克隆基因的誘變

1、克隆基因的克隆基因的誘變誘變誘變育種:以誘發(fā)基因突變?yōu)槟康囊环N育種方法。 1、缺失誘變：用可從凹進的3端沿3到5端方向移去一條鏈的外切核酸酶進行單向缺失，再用一種單鏈特異性異性核酸酶制成平末端用于連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生具缺失的克隆。2、定點誘變：在一個特定位點改變一個或幾個核苷酸通常需要將誘變引物與模板退火，再用DNA聚合酶合成互補鏈。3、PCR誘變：用正向與反向突變的引物及可結(jié)合常用載體序列的另一對引物，進行兩組PCR反應來分別擴增待突變的DNA的5與3部分。然后將這兩組PCR產(chǎn)物混合，并進行只用外部引物的另一PCR。這些產(chǎn)物中部分再通過亞克隆代替最初步分子中要突變的區(qū)域 缺失誘變 S1核酸酶核酸

2、酶 ：來源于稻谷曲霉(Aspergillusoryzae)，是一種高度單鏈特異的核酸內(nèi)切酶，在最適的酶催反應條件下，降解單鏈DNA或RNA，產(chǎn)生帶5，-磷酸的單核苷酸或寡核苷酸。 S1核酸酶的單鏈水解功能可以作用于雙鏈核酸分子的單鏈區(qū)，并從單鏈部位切斷核酸分子，而且這種單鏈區(qū)可以小到只有一個堿基對的程度。由于具備這種功能，使S1核酸酶在分析核酸雜交分子(RNA-DNA)的結(jié)構(gòu)、給RNA分子定位、測定真核基因中間隔子序列的位置、去除去除DNADNA片段中突出的單鏈尾片段中突出的單鏈尾，以及打開在雙鏈cDNA合成期間形成的發(fā)夾環(huán)。綠豆核酸酶綠豆核酸酶 ：來源于綠豆芽的核酸酶。將單鏈DNA降解為5端

3、帶磷酸基團的單核苷酸或寡核苷酸。雙鏈DNA、雙鏈RNA及DNA與RNa雜交體對此酶相對不敏感。但此酶大量時也能將雙鏈核酸完全降解。其物理性質(zhì)及催化性質(zhì)與S1核酸酶相似，但綠豆核酸酶的作用比S1酶更溫和。用于使DNA突出端變?yōu)槠蕉恕?BAL 31 的主要活性為3“外切核酸酶活性。它可從線狀DNA兩條鏈的3”端去除單核苷酸。BAL 31還是一個內(nèi)切核酸酶，因此利用其3“外切酶活性連續(xù)去除3”端單核苷酸后形成的單鏈DNA，可被BAL 31的內(nèi)切酶活性所降解。 缺失誘變環(huán)狀D N A分子 中較小片段的缺 失1、環(huán)狀D NA的某一位點2、只有一個切點且切點位于該位 點附近的限制酶將環(huán)狀DNA切成線狀分子

4、3、外切核酸酶將線 狀D N A 的沿3到5端方向移去一條鏈4、用一種單鏈特異性異性核酸酶（S1或綠豆核酸酶）或綠豆核酸酶）制成平末端用于連接5、用連接酶將切割后的線狀D N A連接環(huán)化6、經(jīng)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生具缺失的克隆 無論采用哪種內(nèi)切酶,都可以通過控制 反應酶的濃度、反應時間、反應溫度和其它 條件控制切割的程度。利用這 種方 法,可 以在 DNA 上制造 20 一20 0 0堿基對的缺失。定點誘變1、將一段合適的DN A片段克隆到 M13載體上,形成重組噬菌體 M13。2、從重組M13內(nèi)制備單鏈的目的DNA3、設計并合成包含靶堿基的寡聚核苷酸4、將寡聚核昔酸與目的D N A雜交5、用 DNA 聚合

5、酶延伸寡聚核昔酸,完成互補鏈的合成6、傳染敏感的寄主細菌細 胞7、篩選帶有突變位點的噬 菌體8、從已突變了的重組噬 菌體內(nèi)分離單鏈DNA9、對分離到的單鏈DNA進行 堿基序列分析再證實突變的可靠性。10、從復制型的雙鏈重 組 M13內(nèi)分離已突變了的D NA 片段11、用 突變的DNA 片段 代換 野生型D N A的相應片段 滾環(huán)式復制(rolling circle replication)是噬菌體中常見的DNA復制方式。滾環(huán)式復制的一個特點是以一條環(huán)狀單鏈DNA為模板，進行新的DNA環(huán)狀分子合成。噬菌體的雙鏈DNA環(huán)狀分子先在一條單鏈的復制起點上產(chǎn)生一個切口(nick)，然后以另一條單鏈為模板不斷地合成新的單鏈。釋放出的新合成的單鏈或是先復制成雙鏈