牛病毒性腹瀉與粘膜病

1、 牛病毒性腹瀉，又稱牛病毒性腹瀉牛病毒性腹瀉，又稱牛病毒性腹瀉/ /粘膜病，是由粘膜病，是由BVDVBVDV引起的，主要侵害牛、羊、鹿、牦牛等反芻動(dòng)物及引起的，主要侵害牛、羊、鹿、牦牛等反芻動(dòng)物及豬的一種重要傳染病。臨床主要表現(xiàn)為發(fā)熱、粘膜糜爛豬的一種重要傳染病。臨床主要表現(xiàn)為發(fā)熱、粘膜糜爛、潰瘍、白細(xì)胞減少、持續(xù)感染、咳嗽及懷孕母牛流產(chǎn)、潰瘍、白細(xì)胞減少、持續(xù)感染、咳嗽及懷孕母牛流產(chǎn)或產(chǎn)生畸形胎兒或產(chǎn)生畸形胎兒。同一種病原引起的多種病狀的傳染病同一種病原引起的多種病狀的傳染病 我國(guó)我國(guó)19801980年年李佑民首李佑民首從從國(guó)外國(guó)外進(jìn)口奶牛分離出進(jìn)口奶牛分離出BVBVDVDV；上世紀(jì)上世紀(jì)9

2、090年代鄭志剛等在全國(guó)范圍內(nèi)調(diào)查，年代鄭志剛等在全國(guó)范圍內(nèi)調(diào)查，BVDVBVDV平均陽(yáng)平均陽(yáng)性率為性率為19.56%19.56%，近年來(lái)本病在國(guó)內(nèi)陽(yáng)性檢出率呈逐年上，近年來(lái)本病在國(guó)內(nèi)陽(yáng)性檢出率呈逐年上漲的趨勢(shì)。漲的趨勢(shì)。本病給養(yǎng)牛業(yè)造成明顯損失（產(chǎn)乳本病給養(yǎng)牛業(yè)造成明顯損失（產(chǎn)乳、重、重、流產(chǎn)等）。流產(chǎn)等）。牛病毒性腹瀉牛病毒性腹瀉1BVDVBVDV的流行病學(xué)的流行病學(xué) 2BVDVBVDV的病原學(xué)的病原學(xué) 3BVDVBVDV的基因結(jié)構(gòu)及其蛋白的基因結(jié)構(gòu)及其蛋白4BVDVBVDV的研究進(jìn)展的研究進(jìn)展 內(nèi)容摘要內(nèi)容摘要56BVDVBVDV的防治的防治 BVDVBVDV的主要診斷方法的主要診斷方法

3、 BVDVBVDV的流行病學(xué)的流行病學(xué)傳傳 染染 源：病牛和帶毒牛是主要傳染源。源：病牛和帶毒牛是主要傳染源。傳播途徑：主要通過(guò)傳播途徑：主要通過(guò)消化道消化道和和呼吸道呼吸道傳播傳播；直接或；直接或間接間接接觸接觸也可以傳播；也可以傳播；吸血昆蟲(chóng)吸血昆蟲(chóng)也是重要的傳播也是重要的傳播媒介。媒介。易感動(dòng)物：主要感染牛（肉牛、奶牛），也可感染易感動(dòng)物：主要感染牛（肉牛、奶牛），也可感染豬。豬。 本病多發(fā)于寒冷季節(jié)，過(guò)分擁擠可促進(jìn)本病本病多發(fā)于寒冷季節(jié)，過(guò)分擁擠可促進(jìn)本病發(fā)生。發(fā)生。BVDVBVDV的病原學(xué)的病原學(xué) 屬屬黃黃病毒科、病毒科、瘟病毒屬瘟病毒屬 有囊膜，直徑有囊膜，直徑2525- -303

4、0nmnm，正鏈正鏈RNARNA 胎牛腎、睪丸、豬腎、胎羊睪丸可增殖胎牛腎、睪丸、豬腎、胎羊睪丸可增殖傳代傳代 BVDV BVDV。BVDV BVDV 可以分成致細(xì)胞病變可以分成致細(xì)胞病變型（型（CPCP）和非致細(xì)胞病變型（）和非致細(xì)胞病變型（NCPNCP）。）。BVDVBVDV的基因結(jié)構(gòu)及其蛋白的基因結(jié)構(gòu)及其蛋白 5-Npro 5-Npro（P20P20）-C(P14)-Erns(gp48)-E1 (gp25)-C(P14)-Erns(gp48)-E1 (gp25)-E2(gp53)-P7- NS2-3 (P125)-NS4A (P10)- NS4B E2(gp53)-P7- NS2-3 (

5、P125)-NS4A (P10)- NS4B (P30)- NS5A (P58)- NS5B (P75)-3(P30)- NS5A (P58)- NS5B (P75)-3, ,其中其中C C，E ERNSRNS，E1E1，E2E2是病毒的結(jié)構(gòu)蛋白。其余為非結(jié)構(gòu)蛋白是病毒的結(jié)構(gòu)蛋白。其余為非結(jié)構(gòu)蛋白。BVDVBVDV的主要基因、蛋白研究進(jìn)展的主要基因、蛋白研究進(jìn)展BVDV核衣殼組成成核衣殼組成成分，具有免疫分，具有免疫原性原性 BVDV BVDV 基因組基因組具有較高的保具有較高的保守性守性瘟病毒屬內(nèi)高度瘟病毒屬內(nèi)高度保守，在病毒復(fù)保守，在病毒復(fù)制、病毒制、病毒RNARNA轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)譯或者病毒多聚譯或

6、者病毒多聚蛋白加工過(guò)程中蛋白加工過(guò)程中具有重要作用具有重要作用5-UTR5-UTRC CNS3NS3E ERNSRNS內(nèi)有一高度保內(nèi)有一高度保守結(jié)構(gòu)域守結(jié)構(gòu)域，可，可用于研究亞單用于研究亞單位疫苗，也可位疫苗，也可作為基因工程作為基因工程診斷抗原診斷抗原E2與抗與抗BVDV抗體結(jié)合、抗體結(jié)合、介導(dǎo)免疫中和反應(yīng)及介導(dǎo)免疫中和反應(yīng)及與宿主細(xì)胞識(shí)別、吸與宿主細(xì)胞識(shí)別、吸附的主要部位附的主要部位Npro具有自體蛋白酶活性具有自體蛋白酶活性，有較高的保守，可以對(duì)有較高的保守，可以對(duì)瘟病毒進(jìn)行種、群或型瘟病毒進(jìn)行種、群或型的鑒定的鑒定v5-UTR5-UTR：55末端無(wú)甲基化的末端無(wú)甲基化的“帽子帽子”結(jié)構(gòu)

7、，結(jié)構(gòu)，5-5-UTRUTR序列在序列在BVDVBVDV的各毒株間有較高的保守性，因的各毒株間有較高的保守性，因此常根據(jù)此常根據(jù)5-UTR5-UTR的序列設(shè)計(jì)引物來(lái)檢測(cè)的序列設(shè)計(jì)引物來(lái)檢測(cè) BVDVBVDV或或?qū)?duì) BVDV BVDV 進(jìn)行分型進(jìn)行分型。5-UTR 5-UTR 在病毒轉(zhuǎn)錄、翻譯在病毒轉(zhuǎn)錄、翻譯過(guò)程中起重要的作用。過(guò)程中起重要的作用。v20102010年張興娟等分別用年張興娟等分別用5-UTR5-UTR設(shè)計(jì)一對(duì)引物，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，預(yù)擴(kuò)增片段預(yù)擴(kuò)增片段125bp125bp；20102010年孟雨等人也利用年孟雨等人也利用5-5-UTRUTR設(shè)計(jì)一對(duì)引物，預(yù)擴(kuò)增片段設(shè)計(jì)一對(duì)引物，預(yù)擴(kuò)

8、增片段218bp218bp，實(shí)驗(yàn)證明，實(shí)驗(yàn)證明利用利用5-UTR5-UTR設(shè)計(jì)引物具有很好的特異性和敏感性。設(shè)計(jì)引物具有很好的特異性和敏感性。vE2E2：是是BVDVBVDV的主要保護(hù)性抗原，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中的主要保護(hù)性抗原，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，所以新型疫苗都是針對(duì)和抗體，所以新型疫苗都是針對(duì)E2E2結(jié)構(gòu)蛋白的。結(jié)構(gòu)蛋白的。也是也是與抗與抗 BVDV BVDV 抗體結(jié)合、介導(dǎo)免疫中和反應(yīng)及與宿主細(xì)抗體結(jié)合、介導(dǎo)免疫中和反應(yīng)及與宿主細(xì)胞識(shí)別、吸附的主要部位胞識(shí)別、吸附的主要部位，E2 E2 基因一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者基因一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究瘟病毒的重點(diǎn)研究瘟病毒的重點(diǎn)。vE2 E2 是形成是形成

9、BVD BVD 基因工程疫苗的最好的選擇基因工程疫苗的最好的選擇。vBVDV E2 DNA BVDV E2 DNA 疫苗是近年來(lái)疫苗是近年來(lái) BVDV BVDV 免疫研究的熱點(diǎn)。免疫研究的熱點(diǎn)。如如20072007吳明福吳明福等構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒等構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3.1(+)-E2 pcDNA3.1(+)-E2 并免疫小鼠，可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生一定程度的體液和細(xì)胞并免疫小鼠，可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生一定程度的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答。vNS-3NS-3：NS3NS3區(qū)域與病毒的毒力，生長(zhǎng)特性有區(qū)域與病毒的毒力，生長(zhǎng)特性有關(guān)。關(guān)。NS3NS3在瘟病毒屬內(nèi)高度保守，在病毒復(fù)制、在瘟病毒屬內(nèi)高度保守，

10、在病毒復(fù)制、病毒病毒RNARNA轉(zhuǎn)譯或者病毒多聚蛋白加工過(guò)程中具轉(zhuǎn)譯或者病毒多聚蛋白加工過(guò)程中具有重要作用。有重要作用。NS3NS3的表達(dá)與宿主細(xì)胞的表達(dá)與宿主細(xì)胞CPECPE的產(chǎn)生的產(chǎn)生有密切關(guān)系有密切關(guān)系。v20092009年魏偉等用年魏偉等用BVDV NS3 BVDV NS3 蛋白中有免疫反蛋白中有免疫反應(yīng)性的重組片段作為包被抗原，建立了一個(gè)應(yīng)性的重組片段作為包被抗原，建立了一個(gè) BVDV BVDV 抗體檢測(cè)的間接抗體檢測(cè)的間接 ELISA ELISA 方法。方法。血清學(xué)診斷血清學(xué)診斷免疫學(xué)診斷免疫學(xué)診斷診斷方法的進(jìn)展診斷方法的進(jìn)展分子生物學(xué)診斷分子生物學(xué)診斷1 12 23 3血清學(xué)診斷

11、血清學(xué)診斷 常見(jiàn)的方法為主要包括血清中和試驗(yàn)常見(jiàn)的方法為主要包括血清中和試驗(yàn)和瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)兩種。和瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)兩種。 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)準(zhǔn)確性較低，檢出的結(jié)果瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)準(zhǔn)確性較低，檢出的結(jié)果常常有假陽(yáng)性。常常有假陽(yáng)性。 血清中和試驗(yàn)重復(fù)性高，準(zhǔn)確性好，已作血清中和試驗(yàn)重復(fù)性高，準(zhǔn)確性好，已作為為 BVDV BVDV 診斷的診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)金標(biāo)準(zhǔn)”，但血清中和試，但血清中和試驗(yàn)在基層使用時(shí)，常遇到費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，需要驗(yàn)在基層使用時(shí)，常遇到費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，需要細(xì)胞培養(yǎng)等試驗(yàn)室技術(shù)問(wèn)題，無(wú)法得到推廣細(xì)胞培養(yǎng)等試驗(yàn)室技術(shù)問(wèn)題，無(wú)法得到推廣。免疫學(xué)診斷免疫學(xué)診斷酶聯(lián)免疫吸酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)附試驗(yàn)（ELISAELISA）

12、免疫熒光技免疫熒光技術(shù)（術(shù)（IFAIFA）免疫過(guò)氧化免疫過(guò)氧化物酶技術(shù)物酶技術(shù)（IPIP）免疫熒光技術(shù)（免疫熒光技術(shù)（IFAIFA） 免疫熒光技術(shù)（免疫熒光技術(shù)（IFAIFA）又稱熒光抗體技）又稱熒光抗體技術(shù)，可用于檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物以及病變組織術(shù)，可用于檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物以及病變組織的冰凍切片中的冰凍切片中 BVDV BVDV 感染情況。感染情況。 免疫熒光抗體技術(shù)特異、敏感、快速，免疫熒光抗體技術(shù)特異、敏感、快速，但它需要熒光顯微鏡，使得此技術(shù)無(wú)法得但它需要熒光顯微鏡，使得此技術(shù)無(wú)法得到推廣應(yīng)用。到推廣應(yīng)用。ELISA ELISA ELISA 常被用于檢測(cè)組織器官培養(yǎng)物中常被用于檢測(cè)組織器官培養(yǎng)物

13、中 BVDVBVDV，監(jiān)測(cè)牛群中，監(jiān)測(cè)牛群中 BVD BVD 抗體水平，評(píng)估潛伏抗體水平，評(píng)估潛伏感染情況。其中最常用的是雙抗夾心感染情況。其中最常用的是雙抗夾心 ELISA ELISA 和間接和間接 ELISA ELISA，也有使用，也有使用 BVDV BVDV 單克隆抗體與單克隆抗體與 ELISA ELISA 聯(lián)合診斷聯(lián)合診斷 BVD BVD。 研究較多的研究較多的IBRVIBRV診斷蛋白有診斷蛋白有NS3NS3，E2E2蛋白蛋白酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISAELISA） 免疫過(guò)氧化物酶技術(shù)免疫過(guò)氧化物酶技術(shù)（IPIP）診斷）診斷 BVDV BVDV 準(zhǔn)確、準(zhǔn)確、可靠，可用

14、于了解可靠，可用于了解 BVD BVD 的總體分布情況。鏈酶親的總體分布情況。鏈酶親和素和素- -生物素過(guò)氧化物酶生物素過(guò)氧化物酶檢測(cè)方法，可以用來(lái)檢測(cè)檢測(cè)方法，可以用來(lái)檢測(cè)福爾馬林固定、石蠟包埋福爾馬林固定、石蠟包埋組織切片中的組織切片中的BVDVBVDV。 近年來(lái)，為了避近年來(lái)，為了避免非特異性染色反免非特異性染色反應(yīng)，則可以使用單應(yīng)，則可以使用單克隆抗體克隆抗體+ +生物素化生物素化抗鼠抗體抗鼠抗體- -鏈酶親和鏈酶親和素過(guò)氧化物酶檢測(cè)素過(guò)氧化物酶檢測(cè)方法方法。免疫過(guò)氧化物酶技術(shù)（免疫過(guò)氧化物酶技術(shù)（IPIP）分子生物學(xué)診斷分子生物學(xué)診斷RT-PCR核酸探針檢測(cè)核酸探針檢測(cè)1 12 2R

15、T-PCR RTPCR RTPCR 是目前廣泛應(yīng)用的分是目前廣泛應(yīng)用的分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)于檢測(cè)子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)于檢測(cè) BVDV BVDV 的的 RNA RNA 是一個(gè)合適的方法。根據(jù)是一個(gè)合適的方法。根據(jù) BVDV BVDV 基因組序列合成一對(duì)或幾對(duì)特異性基因組序列合成一對(duì)或幾對(duì)特異性引物，可以高度特異、敏感的檢測(cè)引物，可以高度特異、敏感的檢測(cè)出器官、組織、細(xì)胞培養(yǎng)物中的出器官、組織、細(xì)胞培養(yǎng)物中的 BVDVBVDV，并可區(qū)別，并可區(qū)別 CSFV CSFV、BDVBDV，還可，還可對(duì)對(duì) BVDV BVDV 的基因型和生物型作進(jìn)一的基因型和生物型作進(jìn)一步的鑒定步的鑒定 PCRPCR引物多數(shù)選在引

16、物多數(shù)選在BVDVBVDV保守區(qū)保守區(qū)5-UTR5-UTR和和NS3NS3基因內(nèi)，尤其基因內(nèi)，尤其5UTR5UTR是是BVDVBVDV進(jìn)行鑒定進(jìn)行鑒定、基因分型的首選區(qū)域。、基因分型的首選區(qū)域。 20072007年年王偉利建立了王偉利建立了 BVDV BVDV 熒光熒光 RT- RT-PCR PCR 檢測(cè)方法并進(jìn)行了初步應(yīng)用，檢測(cè)方法并進(jìn)行了初步應(yīng)用，20072007年年國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫局制定了牛病毒性國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫局制定了牛病毒性腹瀉腹瀉/ /黏膜病反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)操作規(guī)程黏膜病反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)操作規(guī)程核酸探針檢測(cè)（核酸探針檢測(cè)（NAH） 與傳統(tǒng)方法相比，該技術(shù)敏感，特異性強(qiáng)，

17、而與傳統(tǒng)方法相比，該技術(shù)敏感，特異性強(qiáng)，而且應(yīng)用很廣泛，且應(yīng)用很廣泛，NAH NAH 可直接檢測(cè)臟器組織和血細(xì)胞可直接檢測(cè)臟器組織和血細(xì)胞中的中的 BVDV BVDV。NAH NAH 技術(shù)應(yīng)用最廣泛的是核酸標(biāo)記法技術(shù)應(yīng)用最廣泛的是核酸標(biāo)記法，按核酸探針標(biāo)記物不同可分為兩類：一類是放射，按核酸探針標(biāo)記物不同可分為兩類：一類是放射性同位素（如性同位素（如 32P 32P，35S35S）標(biāo)記的）標(biāo)記的 DNA DNA 探針，另一探針，另一類是用如地高辛、生物素標(biāo)記的類是用如地高辛、生物素標(biāo)記的 DNA DNA 探針。核酸探針。核酸探針技術(shù)標(biāo)記簡(jiǎn)單，特異性好，可長(zhǎng)期保存，并且探針技術(shù)標(biāo)記簡(jiǎn)單，特異性好，可長(zhǎng)期保存，并且可以回收利用，制成試劑盒，是一種安全、快速、可以回收利用，制成試劑盒，是