乳與乳制品微生物檢驗食品中大腸菌群的檢測

1、乳與乳制品微生物檢驗食品中大腸菌群的檢測YLNB 3.21、引用依據(jù)： GB/T4789.3-20032、術(shù)語和定義大腸菌群：指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性 厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。該菌主要來源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標來評價食品的衛(wèi)生質(zhì)量， 推斷食品 中有否污染腸道致病菌的可能。食品中大腸菌群數(shù)系以100ml(g)檢樣內(nèi)大腸菌群最可能數(shù)(MPN 表示。3、 儀器及器材3.1 恒溫培養(yǎng)箱：36 1C；3.2 冰箱：0-4C；3.3 恒溫水浴鍋：46 1C；3.4 天平；3.5 顯微鏡；3.6 均質(zhì)器或乳缽；3.7滅菌平皿：直徑 90mm3.8滅菌試管：18X180 和 20

2、X200；3.9 滅菌吸管：1 ml 和 10 ml ；3.10 滅菌廣口瓶或三角燒瓶：容量為 500ml ；3.11 滅菌玻璃珠：直徑約 5mm3.12 載玻片；3.13 酒精燈；3.14 試管架；3.15 滅菌刀、剪子、滅菌鑷子等4、培養(yǎng)基和試劑4.1 乳糖膽鹽發(fā)酵管；4.2 伊紅美蘭瓊脂平板；4.3 乳糖發(fā)酵管；4.4 生理鹽水；4.5 革蘭氏染色液。5、檢驗程序6、方法6.1 檢樣稀釋6.1.1 以無菌操作將檢樣 25ml （或 g）放于裝有 225ml 滅菌 生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(nèi)（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠）或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨做成1: 10 的均勻稀釋液。固體

3、檢樣最好用均質(zhì)器， 以 800010000r/min 的速度處理 1min，做成 1: 10 的均勻稀釋液。6.1.2 用 1ml 滅菌吸管吸取 1: 10 稀釋液 1ml,注入含有 9ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，振搖試管混勻，做成1: 100 的稀釋液。6.1.3 另取 1ml 滅菌吸管，按上條操作依次做10 倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用一支1ml 滅菌吸管。6.1.4 根據(jù)食品衛(wèi)生標準要求或?qū)z樣污染情況的估計，選 擇三個稀釋度，每個稀釋度接種3 管。6.2 乳糖發(fā)酵實驗：（通常所說的假定試驗：其目的在于檢查樣品中有無發(fā)酵產(chǎn)生氣體的細菌）將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接

4、種量在 1ml 以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管，1ml 及 1ml 以下者，用單料乳糖膽 鹽發(fā)酵管。每一稀釋度接種3 管，置 36 1C培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng) 24 2h ,如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)氣者，則按下列程序進行。6.3 分離培養(yǎng)：（目的在于檢查乳糖初發(fā)酵試驗呈陽性反應(yīng)的試管內(nèi)，有無需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌存在）將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美蘭瓊脂平板上，置36 1C培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng) 1824h，然后取出，觀察菌落形態(tài)，并做革蘭氏染色和證實實驗。6.4 證實實驗（復(fù)發(fā)酵實驗）：（目的在于證明從乳糖初發(fā) 酵試驗呈陽性反應(yīng)的試管內(nèi)分離到的革蘭氏陰性無芽孢

5、桿 菌，確能發(fā)酵乳糖產(chǎn)生氣體）在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落12 個進行革蘭氏染色，同時接種乳糖發(fā)酵管，置36 1C培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng) 24 2h，觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖管產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的 無芽孢桿菌，即可報告為大腸菌群陰性。6.5 報告根據(jù)證實為大腸菌群陽性的管數(shù)查MPN 僉索表，報告每 100ml（g）大腸菌群的最可能數(shù)（見表 1）。7、注意事項7.1 初發(fā)酵和證實試驗乳糖發(fā)酵試驗不是純菌的發(fā)酵試驗，所以初發(fā)酵陽性并 不代表大腸菌群陽性，因此，必須作進一步證實試驗。7.2 產(chǎn)氣量與倒管試驗表明，大腸菌群的產(chǎn)氣量與大腸菌群的檢出率呈正 相關(guān)系。但也隨樣品的種類而變。大腸菌群的產(chǎn)氣量多者

6、可 充滿整個倒氣管，少者可產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡。如果對 產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵管如有疑問，可用手輕輕打動試管 如有氣泡沿管壁上浮，即應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生，而應(yīng)作進 一步試驗。另外，產(chǎn)氣量與倒氣管有一定的關(guān)系，倒氣管口不完整，有利于氣體的進入；管口周圍有沉淀等物質(zhì)能影響 氣體的進入。7.3 挑選菌落在平板呈現(xiàn)紫黑色，有或無金屬光澤，檢出率最高；粉紅色、粉色檢出率最低。另外，只挑選一個菌落影響大腸菌群的檢出率，當(dāng)菌落不典型時，應(yīng)挑取23 個菌落作證實試驗，以免出現(xiàn)假陰性。7.4 抑菌劑大腸菌群檢驗中常用的抑菌劑有膽鹽、十二烷基硫酸鈉、洗衣粉、煌綠、龍膽紫、孔雀綠等。膽鹽的主要作用是 抑制其它雜菌，特別是革蘭氏陽性菌的生長。有些抑菌劑用 量甚微，稱量時稍有誤差，即可對抑菌作用產(chǎn)生影響，因此 抑菌劑的添加應(yīng)嚴格按照標準方法添加。7.5 指示劑溴甲酚紫屬于酸堿指示劑， 其 pH 變色范圍為：黃 5.26.8 紫，當(dāng)料管中培養(yǎng)基(pH=7.4 0.1 )的顏色由紫色變?yōu)?黃色時，證明培養(yǎng)基中有酸性物質(zhì)產(chǎn)生，此時培養(yǎng)基的PH24000注： 本表采用 3 個稀釋度 【0.1g(mL)、 0.01 g(mL)、 0.001 g(mL)】 、每個稀釋度接種 3 管。表內(nèi)所列檢樣量如改用