CHAPTER 4, 愈傷組織培養(yǎng)

1、第第4章章 愈傷組織培養(yǎng)愈傷組織培養(yǎng)l定義定義:指將外植體接種到培養(yǎng)基上，進(jìn)行愈傷指將外植體接種到培養(yǎng)基上，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)、生長(zhǎng)和分化的培養(yǎng)過程。組織誘導(dǎo)、生長(zhǎng)和分化的培養(yǎng)過程。愈傷組織培養(yǎng)愈傷組織培養(yǎng)(callus culture) l從外植體脫分化形成愈傷組織大致可分為從外植體脫分化形成愈傷組織大致可分為三個(gè)時(shí)期：三個(gè)時(shí)期：誘導(dǎo)期誘導(dǎo)期分裂期分裂期分化期分化期第一節(jié)第一節(jié) 愈傷組織的誘導(dǎo)和分化愈傷組織的誘導(dǎo)和分化 一一 愈傷組織的誘導(dǎo)愈傷組織的誘導(dǎo)l誘導(dǎo)愈傷組織的關(guān)鍵主要是誘導(dǎo)愈傷組織的關(guān)鍵主要是培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件，其，其中激素的成分和濃度是最重要的因素。中激素的成分和濃度是最重要的因素。

2、組織培養(yǎng)中的脫分化和愈傷組織的形成 脫分化脫分化：從分化狀態(tài)（細(xì)胞分裂已停止）從分化狀態(tài)（細(xì)胞分裂已停止）轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂蟹至艳D(zhuǎn)變?yōu)榫哂蟹至涯芰Φ姆稚鸂顟B(tài)細(xì)胞并形成未（脫）分化的愈傷組織的過能力的分生狀態(tài)細(xì)胞并形成未（脫）分化的愈傷組織的過程。程。 愈傷組織的形成過程愈傷組織的形成過程愈傷形成大致分為三個(gè)時(shí)期愈傷形成大致分為三個(gè)時(shí)期（1）起動(dòng)脫分化時(shí)期起動(dòng)脫分化時(shí)期：即誘導(dǎo)期：即誘導(dǎo)期(起動(dòng)期起動(dòng)期)，誘導(dǎo)期是細(xì)胞正在準(zhǔn)備分裂的時(shí)期。誘導(dǎo)期是細(xì)胞正在準(zhǔn)備分裂的時(shí)期。 細(xì)胞改變了原有的代謝方式細(xì)胞改變了原有的代謝方式,合成代謝加強(qiáng)合成代謝加強(qiáng),迅速進(jìn)行蛋白質(zhì)和核酸的合成迅速進(jìn)行蛋白質(zhì)和核酸的合成,為細(xì)

3、為細(xì)胞分裂做準(zhǔn)備胞分裂做準(zhǔn)備. 細(xì)胞質(zhì)增加，出現(xiàn)活躍的原生質(zhì)流動(dòng)，貯藏物質(zhì)淀粉等消失；隨著組織的活細(xì)胞質(zhì)增加，出現(xiàn)活躍的原生質(zhì)流動(dòng)，貯藏物質(zhì)淀粉等消失；隨著組織的活化，細(xì)胞內(nèi)核糖體增加并形成大量多聚核糖體；化，細(xì)胞內(nèi)核糖體增加并形成大量多聚核糖體；RNA迅速合成和累積；但細(xì)迅速合成和累積；但細(xì)胞大小無多大變化。胞大小無多大變化。 生長(zhǎng)的誘導(dǎo)生長(zhǎng)的誘導(dǎo):植物的組織、細(xì)胞離體培養(yǎng)時(shí)，如果給予一定的條件，植物的組織、細(xì)胞離體培養(yǎng)時(shí)，如果給予一定的條件，使已分化成熟（停止分裂）的細(xì)胞重新分裂，增殖生長(zhǎng)使已分化成熟（停止分裂）的細(xì)胞重新分裂，增殖生長(zhǎng). 影響愈傷組織誘導(dǎo)的因素影響愈傷組織誘導(dǎo)的因素 植物

4、種類、生理狀況、外部因素不同，誘導(dǎo)期不同。植物種類、生理狀況、外部因素不同，誘導(dǎo)期不同。 弱光下植株比強(qiáng)光下的植株外植體易于誘導(dǎo)分裂弱光下植株比強(qiáng)光下的植株外植體易于誘導(dǎo)分裂 二氧化碳抑制誘導(dǎo)分化二氧化碳抑制誘導(dǎo)分化 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)細(xì)胞開始分裂生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)細(xì)胞開始分裂 損傷剌激能加速脫分化進(jìn)行，有時(shí)還是某些材料能否損傷剌激能加速脫分化進(jìn)行，有時(shí)還是某些材料能否脫分化的決定條件。脫分化的決定條件。 l菊芋菊芋 剛收獲塊莖剛收獲塊莖 22hr 貯藏貯藏5個(gè)月個(gè)月2天天 l胡蘿卜胡蘿卜 幾天幾天 弱光下的植物比強(qiáng)光下的植物易誘導(dǎo)弱光下的植物比強(qiáng)光下的植物易誘導(dǎo)(離體培養(yǎng)前暗處理離體培養(yǎng)前暗處理)

5、脫分化難易因物種、器官及其生理狀態(tài)而異，脫分化難易因物種、器官及其生理狀態(tài)而異，煙草、胡蘿卜易，禾谷類難，花器官易，莖煙草、胡蘿卜易，禾谷類難，花器官易，莖葉難，幼嫩組織易，成熟老組織難。葉難，幼嫩組織易，成熟老組織難。 （2）分裂期）分裂期：已具一定功能和結(jié)構(gòu)的分化和成熟的細(xì)胞：已具一定功能和結(jié)構(gòu)的分化和成熟的細(xì)胞 回復(fù)到具回復(fù)到具分裂能力的分生狀態(tài)分裂能力的分生狀態(tài).細(xì)胞分裂的結(jié)果細(xì)胞分裂的結(jié)果標(biāo)志標(biāo)志著脫分化的完成。著脫分化的完成。 分生狀態(tài)分生狀態(tài):細(xì)胞變小、細(xì)胞質(zhì)稠密、液泡變小、核和核仁變細(xì)胞變小、細(xì)胞質(zhì)稠密、液泡變小、核和核仁變大并趨向細(xì)胞中央大并趨向細(xì)胞中央 分分 化化脫分化脫分

6、化1、分裂前細(xì)、分裂前細(xì)胞胞核的位置核的位置必定在萌發(fā)孔對(duì)面緊靠必定在萌發(fā)孔對(duì)面緊靠胞壁胞壁在花粉粒中無確定的位在花粉粒中無確定的位置置2、分裂前、分裂前、中的細(xì)中的細(xì)胞質(zhì)胞質(zhì)除一部分靠胞壁外，大除一部分靠胞壁外，大部分集中在核對(duì)著部分集中在核對(duì)著萌發(fā)孔的一側(cè)萌發(fā)孔的一側(cè)在核的周圍分布比較均在核的周圍分布比較均勻勻3、紡綞體、紡綞體紡綞體不對(duì)稱，近壁端紡綞體不對(duì)稱，近壁端鈍，游離端尖，后鈍，游離端尖，后期向末端轉(zhuǎn)化階段，期向末端轉(zhuǎn)化階段，紡綞體軸向發(fā)生變紡綞體軸向發(fā)生變化化分裂過程中紡綞體對(duì)稱分裂過程中紡綞體對(duì)稱4、新細(xì)胞壁、新細(xì)胞壁分裂后形成的細(xì)胞壁呈分裂后形成的細(xì)胞壁呈孤形，位于正對(duì)萌孤形

7、，位于正對(duì)萌發(fā)孔發(fā)孔新細(xì)胞壁平直，與萌發(fā)新細(xì)胞壁平直，與萌發(fā)孔沒有特定的位置孔沒有特定的位置關(guān)系關(guān)系5、子細(xì)胞、子細(xì)胞具特定的位置、形態(tài)和具特定的位置、形態(tài)和功能功能兩個(gè)子細(xì)胞不具特定的兩個(gè)子細(xì)胞不具特定的形態(tài)和功能形態(tài)和功能花粉分化的第一次有絲分裂是在有極性的狀態(tài)下進(jìn)行的分裂，而脫分花粉分化的第一次有絲分裂是在有極性的狀態(tài)下進(jìn)行的分裂，而脫分化是在失去極性的狀態(tài)下進(jìn)行的分裂化是在失去極性的狀態(tài)下進(jìn)行的分裂 小麥花粉分化和脫分化第一次有絲分裂的差異小麥花粉分化和脫分化第一次有絲分裂的差異 陸文樑（1982） l脫分化后的愈傷組織其薄壁細(xì)胞是非勻質(zhì)的脫分化后的愈傷組織其薄壁細(xì)胞是非勻質(zhì)的:愈傷組

8、織雖然未分化出愈傷組織雖然未分化出其它特化組織（如維管束等），其薄壁細(xì)胞在組成上仍是有差異的其它特化組織（如維管束等），其薄壁細(xì)胞在組成上仍是有差異的l在脫分化過程中，伴隨著在脫分化過程中，伴隨著細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化的變化 通過脫分化形成的愈傷組織在培養(yǎng)過程中保持具分生能力的薄壁細(xì)胞或肉通過脫分化形成的愈傷組織在培養(yǎng)過程中保持具分生能力的薄壁細(xì)胞或肉眼觀察不出的分化程度較低的狀態(tài)（內(nèi)部已形成一定的形態(tài)組織或細(xì)胞），眼觀察不出的分化程度較低的狀態(tài)（內(nèi)部已形成一定的形態(tài)組織或細(xì)胞），因此習(xí)慣上稱愈傷組織是處在因此習(xí)慣上稱愈傷組織是處在“沒有分化沒有分化”、“脫分化脫分化”狀態(tài)的細(xì)胞狀態(tài)的

9、細(xì)胞 l培養(yǎng)組織的生理生化特性也有變化培養(yǎng)組織的生理生化特性也有變化，原有組織的一些特殊代謝產(chǎn)，原有組織的一些特殊代謝產(chǎn)物（如生物堿或其它次生物質(zhì)）減少，消失或代之以另外一些前物（如生物堿或其它次生物質(zhì)）減少，消失或代之以另外一些前體或結(jié)構(gòu)不同的類似物體或結(jié)構(gòu)不同的類似物 例如例如:甜菜根一般不形成淀粉，但離體培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞中有相當(dāng)多的甜菜根一般不形成淀粉，但離體培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞中有相當(dāng)多的淀粉形成淀粉形成 。分裂期分裂期：起動(dòng)后的細(xì)胞進(jìn)行活躍的細(xì)胞分裂：起動(dòng)后的細(xì)胞進(jìn)行活躍的細(xì)胞分裂. 1細(xì)胞的細(xì)胞的數(shù)目迅速增加數(shù)目迅速增加（外層先開始旺盛分裂）。胡蘿卜培養(yǎng)（外層先開始旺盛分裂）。胡蘿卜培養(yǎng)7天后，細(xì)

10、胞數(shù)可增加天后，細(xì)胞數(shù)可增加10倍。倍。2每個(gè)細(xì)胞平均每個(gè)細(xì)胞平均鮮重下降鮮重下降。這是由于細(xì)胞鮮重的增加不如細(xì)胞數(shù)目的增加快的緣故。這是由于細(xì)胞鮮重的增加不如細(xì)胞數(shù)目的增加快的緣故。3細(xì)胞形態(tài)改變細(xì)胞形態(tài)改變：體積小，成多邊型，質(zhì)濃，液泡小或無，如同根尖和莖尖的分生組織：體積小，成多邊型，質(zhì)濃，液泡小或無，如同根尖和莖尖的分生組織細(xì)胞一樣。細(xì)胞一樣。 細(xì)胞的核和核仁增大到最大。細(xì)胞的核和核仁增大到最大。5細(xì)胞中細(xì)胞中 RNA含量減少，而含量減少，而DNA含量保持不變。含量保持不變。6隨著細(xì)胞不斷分裂和組織生長(zhǎng)，組織的總干重、蛋白質(zhì)和核酸含量大大增加，新細(xì)胞隨著細(xì)胞不斷分裂和組織生長(zhǎng)，組織的總

11、干重、蛋白質(zhì)和核酸含量大大增加，新細(xì)胞壁的合成極快。壁的合成極快。 小愈傷顆粒小愈傷顆粒 細(xì)胞數(shù)目增加、體積變小、核和核仁變大、細(xì)胞數(shù)目增加、體積變小、核和核仁變大、RNA含量持續(xù)上升。從培養(yǎng)外植體的形態(tài)變含量持續(xù)上升。從培養(yǎng)外植體的形態(tài)變化來看，表現(xiàn)為外層細(xì)胞迅速分裂。化來看，表現(xiàn)為外層細(xì)胞迅速分裂。當(dāng)細(xì)胞體當(dāng)細(xì)胞體積最小，細(xì)胞核和核仁最大，積最小，細(xì)胞核和核仁最大，RNA含量最高含量最高時(shí)，標(biāo)志著細(xì)胞處于分裂高峰時(shí)期時(shí)，標(biāo)志著細(xì)胞處于分裂高峰時(shí)期。（3）愈傷組織形成期：）愈傷組織形成期： 愈傷進(jìn)一步發(fā)育，其周緣近表面部分細(xì)胞分裂較多，（垂周分裂）形成愈傷進(jìn)一步發(fā)育，其周緣近表面部分細(xì)胞分裂

12、較多，（垂周分裂）形成愈傷形成層愈傷形成層，而愈傷深層細(xì)胞顯著增大，細(xì)胞質(zhì)變稀薄，液泡變大，核和，而愈傷深層細(xì)胞顯著增大，細(xì)胞質(zhì)變稀薄，液泡變大，核和核仁變小并移到細(xì)胞邊緣，核仁變小并移到細(xì)胞邊緣，RNA含量下降，在外植體切口處明顯可見一團(tuán)含量下降，在外植體切口處明顯可見一團(tuán)團(tuán)有一定生長(zhǎng)型式的愈傷組織。團(tuán)有一定生長(zhǎng)型式的愈傷組織。三個(gè)發(fā)育時(shí)期各有其主要特征，但并不專一，有時(shí)會(huì)交叉混雜發(fā)生三個(gè)發(fā)育時(shí)期各有其主要特征，但并不專一，有時(shí)會(huì)交叉混雜發(fā)生。形成期形成期是指外植體經(jīng)過誘導(dǎo)期和分裂期后形成了無序結(jié)構(gòu)的愈傷組織的時(shí)期。是指外植體經(jīng)過誘導(dǎo)期和分裂期后形成了無序結(jié)構(gòu)的愈傷組織的時(shí)期。愈傷組織表層與

13、近表層的明顯界線愈傷組織表層與近表層的明顯界線l外植體外層細(xì)胞發(fā)生分裂外植體外層細(xì)胞發(fā)生分裂;l分裂期的愈傷組織的特征分裂期的愈傷組織的特征:細(xì)胞分裂快細(xì)胞分裂快,結(jié)構(gòu)疏松結(jié)構(gòu)疏松,缺少組織的結(jié)構(gòu)缺少組織的結(jié)構(gòu),顏顏色淺而透明色淺而透明. where the callus (c) arises from二、二、 愈傷組織內(nèi)部的組織分化愈傷組織內(nèi)部的組織分化 分化期分化期: 停止分裂的細(xì)胞發(fā)生生理生化代謝變化而形成不同停止分裂的細(xì)胞發(fā)生生理生化代謝變化而形成不同形態(tài)和功能的細(xì)胞形態(tài)和功能的細(xì)胞.最明顯最明顯特征特征:細(xì)胞體積不再減小細(xì)胞體積不再減小,保持相對(duì)不變保持相對(duì)不變化化.l 進(jìn)入進(jìn)入分化

14、分化期后，細(xì)胞的平均大小相對(duì)穩(wěn)定期后，細(xì)胞的平均大小相對(duì)穩(wěn)定 ，細(xì)胞分裂由原來分裂局限在組織外緣的，細(xì)胞分裂由原來分裂局限在組織外緣的垂周分裂轉(zhuǎn)為組織內(nèi)部較深層局部細(xì)胞的分裂，并改變分裂面的方向垂周分裂轉(zhuǎn)為組織內(nèi)部較深層局部細(xì)胞的分裂，并改變分裂面的方向, 出現(xiàn)瘤狀結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)瘤狀結(jié)構(gòu)的外表和內(nèi)部分化外表和內(nèi)部分化,結(jié)果形成瘤狀或片狀的擬分生組織（結(jié)果形成瘤狀或片狀的擬分生組織（meristemoid），稱做），稱做分生組織分生組織結(jié)節(jié)結(jié)節(jié)。 成熟的愈傷組織，由薄壁細(xì)胞組成，但由于它們?cè)诎l(fā)育上的可塑性，在培養(yǎng)過程中，其內(nèi)部出現(xiàn)一些特化的細(xì)胞和成熟的愈傷組織，由薄壁細(xì)胞組成，但由于它們?cè)诎l(fā)育上的可

15、塑性，在培養(yǎng)過程中，其內(nèi)部出現(xiàn)一些特化的細(xì)胞和有結(jié)構(gòu)類型的組織有結(jié)構(gòu)類型的組織 （如石細(xì)胞、色素細(xì)胞、維管組織），尚有分生細(xì)胞團(tuán)或分生結(jié)節(jié)。（如石細(xì)胞、色素細(xì)胞、維管組織），尚有分生細(xì)胞團(tuán)或分生結(jié)節(jié)。l分生組織結(jié)節(jié)可以成為愈傷組織的生長(zhǎng)中心，或者進(jìn)一步分化為維管組織結(jié)分生組織結(jié)節(jié)可以成為愈傷組織的生長(zhǎng)中心，或者進(jìn)一步分化為維管組織結(jié)節(jié)節(jié)由分生組織結(jié)節(jié)外圍的細(xì)胞作平周分裂成為形成層狀細(xì)胞，并形成了由分生組織結(jié)節(jié)外圍的細(xì)胞作平周分裂成為形成層狀細(xì)胞，并形成了部分維管組織如管胞、纖維細(xì)胞等，但不形成維管系統(tǒng)。由于此期細(xì)胞分裂部分維管組織如管胞、纖維細(xì)胞等，但不形成維管系統(tǒng)。由于此期細(xì)胞分裂已基本停止

16、，細(xì)胞內(nèi)發(fā)生生理代謝等的變化而開始形成一些不同形態(tài)和功能已基本停止，細(xì)胞內(nèi)發(fā)生生理代謝等的變化而開始形成一些不同形態(tài)和功能的細(xì)胞，因此有人又將此期稱為的細(xì)胞，因此有人又將此期稱為分化期分化期。 這些細(xì)胞團(tuán)或細(xì)胞分生結(jié)節(jié)與芽原基，根原基的發(fā)生有密切的聯(lián)系 (1)分生組織結(jié)節(jié)（瘤狀、片狀）; (2)維管組織結(jié)節(jié)；12A A 細(xì)胞分裂部位和方向發(fā)生改變：細(xì)胞分裂部位和方向發(fā)生改變：B B 形成瘤狀或片狀的形成瘤狀或片狀的分生組織結(jié)節(jié)分生組織結(jié)節(jié)?；?。或維管組織結(jié)節(jié)。維管組織結(jié)節(jié)。C C 細(xì)胞的體積相對(duì)穩(wěn)定，不再減少。細(xì)胞的體積相對(duì)穩(wěn)定，不再減少。D D 出現(xiàn)了各種類型的細(xì)胞：如管胞、纖維細(xì)胞、出現(xiàn)了

17、各種類型的細(xì)胞：如管胞、纖維細(xì)胞、薄壁細(xì)胞、分生薄壁細(xì)胞、分生細(xì)胞、色素細(xì)胞細(xì)胞、色素細(xì)胞等。等。E E 生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織呈乳白色、白色或淺綠色，老化的多轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織呈乳白色、白色或淺綠色，老化的多轉(zhuǎn)化為黃色或褐色為黃色或褐色。分化期細(xì)胞特點(diǎn)：分化期細(xì)胞特點(diǎn)：Friable易碎易碎 Hard / lignified callus Rhizogenic callus生根的愈傷生根的愈傷 Callus exuding sticky poly-saccharides滲出粘性多糖的愈傷滲出粘性多糖的愈傷 根據(jù)愈傷質(zhì)地劃分為：根據(jù)愈傷質(zhì)地劃分為：愈傷組織的繼代愈傷組織的繼代 愈傷組織誘導(dǎo)并生

18、長(zhǎng)一段時(shí)期后，愈傷組織誘導(dǎo)并生長(zhǎng)一段時(shí)期后， 必須轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上培養(yǎng)必須轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上培養(yǎng),這個(gè)過程叫這個(gè)過程叫做做繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)（營(yíng)養(yǎng)、水分的耗失和代謝產(chǎn)物積累的毒害）。（營(yíng)養(yǎng)、水分的耗失和代謝產(chǎn)物積累的毒害）。l合適時(shí)間合適時(shí)間：愈傷生長(zhǎng)即將達(dá)到頂峰以前，這時(shí)處于旺盛分裂時(shí)，繼代后容易：愈傷生長(zhǎng)即將達(dá)到頂峰以前，這時(shí)處于旺盛分裂時(shí)，繼代后容易生長(zhǎng)，繼代間隔一般四周，繼代后生長(zhǎng)，繼代間隔一般四周，繼代后3-7天恢復(fù)生長(zhǎng)，天恢復(fù)生長(zhǎng)，2-3周內(nèi)旺盛生長(zhǎng)，達(dá)到周內(nèi)旺盛生長(zhǎng)，達(dá)到頂峰后緩慢下來。頂峰后緩慢下來。l大小大?。褐睆剑褐睆?-10mm，100mg，太小難以恢復(fù)或生長(zhǎng)緩慢。，太小

19、難以恢復(fù)或生長(zhǎng)緩慢。l方法方法：切割成小塊轉(zhuǎn)移到新鮮的相同成分培養(yǎng)基上，同時(shí)達(dá)到繁殖目的，淘：切割成小塊轉(zhuǎn)移到新鮮的相同成分培養(yǎng)基上，同時(shí)達(dá)到繁殖目的，淘汰褐化和壞死的愈傷組織。汰褐化和壞死的愈傷組織。 生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織一般呈奶黃色或白色，有光澤，也有淡綠色或綠色的；老化的愈傷組織多轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色甚至褐色。2 愈傷組織的形態(tài)建成愈傷組織的形態(tài)建成 一、一、愈傷組織的形態(tài)建成愈傷組織的形態(tài)建成 外植體細(xì)胞外植體細(xì)胞在適宜的培養(yǎng)條件下在適宜的培養(yǎng)條件下發(fā)生脫分化、再分化，產(chǎn)生芽和根，或發(fā)生脫分化、再分化，產(chǎn)生芽和根，或者形成者形成胚狀體，發(fā)育成苗或完整植株。胚狀體，發(fā)育成苗或完整植

20、株。魔芋胚狀體魔芋胚狀體小麥愈傷組織小麥愈傷組織再分化再分化(redifferentiation)：是指脫分化形成：是指脫分化形成的愈傷組織在適宜的培養(yǎng)條件下又分化為胚的愈傷組織在適宜的培養(yǎng)條件下又分化為胚狀體，或直接分化出根和芽等器官形成完整狀體，或直接分化出根和芽等器官形成完整植株的過程。植株的過程。 愈傷組織的形態(tài)發(fā)生方式愈傷組織的形態(tài)發(fā)生方式: :不定芽方式不定芽方式胚狀體方式胚狀體方式植物體植物體分離分離外植體外植體脫分化脫分化愈傷組織愈傷組織再分化再分化胚狀體胚狀體根根,芽芽脫分化脫分化:是指在人工培養(yǎng)基上外植體經(jīng)過多是指在人工培養(yǎng)基上外植體經(jīng)過多次細(xì)胞分裂而失去原來的分化狀態(tài)，形

21、成次細(xì)胞分裂而失去原來的分化狀態(tài)，形成無結(jié)構(gòu)的愈傷組織或細(xì)胞團(tuán)的過程。無結(jié)構(gòu)的愈傷組織或細(xì)胞團(tuán)的過程。 再分化再分化:是指脫分化形成的愈傷組織在適宜是指脫分化形成的愈傷組織在適宜的培養(yǎng)條件下又分化為胚狀體，或直接分化的培養(yǎng)條件下又分化為胚狀體，或直接分化出根和芽等器官形成完整植株的過程。出根和芽等器官形成完整植株的過程。 植株植株細(xì)胞再分化的類型細(xì)胞再分化的類型（一）器官發(fā)生（一）器官發(fā)生:離體培養(yǎng)的組織、細(xì)胞在誘導(dǎo)條件下經(jīng)分裂和增殖再分化離體培養(yǎng)的組織、細(xì)胞在誘導(dǎo)條件下經(jīng)分裂和增殖再分化形成根和芽。形成根和芽。 1、發(fā)生方式、發(fā)生方式：（1）直接發(fā)生）直接發(fā)生：（具有初生分生能力的）外植體直

22、接分化成器官的過：（具有初生分生能力的）外植體直接分化成器官的過程。（由莖尖、腋芽、原球莖、塊莖、鱗莖等器官發(fā)生）程。（由莖尖、腋芽、原球莖、塊莖、鱗莖等器官發(fā)生）（2）間接發(fā)生間接發(fā)生：外植體（已分化的成熟組織）經(jīng)脫分：外植體（已分化的成熟組織）經(jīng)脫分化形成愈傷組織再分化形成器官的過程?；纬捎鷤M織再分化形成器官的過程。 外植體外植體 脫分化脫分化 愈傷組織愈傷組織(類分生組織類分生組織 ) 器官原基器官原基 根、芽根、芽 2、特征、特征（1）單極性）單極性 （2）器官的維管與愈傷（外植體）器官的維管與愈傷（外植體)相通相通 3、器官發(fā)生順序器官發(fā)生順序（1）先生根后生芽的方式）先生根后生

23、芽的方式 如顛茄的懸浮培養(yǎng)物，還有根易分化芽難分化的如棉花、苦瓜及許多木本植如顛茄的懸浮培養(yǎng)物，還有根易分化芽難分化的如棉花、苦瓜及許多木本植物，組培中最常見的再生器官類型是根的形成，水稻、玉米、油菜、棉花、物，組培中最常見的再生器官類型是根的形成，水稻、玉米、油菜、棉花、煙草、蜀葵等的愈傷很易形成根。煙草、蜀葵等的愈傷很易形成根。（2）先生芽后生根的方式）先生芽后生根的方式如小麥，一般形成的芽如小麥，一般形成的芽其基部很易形成根，而如先形成根，則往往抑制芽的形成。其基部很易形成根，而如先形成根，則往往抑制芽的形成。(多見多見)（3）在愈傷組織上獨(dú)立生出芽和根的方式）在愈傷組織上獨(dú)立生出芽和根

24、的方式(少見少見)（4）僅有根和芽的分別再生）僅有根和芽的分別再生，形成無芽的根或無根的苗，形成無芽的根或無根的苗愈傷組織愈傷組織芽分化芽分化再生苗再生苗小麥的形態(tài)發(fā)生小麥的形態(tài)發(fā)生試管苗試管苗其它器官發(fā)生方式：其它器官發(fā)生方式：l用組織培養(yǎng)進(jìn)行花器官形成的研究，用組織培養(yǎng)進(jìn)行花器官形成的研究， 用煙草的莖切段作培養(yǎng)物時(shí)，可以直接分化形成花芽，用煙草的莖切段作培養(yǎng)物時(shí)，可以直接分化形成花芽， 用油菜的花莖切段及花器官培養(yǎng)也可見到形成花芽，把這種離體形成的用油菜的花莖切段及花器官培養(yǎng)也可見到形成花芽，把這種離體形成的花芽中的花藥進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，可得花粉胚狀體?；ㄑ恐械幕ㄋ庍M(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，可得花粉胚狀體。

25、l在組織培養(yǎng)中，還有變態(tài)器官形成在組織培養(yǎng)中，還有變態(tài)器官形成,如鱗莖、球莖、塊莖等。如鱗莖、球莖、塊莖等。 外植體外植體愈傷組織愈傷組織芽芽根根再生植株再生植株脫分化脫分化再分化再分化高生長(zhǎng)素高生長(zhǎng)素 高高(生長(zhǎng)素生長(zhǎng)素/細(xì)胞分裂素細(xì)胞分裂素)低低(生長(zhǎng)素生長(zhǎng)素/細(xì)胞分裂素細(xì)胞分裂素)不定芽方式（不定芽方式（adventitious bud）（二）體細(xì)胞胚胎發(fā)生二）體細(xì)胞胚胎發(fā)生(somatic embryogenesis) : 離體培養(yǎng)的植物體離體培養(yǎng)的植物體細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化，形成類似于有性合子胚胎發(fā)生的各個(gè)階段而發(fā)育形細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化，形成類似于有性合子胚胎發(fā)生的各個(gè)階段而發(fā)育形成胚胎狀結(jié)構(gòu)

26、，最后產(chǎn)生新植株的過程。成胚胎狀結(jié)構(gòu)，最后產(chǎn)生新植株的過程。 胚狀體（胚狀體（embryoid）：指在組織培養(yǎng)中，由一個(gè)非合子細(xì)胞）：指在組織培養(yǎng)中，由一個(gè)非合子細(xì)胞(體體細(xì)胞細(xì)胞)，經(jīng)胚胎發(fā)生和胚胎發(fā)育過程（經(jīng)過原胚、球形胚、心形胚、，經(jīng)胚胎發(fā)生和胚胎發(fā)育過程（經(jīng)過原胚、球形胚、心形胚、魚雷胚和子葉胚魚雷胚和子葉胚5個(gè)時(shí)期），形成具有雙極性的胚狀結(jié)構(gòu)。個(gè)時(shí)期），形成具有雙極性的胚狀結(jié)構(gòu)。反足細(xì)胞極核助細(xì)胞卵細(xì)胞子葉胚芽胚柄胚根含成熟胚的種子含成熟胚的種子再生植株再生植株返回合子原胚頂細(xì)胞基細(xì)胞球形期心形期魚雷形期子葉期不對(duì)等分裂l在正常情況下，精卵結(jié)合形成合子，進(jìn)行分裂發(fā)育成胚在正常情況下，

27、精卵結(jié)合形成合子，進(jìn)行分裂發(fā)育成胚胚胎發(fā)生胚胎發(fā)生。l組織和細(xì)胞離體培養(yǎng)形成在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能上類似有性胚的結(jié)構(gòu)被組織和細(xì)胞離體培養(yǎng)形成在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能上類似有性胚的結(jié)構(gòu)被稱為稱為體細(xì)胞胚體細(xì)胞胚。BCDFGHEACitrus clementina Hort. ex Tan. microspore-derived embryoid induction and regeneration(克里曼丁橘克里曼丁橘 )The embryogenic haploid calli were multiplied on MS medium supplemented with 5% sucrose, 0.02

28、 mg/l NAA and 0.8% agar.Eleutherococcus senticosus 刺五加刺五加Mass production of E. senticosus plantlets via embryogenic callus culture. A, Friable embryogenic callus (arrow) formed near the radical portion of primary somatic embryos on MS medium with 4.5m mM 2,4-D after 2 months of culture. Bar=700 m mm

29、. B, Numerous globular somatic embryos formed from embryogenic callus after transfer to medium lacking 2,4-D after 3 weeks of culture. Bar=700m mm. C, Clusters of cotyledonary somatic embryos after 6 weeks. Bar=700 m mm.D, Numerous somatic embryos formed from embryogenic callus. Bar=3 mm. E, Individ

30、ually separated cotyledonary somatic embryos formed from agar medium; note well developed cotyledons. Bar=3 mm. F, Germinating somatic embryos from embryo clusters on MS medium with 3m mM GA3. Bar=700 m mm. G, Small plantlets regenerated from somatic embryos on 1/3 MS medium with 1% sucrose. Bar=15

31、mm.胚狀體與合子胚的比較胚狀體與合子胚的比較合子胚合子胚胚狀體胚狀體質(zhì)量質(zhì)量萌發(fā)率高，質(zhì)量好萌發(fā)率高，質(zhì)量好萌發(fā)率低，質(zhì)量差萌發(fā)率低，質(zhì)量差來源來源受精卵受精卵體細(xì)胞體細(xì)胞胚柄胚柄有，明顯有，明顯即使有也不明顯即使有也不明顯形態(tài)形態(tài)固定，體積相對(duì)較小固定，體積相對(duì)較小復(fù)雜，常有兩個(gè)以上復(fù)雜，常有兩個(gè)以上的子葉的子葉,體積相對(duì)較大體積相對(duì)較大變異率變異率低低高高 體細(xì)胞胚胎發(fā)生體細(xì)胞胚胎發(fā)生1、發(fā)生方式、發(fā)生方式： 直接產(chǎn)生直接產(chǎn)生：指外植體組織中原先就存在的胚性細(xì)胞在進(jìn)入培養(yǎng)之后直接進(jìn)入體細(xì)胞胚：指外植體組織中原先就存在的胚性細(xì)胞在進(jìn)入培養(yǎng)之后直接進(jìn)入體細(xì)胞胚胎發(fā)生而形成胚狀體，這種在培養(yǎng)前

32、就存在的胚性細(xì)胞被稱為胎發(fā)生而形成胚狀體，這種在培養(yǎng)前就存在的胚性細(xì)胞被稱為前決定的胚前決定的胚性細(xì)胞性細(xì)胞（preembryonic determined Ce11s, PEDC） 如如:下胚軸、子葉、幼花序的表皮細(xì)胞中的胚性細(xì)胞可直接產(chǎn)生胚狀體。下胚軸、子葉、幼花序的表皮細(xì)胞中的胚性細(xì)胞可直接產(chǎn)生胚狀體。 柑桔屬的珠心組織柑桔屬的珠心組織 石龍芮的莖胚來自表皮細(xì)胞石龍芮的莖胚來自表皮細(xì)胞 向日葵下胚軸表皮細(xì)胞可培養(yǎng)獲得胚狀體向日葵下胚軸表皮細(xì)胞可培養(yǎng)獲得胚狀體 間接產(chǎn)生間接產(chǎn)生：通過對(duì)外植體中已分化細(xì)胞的發(fā)育方向的重決定過程誘導(dǎo)出胚：通過對(duì)外植體中已分化細(xì)胞的發(fā)育方向的重決定過程誘導(dǎo)出胚性

33、細(xì)胞，然后由這些性細(xì)胞，然后由這些誘導(dǎo)的胚性細(xì)胞誘導(dǎo)的胚性細(xì)胞（IEDC）發(fā)育成胚狀體。要經(jīng)歷愈傷）發(fā)育成胚狀體。要經(jīng)歷愈傷組織培養(yǎng)的中間階段，是普遍的胚狀體產(chǎn)生方式。組織培養(yǎng)的中間階段，是普遍的胚狀體產(chǎn)生方式。 如如:槐樹子葉槐樹子葉,陸地棉陸地棉(Gossypium hirsutum L)下胚軸下胚軸l 陸地棉下胚軸體細(xì)胞胚的發(fā)生 l有些植物既可以直接產(chǎn)生又可間接產(chǎn)生有些植物既可以直接產(chǎn)生又可間接產(chǎn)生 鴨茅鴨茅:取決于外植體的部位取決于外植體的部位 葉原基葉原基:間接產(chǎn)生間接產(chǎn)生 葉尖葉尖:直接產(chǎn)生直接產(chǎn)生 香雪蘭香雪蘭:培養(yǎng)基中激素決定培養(yǎng)基中激素決定(幼葉幼葉)(mg/l) IAA(2

34、)+IBA(3):直接產(chǎn)生直接產(chǎn)生 IAA(2)+IBA(5):間接產(chǎn)生間接產(chǎn)生2、細(xì)胞胚性狀態(tài)的獲得、保持和表達(dá)、細(xì)胞胚性狀態(tài)的獲得、保持和表達(dá) （1）細(xì)胞胚性狀態(tài)的獲得）細(xì)胞胚性狀態(tài)的獲得：胚胎發(fā)生的前題是胚性狀態(tài)的獲得。：胚胎發(fā)生的前題是胚性狀態(tài)的獲得。有性胚胎發(fā)生有性胚胎發(fā)生：花芽分生組織是從已喪失胚胎發(fā)生能力的營(yíng)養(yǎng)組織細(xì)胞分化而來，：花芽分生組織是從已喪失胚胎發(fā)生能力的營(yíng)養(yǎng)組織細(xì)胞分化而來，在花的發(fā)育過程中有些細(xì)胞重新獲得胚性的趨勢(shì)變成孢母細(xì)胞。在花的發(fā)育過程中有些細(xì)胞重新獲得胚性的趨勢(shì)變成孢母細(xì)胞。體細(xì)胞胚胎發(fā)生體細(xì)胞胚胎發(fā)生：在離體培養(yǎng)條件下，植物體其它已脫離胚性狀態(tài)的細(xì)胞可重新

35、獲：在離體培養(yǎng)條件下，植物體其它已脫離胚性狀態(tài)的細(xì)胞可重新獲得這種狀態(tài)得這種狀態(tài). 例如：胡蘿卜韌皮部細(xì)胞在有例如：胡蘿卜韌皮部細(xì)胞在有2,4-D時(shí)經(jīng)脫分化產(chǎn)生愈傷組織，有的愈傷細(xì)胞時(shí)經(jīng)脫分化產(chǎn)生愈傷組織，有的愈傷細(xì)胞可以分化獲得胚性狀態(tài)，在某種程度上象未受精的卵，它們的胚胎發(fā)育程序的可以分化獲得胚性狀態(tài)，在某種程度上象未受精的卵，它們的胚胎發(fā)育程序的表達(dá)受到表達(dá)受到2,4-D的阻礙，的阻礙，2,4-D的去除如同受精一樣的去除如同受精一樣啟動(dòng)胚胎發(fā)生。啟動(dòng)胚胎發(fā)生。（2）細(xì)胞胚性狀態(tài)的保持）細(xì)胞胚性狀態(tài)的保持 細(xì)胞獲得胚性狀態(tài)后就有一定的穩(wěn)定性細(xì)胞獲得胚性狀態(tài)后就有一定的穩(wěn)定性 如如: 胡蘿卜

36、的細(xì)胞品系在維持胡蘿卜的細(xì)胞品系在維持10年的分裂和繼代后仍保持胚胎發(fā)生的潛力，只年的分裂和繼代后仍保持胚胎發(fā)生的潛力，只要去除要去除2,4-D就可形成胚狀體，就可形成胚狀體， 有些植物的表皮層細(xì)胞雖已分化，但仍保持胚性狀態(tài)（石龍芮等），在一有些植物的表皮層細(xì)胞雖已分化，但仍保持胚性狀態(tài)（石龍芮等），在一定條件下直接產(chǎn)生胚狀體，但穩(wěn)定性在不同物種及不同培養(yǎng)體系間差異極大，定條件下直接產(chǎn)生胚狀體，但穩(wěn)定性在不同物種及不同培養(yǎng)體系間差異極大，經(jīng)反復(fù)繼代保存以后，發(fā)生能力下降、喪失。經(jīng)反復(fù)繼代保存以后，發(fā)生能力下降、喪失。（3）細(xì)胞胚性狀態(tài)的表達(dá)）細(xì)胞胚性狀態(tài)的表達(dá) 從形態(tài)上看，從愈傷組織向球形胚過

37、渡的從形態(tài)上看，從愈傷組織向球形胚過渡的標(biāo)志標(biāo)志是細(xì)胞的活躍分裂形成一團(tuán)致是細(xì)胞的活躍分裂形成一團(tuán)致密的沒有密的沒有表皮層表皮層的細(xì)胞團(tuán)結(jié)構(gòu)，可以明顯的與疏松的愈傷組織區(qū)分開的細(xì)胞團(tuán)結(jié)構(gòu)，可以明顯的與疏松的愈傷組織區(qū)分開. 在胡蘿卜細(xì)胞培養(yǎng)中，能夠分化成胚狀體的細(xì)胞中，在胡蘿卜細(xì)胞培養(yǎng)中，能夠分化成胚狀體的細(xì)胞中，新壁的形成常與細(xì)胞的壁相垂直新壁的形成常與細(xì)胞的壁相垂直，使細(xì)胞團(tuán)的生長(zhǎng)顯得有規(guī)律并繼之由其表層細(xì)胞形成胚狀體，它們使細(xì)胞團(tuán)的生長(zhǎng)顯得有規(guī)律并繼之由其表層細(xì)胞形成胚狀體，它們細(xì)胞質(zhì)濃、核大。細(xì)胞質(zhì)濃、核大。 在外觀上，在外觀上，胚狀體胚狀體和不定芽均有光滑、圓形突起的形狀。和不定芽均

38、有光滑、圓形突起的形狀。（4）體細(xì)胞胚的起源）體細(xì)胞胚的起源 胚狀體的形成是來自單個(gè)的胚性細(xì)胞（胚狀體的形成是來自單個(gè)的胚性細(xì)胞（單細(xì)胞起源單細(xì)胞起源）還是一團(tuán)細(xì)胞（）還是一團(tuán)細(xì)胞（多細(xì)胞多細(xì)胞起源起源）是有爭(zhēng)議的。）是有爭(zhēng)議的。l在胡蘿卜、甘蔗、芹菜、玉米中跟蹤觀察認(rèn)為是在胡蘿卜、甘蔗、芹菜、玉米中跟蹤觀察認(rèn)為是單細(xì)胞起源的單細(xì)胞起源的，但在體細(xì)胞，但在體細(xì)胞胚萌發(fā)長(zhǎng)成的植株中，常能看到嵌合現(xiàn)象，這是支持胚萌發(fā)長(zhǎng)成的植株中，常能看到嵌合現(xiàn)象，這是支持多細(xì)胞起源的多細(xì)胞起源的證據(jù)。證據(jù)。l按照按照Williams和和Maheswaran（1986）的觀點(diǎn)，）的觀點(diǎn)，二者不矛盾：取決于胚性細(xì)二者

39、不矛盾：取決于胚性細(xì)胞被誘導(dǎo)時(shí)與它相鄰的細(xì)胞狀態(tài)胞被誘導(dǎo)時(shí)與它相鄰的細(xì)胞狀態(tài)，如果處于不同的生理和發(fā)育狀態(tài)，這個(gè)胚，如果處于不同的生理和發(fā)育狀態(tài)，這個(gè)胚性細(xì)胞單獨(dú)發(fā)育成胚狀體，如果周圍細(xì)胞具相同的胚性發(fā)育趨向，這團(tuán)細(xì)胞性細(xì)胞單獨(dú)發(fā)育成胚狀體，如果周圍細(xì)胞具相同的胚性發(fā)育趨向，這團(tuán)細(xì)胞共同作用，形成一個(gè)球形胚結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為多細(xì)胞起源的。共同作用，形成一個(gè)球形胚結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為多細(xì)胞起源的。 3、特征：、特征：胚狀體胚狀體在組織學(xué)上具備以下和在組織學(xué)上具備以下和不定芽不定芽不同的三個(gè)特征：不同的三個(gè)特征： (1)最根本的特征是具有最根本的特征是具有兩極性兩極性，即在發(fā)育的早期階段，從其方向相反的兩端分，即在發(fā)育的早期階段，從其方向相反的兩端分化出莖端和根端，而不定芽或不定根都為單向極性?；銮o端和根端，而不定芽或不定根都為單向極性。 (2)胚狀體的維管組織與外植體的維管組織無解剖結(jié)構(gòu)上的聯(lián)系，而不定芽或不胚狀體的維管組織與外植體