Tan第七章 基因操作的基本技術(shù)

1、4/6/2022 5:21 PM歡迎同學(xué)們聽課！Slide 1本課程內(nèi)容本課程內(nèi)容 第一章第一章 緒論緒論 第二章第二章 基因克隆的工具酶基因克隆的工具酶 第三章第三章 基因工程的載體基因工程的載體 第四章第四章 目的基因的制備目的基因的制備 第五章第五章 目的基因?qū)牒椭亟M子的篩選目的基因?qū)牒椭亟M子的篩選 第六章第六章 外源基因的表達(dá)外源基因的表達(dá) 第七章第七章 基因操作的基本技術(shù)基因操作的基本技術(shù) 第八章第八章 植物基因工程及應(yīng)用植物基因工程及應(yīng)用 第九章第九章 動物基因工程及應(yīng)用動物基因工程及應(yīng)用 第十章第十章 醫(yī)學(xué)基因工程及應(yīng)用醫(yī)學(xué)基因工程及應(yīng)用4/6/2022 5:21 PM歡迎同

2、學(xué)們聽課！Slide 2第七章第七章 基因操作的基本技術(shù)基因操作的基本技術(shù)7.1 DNA制備技術(shù)制備技術(shù) p257.2 DNA凝膠電泳技術(shù)凝膠電泳技術(shù) p687.3 PCR技術(shù)技術(shù) p54; p1957.4 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù) p2977.5 探針標(biāo)記技術(shù)探針標(biāo)記技術(shù) p3067.6 DNA測序技術(shù)測序技術(shù) p3264/6/2022 5:21 PM歡迎同學(xué)們聽課！Slide 37.1 DNA制備技術(shù)制備技術(shù)7.1.1 DNA的來源的來源7.1.2 DNA制備基本步驟制備基本步驟7.1.3 DNA制備基本方法制備基本方法4/6/2022 5:21 PM歡迎同學(xué)們聽課！Slide 47.1.

3、1 DNA的來源的來源 染色體染色體DNA 病毒（噬菌體病毒（噬菌體）DNA 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA 線粒體和葉綠體線粒體和葉綠體DNA4/6/2022 5:21 PM歡迎同學(xué)們聽課！Slide 57.1.2 DNA制備基本步驟制備基本步驟 準(zhǔn)備材料準(zhǔn)備材料 裂解細(xì)胞裂解細(xì)胞 分離、提取分離、提取DNA 純化、濃縮純化、濃縮4/6/2022 5:21 PM歡迎同學(xué)們聽課！Slide 67.1.3 DNA制備基本方法制備基本方法 細(xì)菌質(zhì)粒細(xì)菌質(zhì)粒DNA的制備方法的制備方法 CTAB法法4/6/2022 5:21 PM歡迎同學(xué)們聽課！Slide 7細(xì)菌質(zhì)粒細(xì)菌質(zhì)粒DNA的提取的提取1）堿裂解法堿裂解法:

4、細(xì)菌染色體細(xì)菌染色體DNA和質(zhì)粒和質(zhì)粒DNA在堿性條件在堿性條件下均會發(fā)生變性，由于質(zhì)粒下均會發(fā)生變性，由于質(zhì)粒DNA分子比染色體分子比染色體DNA的分子小得多，所以當(dāng)溶液的的分子小得多，所以當(dāng)溶液的pH成為中性時，質(zhì)粒成為中性時，質(zhì)粒DNA容易復(fù)性，染色體容易復(fù)性，染色體DNA由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜、分子量由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜、分子量大故不能復(fù)性，而與細(xì)胞碎片、變性蛋白、多糖等大故不能復(fù)性，而與細(xì)胞碎片、變性蛋白、多糖等形成復(fù)合物一同沉淀。形成復(fù)合物一同沉淀。2）熱變性法熱變性法: 原理與堿裂解法類似，其變性手段為加原理與堿裂解法類似，其變性手段為加熱變性。但該法缺點(diǎn)為多糖污染較多。熱變性。但該法缺點(diǎn)為多糖污

5、染較多。3）兩法在變性與復(fù)性步驟均需操作溫和，以免染色體）兩法在變性與復(fù)性步驟均需操作溫和，以免染色體DNA斷裂成為與質(zhì)粒斷裂成為與質(zhì)粒DNA分子大小差不多的片段分分子大小差不多的片段分子，從而導(dǎo)致染色體子，從而導(dǎo)致染色體DNA污染。污染。4/6/2022 5:21 PM歡迎同學(xué)們聽課！Slide 8CTAB法法 基本原理基本原理: 表面活性劑表面活性劑（hexadecyltrimethylammonium bromide, CTAB ）可使膜蛋白、核蛋白變性，）可使膜蛋白、核蛋白變性，DNA釋放到溶液中。在高鹽（釋放到溶液中。在高鹽（1M NaCl）條件下，）條件下， DNA 與與CTAB結(jié)

6、合溶于水中，當(dāng)溶液中鹽濃度降低時結(jié)合溶于水中，當(dāng)溶液中鹽濃度降低時（0.5M NaCl），），DNA與與CTAB復(fù)合物會沉淀下來。復(fù)合物會沉淀下來。 該法獲得的該法獲得的DNA純度較高，多糖物質(zhì)污染較少。但純度較高，多糖物質(zhì)污染較少。但產(chǎn)率可能較低。產(chǎn)率可能較低。 在加入液氮研磨樣品至加入抽提液抽提在加入液氮研磨樣品至加入抽提液抽提DNA這段時這段時間內(nèi)的操作宜迅速，防止解凍后細(xì)胞內(nèi)釋放的間內(nèi)的操作宜迅速，防止解凍后細(xì)胞內(nèi)釋放的DNase降解降解DNA。4/6/2022 5:21 PM歡迎同學(xué)們聽課！Slide 97.2 凝膠電泳技術(shù)凝膠電泳技術(shù)7.2.1 凝膠電泳技術(shù)的原理凝膠電泳技術(shù)的原理

7、7.2.2 凝膠電泳的類型凝膠電泳的類型7.2.3 瓊脂糖凝膠電泳及其參數(shù)瓊脂糖凝膠電泳及其參數(shù)7.2.4 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳7.2.5 脈沖電場凝膠電泳脈沖電場凝膠電泳4/6/2022 5:21 PM歡迎同學(xué)們聽課！Slide 107.2.1 凝膠電泳技術(shù)的原理凝膠電泳技術(shù)的原理 DNA在中性或偏堿性的條件下在中性或偏堿性的條件下帶負(fù)電帶負(fù)電，在電，在電泳過程中處于負(fù)極的泳過程中處于負(fù)極的DNA通過凝膠分子篩向通過凝膠分子篩向正極移動。遷移速度受電場強(qiáng)度、所帶電荷正極移動。遷移速度受電場強(qiáng)度、所帶電荷數(shù)量及分子大小、構(gòu)型等因素的影響，與數(shù)量及分子大小、構(gòu)型等因素

8、的影響，與DNA分子中的堿基組成和順序無關(guān)。分子中的堿基組成和順序無關(guān)。 電 泳 結(jié) 束 后 ， 用 溴 化 乙 錠 （電 泳 結(jié) 束 后 ， 用 溴 化 乙 錠 （ e t h i d i u m bromide，EB）染色，可觀察到）染色，可觀察到DNA在凝膠在凝膠中所處位置。中所處位置。4/6/2022 5:21 PM歡迎同學(xué)們聽課！Slide 117.2.2 凝膠電泳的類型凝膠電泳的類型 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 脈沖場凝膠電泳脈沖場凝膠電泳4/6/2022 5:21 PM歡迎同學(xué)們聽課！Slide 127.2.3 瓊脂糖凝膠電泳及其參數(shù)瓊脂糖

9、凝膠電泳及其參數(shù) 瓊脂糖瓊脂糖：從海藻中提取的線性多聚體大分子。從海藻中提取的線性多聚體大分子。在沸水中溶解，在沸水中溶解，40C左右開始凝固，其單體分左右開始凝固，其單體分子互相交聯(lián)，形成立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其孔徑大小子互相交聯(lián)，形成立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其孔徑大小取決于瓊脂糖的濃度。取決于瓊脂糖的濃度。 瓊脂糖凝膠電泳參數(shù)：瓊脂糖凝膠電泳參數(shù)： 1，電泳緩沖液，電泳緩沖液 2，瓊脂糖的濃度，瓊脂糖的濃度 3，DNA樣品樣品 4，電泳條件，電泳條件 5，EB染色和紫外觀察染色和紫外觀察4/6/2022 5:21 PM歡迎同學(xué)們聽課！Slide 13瓊脂糖凝膠電泳的用途瓊脂糖凝膠電泳的用途 DNA片段大小的

10、估算片段大小的估算 分子量測定分子量測定 回收目標(biāo)片段回收目標(biāo)片段 濃度測定：濃度測定：10ng4/6/2022 5:21 PM歡迎同學(xué)們聽課！Slide 147.2.4 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE) 聚丙烯酰胺凝膠是聚丙烯酰胺凝膠是丙烯酰胺（丙烯酰胺（Acr, acrylamide）單體在）單體在甲叉雙丙烯酰胺（甲叉雙丙烯酰胺（Bis, N,N-methlene bisacrylamide）交聯(lián)劑作用下形成的一種交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)交聯(lián)劑作用下形成的一種交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) 分辨率高達(dá)分辨率高達(dá)1bp，用

11、于，用于DNA序列測定序列測定 載樣量大載樣量大 回收純度高回收純度高4/6/2022 5:21 PM歡迎同學(xué)們聽課！Slide 157.2.5 脈沖電場凝膠電泳脈沖電場凝膠電泳(contour-clamped homogenous electric field, CHEF/pulsed field electrophoresis) 利用大分子利用大分子DNA轉(zhuǎn)身和變向的容易程度不同，轉(zhuǎn)身和變向的容易程度不同，導(dǎo)致各種分子按分子量大小依次分開。導(dǎo)致各種分子按分子量大小依次分開。 可分辨幾百甚至上千可分辨幾百甚至上千kb的的DNA分子。分子。 CHEF裝置價格昂貴裝置價格昂貴4/6/2022 5

12、:21 PM歡迎同學(xué)們聽課！Slide 167.3 PCR（Polymerase Chain Reaction）技術(shù)）技術(shù)7.3.1 PCR反應(yīng)的原理和步驟反應(yīng)的原理和步驟7.3.2 PCR反應(yīng)體系的成份反應(yīng)體系的成份7.3.3 PCR反應(yīng)程序的參數(shù)反應(yīng)程序的參數(shù)7.3.4 熱啟動熱啟動PCR7.3.5 PCR擴(kuò)增的平臺效應(yīng)擴(kuò)增的平臺效應(yīng)7.3.6 PCR技術(shù)的應(yīng)用技術(shù)的應(yīng)用4/6/2022 5:21 PM歡迎同學(xué)們聽課！Slide 177.3.1 PCR反應(yīng)的原理和步驟反應(yīng)的原理和步驟 原理原理：模擬細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的：模擬細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的DNA復(fù)制過程，在體復(fù)制過程，在體外由外由DNA聚合酶催化合成

13、特異性聚合酶催化合成特異性DNA片段。片段。 步驟步驟： 變性：變性：9095C，dsDNA變性為兩條變性為兩條ssDNA； 退火：退火：3760 C，引物與，引物與ssDNA退火；退火； 延伸：延伸：7075 C，引物在，引物在Taq酶作用下延伸。酶作用下延伸。4/6/2022 5:21 PM歡迎同學(xué)們聽課！Slide 187.3.2 PCR反應(yīng)體系的成份反應(yīng)體系的成份 Taq (Thermus aquaticus) 酶酶 模板模板DNA 引物引物 dNTP PCR 緩沖液緩沖液4/6/2022 5:21 PM歡迎同學(xué)們聽課！Slide 197.3.3 PCR技術(shù)的應(yīng)用技術(shù)的應(yīng)用 擴(kuò)增效率高

14、，用于診斷、檢疫等實踐中，檢擴(kuò)增效率高，用于診斷、檢疫等實踐中，檢測極微量甚至痕跡量的測極微量甚至痕跡量的DNA分子。分子。 基因克隆，制備目的基因。基因克隆，制備目的基因。 用于測序用于測序 探針標(biāo)記探針標(biāo)記 分子標(biāo)記，如分子標(biāo)記，如RAPD、SSR等。等。4/6/2022 5:21 PM歡迎同學(xué)們聽課！Slide 207.4 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)7.4.1 分子雜交的原理和步驟分子雜交的原理和步驟7.4.2 分子雜交的類型分子雜交的類型4/6/2022 5:21 PM歡迎同學(xué)們聽課！Slide 217.4.1 分子雜交的原理和步驟分子雜交的原理和步驟 基本原理：基本原理：具有一定同源性

15、的兩條核酸（具有一定同源性的兩條核酸（DNA or RNA）單鏈在適宜的溫度及離子強(qiáng)度等條件）單鏈在適宜的溫度及離子強(qiáng)度等條件下，可按堿基互補(bǔ)配對原則高度特異地復(fù)性形下，可按堿基互補(bǔ)配對原則高度特異地復(fù)性形成雙鏈。成雙鏈。 雜交探針雜交探針：具有一定序列的核苷酸片段，能與：具有一定序列的核苷酸片段，能與互補(bǔ)的核酸序列復(fù)性雜交，并且能通過適當(dāng)互補(bǔ)的核酸序列復(fù)性雜交，并且能通過適當(dāng)標(biāo)標(biāo)記記進(jìn)行檢測。主要用于核酸分子雜交。進(jìn)行檢測。主要用于核酸分子雜交。4/6/2022 5:21 PM歡迎同學(xué)們聽課！Slide 227.4.2 分子雜交的類型分子雜交的類型 Southern blotting (印跡

16、）雜交印跡）雜交 Northern blotting (印跡）雜交印跡）雜交 斑點(diǎn)雜交（斑點(diǎn)雜交（dot blotting)和狹線雜交和狹線雜交(slot blotting) 菌落（或噬菌斑）原位雜交菌落（或噬菌斑）原位雜交 RNA原位雜交原位雜交4/6/2022 5:21 PM歡迎同學(xué)們聽課！Slide 23分子雜交的基本步驟分子雜交的基本步驟 電泳電泳/印膜印膜 DNA片段轉(zhuǎn)移和固定片段轉(zhuǎn)移和固定 探針標(biāo)記探針標(biāo)記 預(yù)雜交預(yù)雜交 雜交雜交 洗膜洗膜 壓壓X-光片或壓磷屏光片或壓磷屏 觀察觀察 脫探脫探針針4/6/2022 5:21 PM歡迎同學(xué)們聽課！Slide 247.5 探針標(biāo)記技術(shù)探

17、針標(biāo)記技術(shù)7.5.1 核酸探針的種類核酸探針的種類7.5.2 探針標(biāo)記物探針標(biāo)記物7.5.3 探針標(biāo)記方法探針標(biāo)記方法4/6/2022 5:21 PM歡迎同學(xué)們聽課！Slide 257.5.1核酸探針的種類核酸探針的種類 同源或部分同源序列同源或部分同源序列 總總cDNA 特異特異性性cDNA 人工合成的寡核苷酸片段人工合成的寡核苷酸片段4/6/2022 5:21 PM歡迎同學(xué)們聽課！Slide 267.5.2 探針標(biāo)記物探針標(biāo)記物 理想探針標(biāo)記物條件理想探針標(biāo)記物條件: 1）不會影響探針的）不會影響探針的理化性質(zhì)理化性質(zhì)（雜交特異性、雜交（雜交特異性、雜交穩(wěn)定性、酶反應(yīng)特征等）；穩(wěn)定性、酶反

18、應(yīng)特征等）； 2）檢測靈敏度高、特異性強(qiáng)、本底低、重復(fù)性好；）檢測靈敏度高、特異性強(qiáng)、本底低、重復(fù)性好； 3）操作簡便、省時，經(jīng)濟(jì)實用；）操作簡便、省時，經(jīng)濟(jì)實用； 4）化學(xué)穩(wěn)定性高、易于長期保存；）化學(xué)穩(wěn)定性高、易于長期保存； 5）安全、無環(huán)境污染。）安全、無環(huán)境污染。 標(biāo)記物種類標(biāo)記物種類：放射性標(biāo)記物和非放射性標(biāo)記：放射性標(biāo)記物和非放射性標(biāo)記物物4/6/2022 5:21 PM歡迎同學(xué)們聽課！Slide 27放射性標(biāo)記物放射性標(biāo)記物常用的放射性同位素：常用的放射性同位素：32P：硬：硬 射線，放射性較高，放射自顯影檢測射線，放射性較高，放射自顯影檢測靈敏度較高，但輻射危害性也較大，需用有

19、靈敏度較高，但輻射危害性也較大，需用有機(jī)玻璃防護(hù)才能操作。半衰期較短，機(jī)玻璃防護(hù)才能操作。半衰期較短，14.3天，天，探針不能長期保存。探針不能長期保存。35S：軟：軟 射線，放射性較低，檢測靈敏度低于射線，放射性較低，檢測靈敏度低于32P，但其分辨率較高，本底低，輻射危害性，但其分辨率較高，本底低，輻射危害性也較低，可以面對面進(jìn)行操作。半衰期較長，也較低，可以面對面進(jìn)行操作。半衰期較長，87.1天，使用較為方便安全天，使用較為方便安全。4/6/2022 5:21 PM歡迎同學(xué)們聽課！Slide 28非放射性標(biāo)記非放射性標(biāo)記物物 特點(diǎn)：特點(diǎn)： 無放射性污染，分辨率高，穩(wěn)定性好，無放射性污染，分

20、辨率高，穩(wěn)定性好，可較長時間保存使用。可較長時間保存使用。 大多數(shù)非放射性標(biāo)記的大多數(shù)非放射性標(biāo)記的敏感性敏感性和和特異性特異性不如放射性探針。不如放射性探針。 常用非放射性標(biāo)記：常用非放射性標(biāo)記： 生物素（生物素（biotin）標(biāo)記）標(biāo)記 地高辛（地高辛（digoxigenin）標(biāo)記）標(biāo)記 熒光素（熒光素（fluorescein）標(biāo)記）標(biāo)記4/6/2022 5:21 PM歡迎同學(xué)們聽課！Slide 297.5.3 探針標(biāo)記方法探針標(biāo)記方法 體內(nèi)標(biāo)記（活體標(biāo)記）體內(nèi)標(biāo)記（活體標(biāo)記） 體外標(biāo)記：體外標(biāo)記： 化學(xué)法化學(xué)法：利用標(biāo)記物的活性基團(tuán)與核酸分子中：利用標(biāo)記物的活性基團(tuán)與核酸分子中的某種基團(tuán)

21、（如磷酸基團(tuán)）發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而直接將的某種基團(tuán)（如磷酸基團(tuán)）發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而直接將標(biāo)記物連接到探針分子上。該法簡單快速、標(biāo)記均標(biāo)記物連接到探針分子上。該法簡單快速、標(biāo)記均勻，尤其適于探針的非放射性標(biāo)記。勻，尤其適于探針的非放射性標(biāo)記。 酶法酶法：是先將標(biāo)記物標(biāo)記到核苷酸上，然后：是先將標(biāo)記物標(biāo)記到核苷酸上，然后通過酶促聚合反應(yīng)使帶有標(biāo)記的核苷酸摻入到核酸通過酶促聚合反應(yīng)使帶有標(biāo)記的核苷酸摻入到核酸序列中。該法應(yīng)用廣泛，適于放射性探針標(biāo)記和部序列中。該法應(yīng)用廣泛，適于放射性探針標(biāo)記和部分非放射性探針標(biāo)記。如：切口平移法、隨機(jī)引物分非放射性探針標(biāo)記。如：切口平移法、隨機(jī)引物法、末端標(biāo)記法、法、末端標(biāo)記

22、法、PCR法等。法等。4/6/2022 5:21 PM歡迎同學(xué)們聽課！Slide 30 在在Mg2+存在的條件下，微量的存在的條件下，微量的DNase I在待標(biāo)記在待標(biāo)記的的ds DNA分子上隨機(jī)產(chǎn)生若干單鏈切口分子上隨機(jī)產(chǎn)生若干單鏈切口 然后利用然后利用DNA聚合酶聚合酶I的的53的外切作用在切口的外切作用在切口的的5端將核苷酸逐個切除，同時在端將核苷酸逐個切除，同時在53聚合活性聚合活性下，以互補(bǔ)的下，以互補(bǔ)的DNA單鏈為模板合成新的單鏈為模板合成新的DNA單鏈。單鏈。 只能標(biāo)記只能標(biāo)記雙鏈雙鏈DNA；Klenow酶不能用于此法中。酶不能用于此法中。 標(biāo)記平均長度為標(biāo)記平均長度為600 bp，標(biāo)記探針的長度，標(biāo)記探針的長度受受DNaseI和和DNA聚合酶聚合酶I的用量及比例控制的用量及比例控制。切口平移法切口平移法/切口翻譯法（切口翻譯法（nick translation ）4/6/2022 5:21 PM歡迎同學(xué)們聽課！Slide 31隨機(jī)引物法隨機(jī)引物法（random primer DNA labeling） 待標(biāo)記的待標(biāo)記的ds DNA分子加熱變性。分子加熱變性。 六個核苷酸六個核苷酸(dN)6隨機(jī)組成的引