ZA包涵體形成以和處理手段517

1、包涵體的形成以及處理方法包涵體的形成以及處理方法1 包涵體形成的原因（1）表達(dá)量過高，研究發(fā)現(xiàn)在低表達(dá)時很少形成包涵體，表達(dá)量越高越容易形成包涵體 L2。原因可能是合成速度太快，以至于沒有足夠的進(jìn)度進(jìn)行折疊，二硫鍵不能正確配對，過多蛋白間的非特異性結(jié)合，蛋白質(zhì)無法達(dá)到足夠的溶解度等。（2）重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，真核糖蛋白無法糖基化使中問體溶解度下降，導(dǎo)致不溶解包涵體形成。（3）重組蛋白分泌序列的存在阻礙折疊，導(dǎo)致不對折疊分子的產(chǎn)生。 （4）重組蛋白的氨基酸組成，一般來說含硫氨基酸越多越容易形成包涵體。（5）包涵體形成動力學(xué)研究表明，包涵體是由部分變性的中間體聚合而成。因此，任何影響中間

2、體穩(wěn)定的因素，如 pH 值（pH 接近蛋白的等電點(diǎn)時容易形成包涵體）離子強(qiáng)度和溫度都可以引起蛋白聚合反應(yīng)。（6）在細(xì)菌分泌的某個階段，蛋白質(zhì)分子間的離子鍵、疏水鍵或共價鍵等化學(xué)作用導(dǎo)致了包涵體的形成。（7）有報道認(rèn)為，豐富的培養(yǎng)基有利于活性蛋白質(zhì)的表達(dá)，當(dāng)培養(yǎng)條件不佳時，容易形成包涵體？。.包涵體的處理包涵體的形成具有有利的一面，也有不利的一面。有利的一面是包涵體的形成去除了幾乎全部的細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)。同時，因包涵體形成避免了蛋白水解酶對表達(dá)產(chǎn)物的降解而大大提高產(chǎn)率，通常其表達(dá)量可占菌體總蛋白的 10%30%,甚至高達(dá) 50%。 不利的一面是溶解包涵體進(jìn)行復(fù)性折疊的過程中需要加變性劑和去垢劑

3、， 而引起蛋白質(zhì)的不可逆修飾以及性質(zhì)改變，這些試劑價格昂貴，且復(fù)性的制作過程不好控制。另一方面復(fù)性過程常伴有蛋白質(zhì)水解和沉淀，有些還形成異構(gòu)體s5。因此復(fù)性是蛋白質(zhì)工程中最關(guān)鍵、最復(fù)雜的問題。包涵體的處理一般有如下幾個步聚。破碎細(xì)菌細(xì)胞提取包涵體時，第一步要裂解細(xì)菌，為了防止在裂解細(xì)菌的過程中追求蛋白質(zhì)變性，常常采取一些保護(hù)措施：合適的緩沖體系，如磷酸鹽緩沖液、Tris 緩沖液、檸檬酸緩沖液。加.包涵體的形成以及處理方法入保護(hù)劑，如還原劑 DTT（2 一琉基蘇糖醇）、2 一琉基乙醇。加防止水解酶作用的試劑，如酶的抑制劑、EDTA（乙二胺四乙酸）。破菌的方法很多，主要包括以下幾種：（1）滲透破碎

4、法：.這種方法是在低滲條件使細(xì)胞溶脹而破碎。（2）冷熱交替法：把待碎樣品投人 90C左右水中維持?jǐn)?shù)分鐘后取出投入冰浴內(nèi)，可使大部分細(xì)胞破碎?？捎糜谔崛〉鞍踪|(zhì)和核酸。（3）反復(fù)凍融法：把待碎樣品冷卻到一 20c,凍固后取出，緩慢解凍，如此反復(fù)制作，細(xì)胞內(nèi)液結(jié)冰膨脹而使細(xì)胞脹破導(dǎo)致部分細(xì)胞及胞內(nèi)的顆粒破碎，但也可使生物活性物質(zhì)失活。這種方法雖簡單方便，但對溫度變化敏感的蛋白質(zhì)卻不宜采用。（4）超聲波法：使用超聲波儀使細(xì)胞膜上所受張力不均而使細(xì)胞破碎。根據(jù)不同待碎樣品采用不同頻率，不同進(jìn)度。另外，超聲波處理時溶液溫度升高會使不耐熱的物質(zhì)失活，因此使用時為防止溫度升高，除間歇開機(jī)外，還需人工降溫。避免

5、溶液內(nèi)存在氣泡，這樣會使蛋白質(zhì)變性【6】。（5）溶菌酶處理法：多用于破壞大腸桿菌等微生物的細(xì)胞壁。在每毫升含 2 億個細(xì)胞的懸液中加 100g 至 1mg 溶菌酶，37C 保溫 10min,或者室溫作用 30min,細(xì)胞就破壞了。.洗滌包涵體洗滌包涵體前先 8000r/rain,412 離心 15rain,可使大多數(shù)包涵體沉淀，與可溶性蛋白分離。為了除去包涵體上粘附的雜質(zhì)，如膜蛋白或核酸，利用洗滌液洗滌包涵體沉淀，常用去污劑 Tritonx-100 或脫氧膽酸鈉和低濃度變性劑（如 2mol/L 尿素或鹽酸月瓜等）洗滌以除去脂類，但過高濃度的尿素或鹽酸”瓜會使包涵體溶解【。.溶解包涵體包涵體一般

6、只溶于強(qiáng)的變性劑如尿素、鹽酸月瓜，它是通過離子間的相互作用，打斷包涵體蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的各種化學(xué)鍵，使多肽伸展，SDS、正十六烷基三甲基俊氯化物等去垢劑，可以破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵，溶解一些包涵體蛋白質(zhì)8。另外，對于含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)，分離的包涵體中通常含有一些鏈間形成的二硫鍵和鏈內(nèi)的非活性二硫鍵。還需加入還原劑，如琉基乙醇、二硫基蘇糖醇（DTT）,常用濃度 210mM。.包涵體的形成以及處理方法另外，尿素和鹽酸”瓜屬中強(qiáng)度變性劑，易經(jīng)透析和超濾除去。它們對包涵體氫鍵有較強(qiáng)的可逆性變性作用，所需濃度尿素 68M,鹽酸月瓜 57Mo 一般來講，鹽酸胴溶解力強(qiáng)于尿素，它能使尿素不能溶解的包涵體溶

7、解，但缺點(diǎn)是容易使 SDS一PAGE 電泳條帶變形9。尿素的溶解度為 70%90%,其分解的異氟酸鹽能導(dǎo)致多肽鏈的自由氨基甲?；?，特別是在堿性 pH 值下長期保溫時，但用尿素溶解具有不電離，呈中性，成本低，蛋白質(zhì)復(fù)性后除去尿素不會造成大量蛋白質(zhì)沉淀，以及溶解的包涵體可選用多種色譜法純化等優(yōu)點(diǎn),故目前已被廣泛采用。.復(fù)性包涵體蛋白由于包涵體中的重組蛋白缺乏生物學(xué)活性，加上劇烈的處理?xiàng)l件，使蛋白的高級結(jié)構(gòu)破壞，因此重組蛋白的復(fù)性特別必要。通過緩慢去除變性劑使目標(biāo)蛋白從變性的完全伸展?fàn)顟B(tài)恢復(fù)到正常的折疊結(jié)構(gòu)，同時去除還原劑使二硫鍵正常形成1。一般在尿素濃度 4M 左右時復(fù)性開始，到 2M 左右時結(jié)束

8、。對于鹽酸月瓜而言，從 4M 開始，到 1.5M時復(fù)性過程結(jié)束。包涵體蛋白的復(fù)性是一個非常復(fù)雜的過程，除與控制蛋白質(zhì)復(fù)性的過程相關(guān)外,還在很大程度上與蛋白質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)，有些蛋白非常容易復(fù)性，在較寬松的條件下復(fù)性效率可以達(dá)到 95%以上，而有一些蛋白至今沒有發(fā)現(xiàn)能夠?qū)ζ溥M(jìn)行復(fù)性的方法，很多蛋白的復(fù)性效率只有百分之幾，一般說來，蛋白質(zhì)的復(fù)性效率在 20%左右120.復(fù)性中常采用的方法有以下幾種：（1）稀釋復(fù)性法，直接加入水或緩沖液，放置過夜，缺點(diǎn)是體積增加較大，變性劑稀釋速度太快，不易控制13）。（2）透析復(fù)性法，好處是不增加體積，通過逐漸降低外透液濃度來控制變性劑去除速度， 有人稱易形成沉淀， 且不適合大規(guī)模制作， 無法應(yīng)用到生產(chǎn)規(guī)模 1。 （3）超濾復(fù)性，在生產(chǎn)中較多使用，規(guī)模較大，易于對透析