酶免檢測技術原理及影響

1、酶免檢測技術原理及影響因素酶免檢測技術原理及影響因素檢驗科檢驗科 孫文鮮3月月18日免疫室差錯問題分析及整改措施日免疫室差錯問題分析及整改措施3月18日免疫室出現(xiàn)了標本漏檢問題，導致病人情緒不滿，甚至大吵大鬧，給科室形象造成了一定的影響。暴露出了免疫室一些問題，如嚴格按檢測流程執(zhí)行力度問題，認真細心問題等，同時也違背了免疫室規(guī)定的檢驗報告結果時效性原則和以病人為中心的服務宗旨。針對上述事件，經(jīng)免疫室人員討論、分析，制定出以下整改措施：1、端正態(tài)度、要認真、負責2、嚴格執(zhí)行免疫室檢驗流程，仔細核對標本，不同批次檢測標本 標記清楚3、增加人員緩解緊張工作狀態(tài)4、歡迎大家給出寶貴建議5、堅持免疫室兩

2、個原則免疫室簡介免疫室簡介檢驗項目檢驗項目普免術前四項（普免）術前四項（急篩復查）體檢AFPCEA體檢HAV(IgM)HEV(IgM、IgG)HBcAbTAP化學發(fā)光腫瘤性激素HCG貧血三項胰島素C-肽自身免疫自免肝四項ENA譜抗核抗體抗線粒體抗體血管炎過敏原呼吸道HIV初篩實驗室迎檢任務前景展望檢測方面：免疫球蛋白、補體、免疫細胞、細胞因子、免疫移植等，技術方面：電泳技術、細胞技術、分子生物學技術、流式細胞技等教學方面：華信臨床檢驗技術專業(yè)免疫室簡介免疫室簡介工作人員工作人員 姓名姓名職稱職稱職務職務職責職責狀態(tài)狀態(tài)孫文鮮孫文鮮主管檢驗技師主管檢驗技師常規(guī)免疫常規(guī)免疫免疫室組長免疫室組長固定

3、人員固定人員劉麗娜劉麗娜主管檢驗技師主管檢驗技師發(fā)光免疫發(fā)光免疫免疫室質控管理員免疫室質控管理員固定人員固定人員史可史可檢驗師檢驗師自身免疫自身免疫免疫室生物安全及免疫室生物安全及感染控制管理員感染控制管理員固定人員固定人員馮凡馮凡檢驗員檢驗員常規(guī)免疫常規(guī)免疫免疫室儀器維護免疫室儀器維護及信息管理員及信息管理員固定人員固定人員夜班人員夜班人員科室骨干科室骨干科室骨干科室骨干科室骨干科室骨干暫時固定暫時固定堅持兩個原則：堅持兩個原則：1 1、堅持檢驗結果的準確性、及時性、有效性、堅持檢驗結果的準確性、及時性、有效性 2 2、堅持以病人為中心，全心全心全意服務病人、堅持以病人為中心，全心全心全意服

4、務病人免疫室簡介免疫室簡介免疫室日常工作量免疫室日常工作量（3 3月月2323日為例）日為例）項目標本量（人份）項目包括內容備注普篩88門診、病房普篩，乙肝五項（ 酶免法）急篩復查47所有急篩（酶免法）發(fā)光51腫瘤、性激素、貧血三項、胰島素、C-肽、HCG體檢37AFP、CEA、乙肝五項、丙肝、普篩自免3自身免疫、呼吸道、過敏原、雜項9TB、HP、TAP、HPV、HAV、HEV、HBcAb-IgM總計234免疫室簡介免疫室簡介免疫室特殊項目檢測成本免疫室特殊項目檢測成本項目成本（）項目成本（）項目成本（）項目成本（）備注AFP66.29FSH66.29Ferr52.51呼吸道63.98CEA6

5、6.29LH66.29Foll89.97過敏原69.63CA15374.76P66.29B1290.05抗核抗體66.60CA19985.59T66.29胰島素67.94抗ds-DNA158.20CA12585.59PRL66.29C-肽62.20抗平滑肌抗體69.69FPSA85.59E266.29自免肝55.02ENA譜57.50TPSA85.59HCG66.29血管炎61.70抗線粒體抗體待定注：此統(tǒng)計結果可信度為95一、抗原抗體反應一、抗原抗體反應二、酶免疫技術的分類、原理及特點二、酶免疫技術的分類、原理及特點三、酶聯(lián)免疫吸附試驗三、酶聯(lián)免疫吸附試驗四、四、ELISAELISA法檢測注

6、意事項法檢測注意事項五、五、ELISAELISA法檢測常見問題及解決方法法檢測常見問題及解決方法一、抗原抗體反應一、抗原抗體反應抗原抗體反應原理抗原抗體反應原理抗原抗體結合反應是抗原決定簇和抗體分子超變區(qū)在化抗原抗體結合反應是抗原決定簇和抗體分子超變區(qū)在化學結構和空間結構上具有互補性，使抗原表位嵌入抗體學結構和空間結構上具有互補性，使抗原表位嵌入抗體超變區(qū)的槽溝，發(fā)生特異性結合，其關系如鑰匙和鎖。超變區(qū)的槽溝，發(fā)生特異性結合，其關系如鑰匙和鎖。有四種分子間作用力參與并促使抗原、抗體的結合。有四種分子間作用力參與并促使抗原、抗體的結合。抗原抗體反應原理抗原抗體反應原理氫鍵結合力氫鍵結合力范德華引

7、力范德華引力靜電引力靜電引力疏水作用力疏水作用力抗抗原原抗抗體體結結合合力力抗原抗體反應特點及影響因素抗原抗體反應特點及影響因素抗原抗體反應特點：抗原抗體反應特點：1 1、特異性、特異性 2 2、比例性、比例性 3 3、可逆性、可逆性抗原抗體反應影響因素：抗原抗體反應影響因素：1 1、反應物自身因素：抗原、反應物自身因素：抗原 抗體抗體2 2、反應環(huán)境條件：電解質、反應環(huán)境條件：電解質 酸堿度酸堿度 溫溫 度度抗原抗體反應影響因素：抗原抗體反應影響因素：1 1、反應物自身因素：、反應物自身因素： 抗原抗原 理化性狀、表位種類、數(shù)目理化性狀、表位種類、數(shù)目 抗體抗體 來源、特異性、親和性、效價來

8、源、特異性、親和性、效價2 2、反應環(huán)境條件：、反應環(huán)境條件： 電解質電解質 85g/LNaCl85g/LNaCl溶液溶液 酸堿度酸堿度 pH6-9pH6-9為宜為宜 溫溫 度度 最適溫度為最適溫度為3737二、酶免疫技術的分類、特點及原理二、酶免疫技術的分類、特點及原理1 1、酶免技術的分類、酶免技術的分類.酶酶免免疫疫技技術術酶免疫組化酶免疫組化組織切片或其它標本中抗原的定位組織切片或其它標本中抗原的定位 酶免疫測定酶免疫測定液體標本中抗原或液體標本中抗原或抗體的定性和定量抗體的定性和定量均相均相 異相異相固相酶免疫測定固相酶免疫測定液相液相酶免疫測定酶免疫測定1、酶放大免疫測定技術EMI

9、T2、克隆酶供體免疫分析CEDIA分離結合、游離酶標記物，底物測定檢測微量短肽激素、小分子抗原最廣泛，酶聯(lián)免疫吸附試驗小分子激素、半抗原測定 酶免技術的分類酶免技術的分類2 2、酶免技術特點、酶免技術特點抗原抗體反應的特異性抗原抗體反應的特異性 +酶高效催化反應的專一性酶高效催化反應的專一性 主要試劑主要試劑: : 酶標記的抗體或抗原酶標記的抗體或抗原 酶標物特點：酶標物特點： 免疫學活性免疫學活性 酶對底物的催化活性酶對底物的催化活性3 3、酶免技術原理及特點、酶免技術原理及特點二、酶聯(lián)免疫吸附試驗二、酶聯(lián)免疫吸附試驗1 1、基本原理基本原理.原理原理包被包被12反應反應加入待測抗體或加入待

10、測抗體或抗原和酶標抗原抗原和酶標抗原或抗體或抗體3洗滌洗滌使結合在固相上使結合在固相上的抗原抗體復合物的抗原抗體復合物與未結合的分離與未結合的分離4底物顯色底物顯色定性或定量的分析定性或定量的分析三個必要試劑三個必要試劑 固相的抗原或抗體固相的抗原或抗體 酶標記物（酶結合物酶標記物（酶結合物） 酶反應的底物酶反應的底物 .雙抗體夾心法（測抗原）雙抗體夾心法（測抗原）方法：方法：用已知抗體包被，加入待檢血清，再加酶標抗體，用已知抗體包被，加入待檢血清，再加酶標抗體，加底物顯色加底物顯色應用：應用：二價或二價以上的較大分子抗原測定二價或二價以上的較大分子抗原測定 HBsAgHBsAg、HBeAgH

11、BeAg、甲胎蛋白、甲胎蛋白、HCGHCG等等.2 2、方法類型及反應原理方法類型及反應原理方法類型及反應原理方法類型及反應原理雙位點一步法（測抗原）雙位點一步法（測抗原）方法：方法：用單克隆抗體做成固相抗體和酶標抗體，待測抗原用單克隆抗體做成固相抗體和酶標抗體，待測抗原酶標抗原同時加入，加底物顯色酶標抗原同時加入，加底物顯色應用：應用：與雙抗體夾心法相似，提高了特異性、靈敏與雙抗體夾心法相似，提高了特異性、靈敏度，需注意度，需注意“鉤狀效應鉤狀效應”競爭法競爭法（測抗原）（測抗原） 方法：方法：用已知抗體包被，加入待測血清，再加酶標抗用已知抗體包被，加入待測血清，再加酶標抗原，酶標抗原與待檢

12、物競爭與包被物結合。加底物顯色原，酶標抗原與待檢物競爭與包被物結合。加底物顯色。 應用：應用：用于只有一個抗原決定簇的小分子半抗原（藥物、用于只有一個抗原決定簇的小分子半抗原（藥物、激素等）激素等）方法類型及反應原理方法類型及反應原理.雙抗原夾心法雙抗原夾心法（測抗體）（測抗體）原理：原理：類似雙抗體夾心法類似雙抗體夾心法操作步驟操作步驟：類似類似 應用：應用：乙型肝炎表面抗體乙型肝炎表面抗體方法類型及反應原理方法類型及反應原理方法類型及反應原理方法類型及反應原理間接法間接法（測抗體）（測抗體）方法方法用已知抗原包被，加入待測血清，再加酶標的抗用已知抗原包被，加入待測血清，再加酶標的抗人人Ig

13、GIgG（抗抗體或二抗）加底物顯色。（抗抗體或二抗）加底物顯色。優(yōu)點優(yōu)點一種酶標抗抗體檢測各種與抗原相應的抗體一種酶標抗抗體檢測各種與抗原相應的抗體應用應用常用于常用于HCVHCV抗體、抗體、HIVHIV抗體和梅毒螺旋體抗體等的抗體和梅毒螺旋體抗體等的測定測定方法類型及反應原理方法類型及反應原理競爭法競爭法（測抗體）（測抗體）原理：原理：類似檢測抗原的競爭法類似檢測抗原的競爭法應用應用：乙型肝炎病毒核心抗體乙型肝炎病毒核心抗體(HBcAb)(HBcAb)和和乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒e e抗體抗體(HBeAb)(HBeAb)的檢測的檢測 方法類型及反應原理方法類型及反應原理捕獲法捕獲法（測抗體）

14、（測抗體） 應用：應用：病原體急性感染診斷中的病原體急性感染診斷中的IgMIgM型抗體型抗體 甲型肝炎甲型肝炎HAV-IgMHAV-IgM抗體抗體 乙型肝炎病毒核心乙型肝炎病毒核心HBc-IgMHBc-IgM抗體抗體四、四、ELISAELISA法檢測注意事項法檢測注意事項1 1、標本、標本避免溶血、避免溶血、高脂血、高脂血、纖維蛋白凝塊纖維蛋白凝塊盡量新鮮，避免細菌污染盡量新鮮，避免細菌污染 一般一般5 5天內檢測的血清可天內檢測的血清可44保存，否則低溫保存。保存，否則低溫保存。 2 2、 試試 劑劑. .試劑盒保存于試劑盒保存于2-82-8. .使用前應先將檢測試劑使用前應先將檢測試劑 盒

15、放置室溫平衡盒放置室溫平衡15-3015-30 分鐘，保證酶等液體的初始反應溫度及分鐘，保證酶等液體的初始反應溫度及 活性劑的溶解?；钚詣┑娜芙?。. .觀察外包裝和內組份有無漏液。觀察外包裝和內組份有無漏液。 3 3、加、加 樣樣 A. A. 加樣不可太快；加樣不可太快； B. B. 要避免加在孔壁上部；要避免加在孔壁上部； C. C. 不可濺出；不可濺出； D. D. 避免產(chǎn)生氣泡；避免產(chǎn)生氣泡； E. E. 盡可能使用同一加樣器，裝緊槍盡可能使用同一加樣器，裝緊槍 頭，加樣后充分混勻。頭，加樣后充分混勻。加樣器定期校準！加樣器定期校準！溫育溫度的選擇溫育溫度的選擇足夠的反應時間足夠的反應時

16、間“邊緣效應邊緣效應”的排除的排除4 4、溫、溫 育育5 5、洗、洗 板板 6 6、顯、顯 色色u 檢查底物溶液的有效性；檢查底物溶液的有效性；u 試劑顯色時先加試劑顯色時先加A A液，液， 后加后加B B液，二者不要顛倒。液，二者不要顛倒。 前后加入的間隔時間前后加入的間隔時間 不超過不超過1010分鐘，不漏加。分鐘，不漏加。uA A、B B液應避免接觸污染物。液應避免接觸污染物。u不同廠家、批次酶顯色液不同廠家、批次酶顯色液 不得混用不得混用 7 7、終止和讀數(shù)、終止和讀數(shù)p肉眼判斷不準確，影響結果肉眼判斷不準確，影響結果p酶標儀的波長選擇的問題。酶標儀的波長選擇的問題。p加完終止液后加完

17、終止液后3030分鐘內讀取數(shù)據(jù)。分鐘內讀取數(shù)據(jù)。p保證酶標板的底部是清潔干燥的。保證酶標板的底部是清潔干燥的。p酶標儀臨界值計算公式的設定酶標儀臨界值計算公式的設定8 8、結果判讀、結果判讀 項目項目CUTOFFCUTOFF陽性判斷陽性判斷HIVHIV（科華）（科華）0.10.1MINMIN（PCxPCx，2.5)2.5)cutcutHIVHIV（麗珠）（麗珠）0.15+MAX(NCx,0.08)0.15+MAX(NCx,0.08)cutcut灰區(qū)又稱灰色帶反灰區(qū)又稱灰色帶反應。就是把應。就是把ODOD值在值在Cut offCut off值正負值正負20%20%這個范圍內的標本這個范圍內的標本

18、稱為灰區(qū)標本。這稱為灰區(qū)標本。這個范圍稱為灰區(qū)。個范圍稱為灰區(qū)。. .灰區(qū)是客觀存在的，沒灰區(qū)是客觀存在的，沒有不存在灰區(qū)有不存在灰區(qū) 的試劑，的試劑，我們只是盡量減少灰區(qū)的我們只是盡量減少灰區(qū)的出現(xiàn)比例。出現(xiàn)比例。. .減少灰區(qū)最有效的方法減少灰區(qū)最有效的方法就是盡量將板洗滌干凈。就是盡量將板洗滌干凈。不同試劑盒不同試劑盒，CUTOFFCUTOFF值計算方法不同值計算方法不同例：五、五、ELISAELISA法檢測常見問題及解決方法法檢測常見問題及解決方法ELISAELISA實驗常見問題及解決方法實驗常見問題及解決方法p 類風濕因子類風濕因子：一般為IgM型，可與變性IgG Fc段非特異結合，

19、因此可能與包被的IgG以及隨后加入的酶標IgG結合而產(chǎn)生假陽性。p 補體：補體：包被抗體及隨后加入的酶標抗體均能激活補體而與補體C1q位點結合而產(chǎn)生假陽性，也可降低檢測物與固相結合而引起假陰性或測值偏低p 異嗜性抗體：異嗜性抗體：人血清中含有抗 齒類動物（羊、鼠等）Ig的抗體，即天然異嗜性抗體。與酶標二抗出現(xiàn)假陽性。p 溶菌酶：溶菌酶：可與等電點5的低等電點蛋白強結合，雙抗體夾心法ELISA可假陽性。p 溶血溶血：Hb中的血紅素集團有類似過氧化物的活性，溫育時吸附固相可與HRP顯色。p 細菌污染：細菌污染：細菌分泌的一些酶可對抗原抗體蛋白分解或直接影響酶標抗體作用，并且細菌引起標本混濁。p 標本標本44存放過久：存放過久：IgG聚合成二聚體，間接法中易假陽性。建議1:201:20準確配置洗滌液1010、試劑盒運輸時間太長，受高溫影響、試劑盒運輸時間太長，受高溫影響夏天長途運輸時，縮短時間，低溫措施1111、試劑盒失效、試