型PCR熒光分析儀PPT課件

1、1890型PCR熒光分析儀 引見及運用實時熒光定量PCR的運用 臨床方面的運用臨床方面的運用 疾病的臨床早期診疾病的臨床早期診斷斷 建立病原體病分子建立病原體病分子診斷規(guī)范診斷規(guī)范 療效考評療效考評 指點制定感染性疾指點制定感染性疾病合理治療方案病合理治療方案 了解感染性疾病病了解感染性疾病病人用藥后病情的變化人用藥后病情的變化情況情況 醫(yī)院、血站及防疫醫(yī)院、血站及防疫站確實診站確實診 新藥研討中藥物的新藥研討中藥物的作用效果作用效果 研討研討ElisaElisa方法的方法的漏檢率漏檢率 病毒性疾病中病毒病毒性疾病中病毒的耐藥性變異株的測的耐藥性變異株的測定，為疾病治療進(jìn)展定，為疾病治療進(jìn)展指

2、點指點 遺傳病診斷中的運用遺傳病診斷中的運用 等位基因檢測等位基因檢測 多基因遺傳病的突多基因遺傳病的突變檢測變檢測 基因表達(dá)異常所致基因表達(dá)異常所致遺傳病檢測遺傳病檢測 在腫瘤診斷中的運用在腫瘤診斷中的運用 腫瘤相關(guān)基因表達(dá)腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的檢測的檢測 腫瘤標(biāo)志物肽類腫瘤標(biāo)志物肽類激素和酶激素和酶 腫瘤耐藥基因腫瘤耐藥基因MDRMDR 何謂PCR ?聚合酶鏈反響(Polymerase Chain Reaction)簡稱，是一項在短時間內(nèi)大量擴(kuò)增特定的片段的分子生物學(xué)技術(shù)。 試劑的定量原理：TaqmanTaqman水解探針定量水解探針定量RocheRoche雜交探針定量雜交探針定量分子信標(biāo)定量

3、分子信標(biāo)定量SYBR Green SYBR Green 染料定量染料定量雜交探針雜交探針分子信標(biāo)分子信標(biāo)熒光能量熒光能量共振轉(zhuǎn)移共振轉(zhuǎn)移TaqmanTaqman探針探針 Taqman Taqman探針、雜交探針、分子信標(biāo)都是經(jīng)過熒光能量共振轉(zhuǎn)移探針、雜交探針、分子信標(biāo)都是經(jīng)過熒光能量共振轉(zhuǎn)移直接或間接的產(chǎn)生特定波長的熒光，使儀器能檢測到直接或間接的產(chǎn)生特定波長的熒光，使儀器能檢測到PCR的開展史這項技術(shù)的發(fā)明人是Kary Mullis。年，在一家生物高技術(shù) 公司任務(wù)的Mullis著手處理用簡單的方法鑒定某一段 的技術(shù)問題，有一天晚上他驅(qū)車在北部加州號高速公路上，靈機(jī)一動想到了一個實踐上可以無限

4、擴(kuò)增某段的簡一方法，即。 在年的一次學(xué)術(shù)會議上，此方法初次被引見，在分子生物科學(xué)家 中也引起了劇烈的反響。給了Mullis一萬美圓的獎金，隨后 把這項技術(shù)的專利以三億美圓的價錢轉(zhuǎn)讓給另一家生物高技術(shù)公司。在短 短的幾年內(nèi)，迅速成為分子生物學(xué)的一項常規(guī)手段，并得到了廣泛 的實踐運用，被許多科學(xué)家視為近十年來分子生物學(xué)領(lǐng)域最重要的一項技 術(shù)突破。年，Mullis因此獲得諾貝爾化學(xué)獎。 PCR原理和方法: (一) 眾所周知，是由四種堿基按互補配對原那么即腺嘌呤對胸腺 嘧啶，鳥嘌呤對胞嘧啶組成的螺旋雙鏈。在細(xì)胞內(nèi)，復(fù)制 時，解螺旋酶首先解開雙鏈讓它變成單鏈做為模板，然后，另一種酶-聚合酶合成一小段引物

5、結(jié)合到模板上，最 后，合成酶以這段引物為起點，合成與模板配對的新鏈。即是在體外模擬復(fù)制的過程，它用加熱的方法讓所研討的片段變性變成兩條單鏈，人工合成兩個引物讓它們結(jié)合到模板的兩端，聚合酶即可以大量復(fù)制該模板。 假定我們要研討的雙鏈兩端的序列是： TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA 在之前，我們首先人工合成兩段有堿基的引物，可以分別與上下兩條鏈的一端配對，比如一條是為與模板可以區(qū)別，以小 寫表示:ataagcccgaaaggttcgt

6、t，另一條就是tttacggatcggcaacctat。 把這兩段引物和模板、聚合酶、底物四種脫氧核苷混合 在一同，我們就可以開場做了。 PCR原理和方法: (二) 第一步叫“變性，把樣品加熱到攝氏度一到數(shù)分鐘，讓 模板變性變成單鏈。第二步叫“退火，讓樣品的溫度下降到攝氏度一到數(shù)分鐘，引物就可以結(jié)合到模板上去。TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT ataagcccgaaaggttcgtt tatccaacggctaggcattt ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA 第三

7、步叫“延伸，讓樣品的溫度上升到攝氏度一到數(shù)分鐘，聚合酶就可以從引物開場用底物復(fù)制出新鏈。 TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT ataagcccgaaaggttcgttGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAATATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCtatccaacggctaggcattt ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA 這樣經(jīng)過三步一個循環(huán)，一條雙鏈就變成了兩條，再來一個循環(huán)，就變成了四條在一個由計算機(jī)控制的循環(huán)加熱器上經(jīng)過三十個

8、循環(huán)，就可以把原來的樣品準(zhǔn)確地擴(kuò)增了的次方倍，而這只需求兩三個小時。影響PCR特異性的要素 退火步驟的嚴(yán)厲性：提高退火溫度可以減少不匹配的雜交，從而退火步驟的嚴(yán)厲性：提高退火溫度可以減少不匹配的雜交，從而提高特異性。提高特異性。減短退火時間及延伸時間可以減少錯誤引發(fā)及錯誤延伸。減短退火時間及延伸時間可以減少錯誤引發(fā)及錯誤延伸。 引物二聚體是最常見的副產(chǎn)品，降低引物及酶的濃度也可以減少引物二聚體是最常見的副產(chǎn)品，降低引物及酶的濃度也可以減少錯誤引發(fā)，尤其是引物的二聚化。錯誤引發(fā)，尤其是引物的二聚化。 改動改動MgCl2(MgCl2(有時有時KCl)KCl)濃度可以改良特異性，這能夠是提高反響嚴(yán)濃

9、度可以改良特異性，這能夠是提高反響嚴(yán)厲性或者對厲性或者對TaqTaq酶的直接作用。酶的直接作用。 模板中假設(shè)存在次級構(gòu)造，例如待擴(kuò)增的片段易自行構(gòu)成發(fā)夾構(gòu)模板中假設(shè)存在次級構(gòu)造，例如待擴(kuò)增的片段易自行構(gòu)成發(fā)夾構(gòu)造時，可在造時，可在PCRPCR混合物中的混合物中的4 4dNTPsdNTPs中參與中參與7-7-脫氮脫氮-2-2- -脫氧鳥苷脫氧鳥苷- -5 5- -三磷酸三磷酸7-deaza-27-deaza-2-deoxyguanosine-5-deoxyguanosine-5-trihosphate-trihosphate(de7GTP)(de7GTP)。用。用de7GTPde7GTP與與dG

10、TPdGTP比例為比例為3 3：1 1的混合物的混合物150mol/l 150mol/l de7GTP +50mol/L dGTPde7GTP +50mol/L dGTP替代替代200mol/l dGTP200mol/l dGTP，那么可阻非，那么可阻非特異性產(chǎn)物的生成。特異性產(chǎn)物的生成。 擴(kuò)增反響可以無窮進(jìn)展下去嗎？ 答：不可以。由于經(jīng)過一定的循環(huán)周期后需擴(kuò)增的片段不再按指數(shù)增多而逐漸進(jìn) 入平坡，進(jìn)入平坡的循環(huán)次數(shù)，取決于起始時存在的模板拷貝數(shù)以及合成的DNA總量。 所謂平坡就是批PCR循環(huán)的后期，合成產(chǎn)物達(dá)0.31pmol時，由于產(chǎn)物的堆積，使原 來以指數(shù)添加的速率變成平坦的曲線。呵斥PC

11、R進(jìn)入平坡的緣由有： 引物和dNTP等耗費終了 Taq酶失活 底物過剩 非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的競爭 退火時產(chǎn)物的單鏈本人締合 變性在高濃度產(chǎn)物條件下，產(chǎn)物解鏈不完全，以及最終產(chǎn)物的阻化作用焦磷酸化，雙鏈DNA。 總而言之，總而言之，PCRPCR的條件是隨系統(tǒng)的的條件是隨系統(tǒng)的而異的，并無一致的最正確條件，先而異的，并無一致的最正確條件，先選用通用的條件擴(kuò)增，然后稍稍改動選用通用的條件擴(kuò)增，然后稍稍改動各參數(shù)，可以到達(dá)優(yōu)化，以獲得優(yōu)良各參數(shù)，可以到達(dá)優(yōu)化，以獲得優(yōu)良的特異性和產(chǎn)率。的特異性和產(chǎn)率。實時熒光定量實時熒光定量PCR PCR 的的CtCt值值 由圖我們也可以看出，在由圖我們也可以看出，在C

12、tCt值所在處反復(fù)性驚人的值所在處反復(fù)性驚人的好。好。 Ct Ct值的含義是：值的含義是：每個反響管內(nèi)的熒每個反響管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所閱歷的循域值時所閱歷的循環(huán)數(shù)。由于所設(shè)閾環(huán)數(shù)。由于所設(shè)閾值都很低，所以值都很低，所以CtCt值分析實踐上就是值分析實踐上就是低濃度的熒光值分低濃度的熒光值分析。由于是低濃度，析。由于是低濃度，影響要素小，誤差影響要素小，誤差沒被放大，所以具沒被放大，所以具有良好的重現(xiàn)性有良好的重現(xiàn)性 Ct Ct值，值，C C代表代表CycleCycle，t t代表代表thresholdthreshold。 由圖可以看到當(dāng)擴(kuò)增越靠后定量的反復(fù)性就越差。

13、主要是由于熒光定量技術(shù)要求在低濃度壞境。由于熒光檢測定量原理是在忽略分子間相互作用的情況下建立的。假設(shè)分子濃度高了，影響作用很復(fù)雜，而PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是高濃度的，因此反復(fù)性變差也很容易了解。由于擴(kuò)增末期，擴(kuò)增效率能夠由于大量的靶序列而產(chǎn)生不可控的影響。 儀器的Ct值定量原理 固定循環(huán)數(shù)后，熒光信號與模板數(shù)成正比，但當(dāng)固定熒光信號值后，模板數(shù)就與循環(huán)數(shù)成反比。每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。只需獲得未知樣品的Ct值，即可從規(guī)范曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。橫坐標(biāo)代表起始橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)拷貝數(shù)的對數(shù)縱縱坐坐標(biāo)標(biāo)代代CtCt值值利用知起始

14、拷貝數(shù)的規(guī)利用知起始拷貝數(shù)的規(guī)范品可作出規(guī)范曲線范品可作出規(guī)范曲線1890型PCR熒光分析儀的特點 高速的加熱降溫循環(huán)系高速的加熱降溫循環(huán)系統(tǒng)統(tǒng)采用長壽命的采用長壽命的LEDLED激發(fā)光激發(fā)光源源可對可對PCRPCR擴(kuò)增全過程進(jìn)展擴(kuò)增全過程進(jìn)展實時動態(tài)監(jiān)測實時動態(tài)監(jiān)測無需開啟無需開啟PCRPCR反響管，可反響管，可防止在防止在PCRPCR期間及期間及PCRPCR之之后產(chǎn)物污染，確保結(jié)果后產(chǎn)物污染，確保結(jié)果準(zhǔn)確準(zhǔn)確可用三種不同報告染料可用三種不同報告染料同時用于一個樣品，在同時用于一個樣品，在單一反響中獲得更多信單一反響中獲得更多信息息全中文界面，靈敏的程全中文界面，靈敏的程序設(shè)定、全面的分析和

15、序設(shè)定、全面的分析和報告功能，全部參數(shù)可報告功能，全部參數(shù)可儲存儲存可打印多個或單個樣本可打印多個或單個樣本報告報告儀器主要技術(shù)規(guī)格 樣本數(shù)： 32 反 響 管 光 學(xué) 玻 璃 管 長 ： 35mm 容積反響體積 10-20ul 溫度范圍： 40-98 溫度控制： 1/S-10/S 激發(fā)光波長： 470nmLED 發(fā)射光波長： 530，640，710nm 檢測靈敏度： 可在一個基因組中檢測單拷貝 軟件操作系統(tǒng)： Win2000 輸 入 電 源 / 功 率 ： A C 2 2 0 V 50HZ/800VA儀器任務(wù)原理 一 儀器任務(wù)原理 二 圖一蓋中的加熱器在計算機(jī)控制下向熱室中交圖一蓋中的加熱器

16、在計算機(jī)控制下向熱室中交 替注入熱氣和環(huán)境空氣，熱室中溫度由風(fēng)扇電機(jī)替注入熱氣和環(huán)境空氣，熱室中溫度由風(fēng)扇電機(jī) 攪勻，由于空氣無有效質(zhì)量，熱室可以迅速到達(dá)攪勻，由于空氣無有效質(zhì)量，熱室可以迅速到達(dá) 設(shè)置溫度，由此進(jìn)展設(shè)置溫度，由此進(jìn)展PCR的溫度循環(huán)。的溫度循環(huán)。32個樣品個樣品在周向馬達(dá)的帶動下逐一經(jīng)過信號采集的光學(xué)系在周向馬達(dá)的帶動下逐一經(jīng)過信號采集的光學(xué)系 統(tǒng)，為采樣的準(zhǔn)確定位光學(xué)構(gòu)造由絲桿馬達(dá)進(jìn)展統(tǒng)，為采樣的準(zhǔn)確定位光學(xué)構(gòu)造由絲桿馬達(dá)進(jìn)展 微調(diào)。由長壽命的微調(diào)。由長壽命的LED光源光源(470nm)激發(fā)毛細(xì)激發(fā)毛細(xì) 管中的熒光，該熒光經(jīng)過一組復(fù)合濾鏡和透鏡分管中的熒光，該熒光經(jīng)過一組復(fù)

17、合濾鏡和透鏡分別同時到別同時到3個接納器上個接納器上(520nm,640nm,710nm)完成了儀器的實時采樣。完成了儀器的實時采樣。 強(qiáng)大的軟件功能強(qiáng)大的軟件功能 參數(shù)設(shè)置功能包括溫度、時間、循環(huán)數(shù)、參數(shù)設(shè)置功能包括溫度、時間、循環(huán)數(shù)、 升降溫速率、檢測通道選擇升降溫速率、檢測通道選擇樣本資料記錄功能樣本資料記錄功能文件運轉(zhuǎn)顯示功能文件運轉(zhuǎn)顯示功能PCRPCR熱循環(huán)數(shù)據(jù)顯示、熒熱循環(huán)數(shù)據(jù)顯示、熒 光檢測數(shù)據(jù)顯示光檢測數(shù)據(jù)顯示檢測數(shù)據(jù)分析功能檢測數(shù)據(jù)分析功能分析結(jié)果輸出功能分析結(jié)果輸出功能缺點維護(hù)和報警功能缺點維護(hù)和報警功能先進(jìn)的光路系統(tǒng)先進(jìn)的光路系統(tǒng) 選用長壽命選用長壽命LEDLED激發(fā)激發(fā)

18、, ,無需預(yù)熱，無需校正無需預(yù)熱，無需校正采用了先進(jìn)的非球面鏡設(shè)計，提升了儀器的光學(xué)性能，采用了先進(jìn)的非球面鏡設(shè)計，提升了儀器的光學(xué)性能，縮短了光程，使儀器更小巧縮短了光程，使儀器更小巧優(yōu)質(zhì)的濾光片，硬膜鍍膜技術(shù)，窄帶低背景高透過率優(yōu)質(zhì)的濾光片，硬膜鍍膜技術(shù)，窄帶低背景高透過率不霉變不霉變實時三色熒光檢測，盡善盡美實時三色熒光檢測，盡善盡美傳統(tǒng)96孔板和離心毛細(xì)管比較 毛細(xì)管 96孔板標(biāo)本量小，耗材本錢稍高 標(biāo)本量大，耗材本錢低由于離心，每個樣品孔間溫度 由于加熱模塊的邊緣效應(yīng)，每個 均勻一性好 樣品孔間溫度存在差別加熱介質(zhì)空氣與反響體系無縫 96孔板反響面積大，故升降溫 接觸，接觸面積大，故

19、升降 速度慢 溫速度快 一個40個循環(huán)的實驗只需30-45 一個40個循環(huán)的實驗需求2小時 分鐘 光源與檢測器對每個樣品來說 每個樣品孔間隔光源和檢測器 是等間隔的，減少了系統(tǒng)誤 光程不同，能夠?qū)Y(jié)果產(chǎn)生 差 影響 由于定量由于定量PCR必需借助于樣本和規(guī)范必需借助于樣本和規(guī)范品之間的對比實現(xiàn)定量，旋轉(zhuǎn)的樣品架很品之間的對比實現(xiàn)定量，旋轉(zhuǎn)的樣品架很好地處理了樣品孔間的均一性，最大程度好地處理了樣品孔間的均一性，最大程度的保證了規(guī)范曲線與樣品之間條件的一致的保證了規(guī)范曲線與樣品之間條件的一致性，防止了微小差別被指數(shù)級發(fā)大。性，防止了微小差別被指數(shù)級發(fā)大。優(yōu)良的靈敏度 廣大的線性動力學(xué)范圍 儀器能

20、在7個數(shù)量級的范圍內(nèi)得到非常好的線性結(jié)果。相關(guān)系數(shù)r可達(dá)3個9。且有優(yōu)良的靈敏度和極佳的反復(fù)性 友好方便的操作界面友好方便的操作界面 方便的樣品編輯界面方便的樣品編輯界面 方便的溫度循環(huán)設(shè)置界面方便的溫度循環(huán)設(shè)置界面 一目了然的運轉(zhuǎn)界面 時實反響了當(dāng)前樣品室的溫度曲線。 指示當(dāng)前溫度曲線位置的溫度，循環(huán)數(shù)及第幾程序段。 時實反響了當(dāng)前的熒光信號 方便的數(shù)據(jù)處置界面 兩種分析方法：兩種分析方法：方差法方差法最小二乘法最小二乘法 規(guī)范曲線擬合規(guī)范曲線擬合 ：自動規(guī)范曲線擬合自動規(guī)范曲線擬合自動計算相關(guān)系數(shù)自動計算相關(guān)系數(shù) 個人信息輸入和打印報告格式病人檢驗報告病人檢驗報告綜合檢測報告綜合檢測報告1890型PCR與國內(nèi)外儀器比較型號型號1890Light- CycleMJ Op