有些元素雖不能與有機(jī)試劑形成能產(chǎn)生熒光的配合物，但它可使熒光物質(zhì)的熒光熄滅。例如F-離子在一定pH的溶液中，能從Al3+與桑色素的熒光配合物中奪取Al3+，從而導(dǎo)致熒光配合物