液相色譜基礎(chǔ)知識(shí)(waters)

1、液相色譜基礎(chǔ)知識(shí)液相色譜基礎(chǔ)知識(shí)色譜柱基礎(chǔ)知識(shí)對(duì)對(duì)HPLC柱填料的了解柱填料的了解平均顆粒度，顆粒度分布.顆粒度(dp)顆粒度越小：柱效越高(傳質(zhì)好，渦流擴(kuò)散小) 柱壓越高(滲透性差).顆粒分布顆粒分布越寬 柱效低(滲透性差).顆粒形狀球型 柱效高、重現(xiàn)性好、柱床結(jié)構(gòu)均勻無定型：柱床結(jié)構(gòu)不均勻 流動(dòng)相線性速度不均勻 譜帶擴(kuò)展對(duì)對(duì)HPLC柱填料的了解（二）柱填料的了解（二）平均孔徑/孔體積孔徑/孔體積分布.大的孔徑可分析高分子量的分子對(duì)對(duì)HPLC柱填料的了解（三）柱填料的了解（三）鍵合相化學(xué).影響化合物的分離度：a .不同鍵合相對(duì)不同種類的化合物分離不同.可能導(dǎo)致色譜的分離機(jī)理不同.如：C18、

2、C8、CN硅膠表面及鍵合相硅膠表面及鍵合相SiSiOOOSiOOOSiOOOSiOOOSiOOOSiOOOSiOOOSiOOOSiOOOSiOOOSiOOOSiCH2H3CCH3H2CCH2H2CCH2H2CCH2H3CSiCH2H3CCH3H2CCH2H2CCH2H2CCH2H3CCH2H3CCH3H2CCH2H2CCH2H2CCH2H3CSiCH2H3CCH3H2CCH2H2CCH2H2CCH2H3CSiOOOSiCH3H3CCH3SiCH3H3CCH3HHHHHHH鍵合相色譜柱鍵合相色譜柱以硅膠為基質(zhì)，通過化學(xué)鍵合方式把碳十八、碳八、胺基等基團(tuán)聯(lián)在基質(zhì)上，作為固定相。優(yōu)點(diǎn).固定相穩(wěn)定，不

3、易流失.應(yīng)用廣泛，可使用多種溶劑.消除硅羥基的不良影響缺點(diǎn).pH值不能小于3.同樣填料，各種牌號(hào)色譜柱不盡相同對(duì)對(duì)HPLC柱填料的了解（四）柱填料的了解（四）含碳量含碳量越高，k值越大（固定相傳質(zhì)效應(yīng)增加）.高含碳量有利于不易保留的化合物的分離水解穩(wěn)定性好，重現(xiàn)性好有利于極性化合物的拖尾改善.低含碳量有利于分析中性及堿性化合物降低溶劑損耗不同色譜柱的含碳量不同色譜柱的含碳量 Symmetry C181917Zorbax ODS1715.7LiChrosorb RP-181510.3Symmetry C81212.5Resolve C-181212.4Ultrasphere ODS 1111.3

4、Partisil ODS-31112.0mBondpak C-18 10 7.9Nova-Pak C-18 7 5.5對(duì)對(duì)HPLC柱填料的了解柱填料的了解(五五)填料的端基封口.封口殘余硅羥基.減少不可逆吸附或拖尾.增加碳含量（0.1% - 1%）殘基處理的效果殘基處理的效果NovaPak C18未封口 C18 抗壞血酸 煙酰胺 對(duì)氨基苯甲酸 哌咯西叮 核黃素 苯酚 鹽酸硫胺對(duì)對(duì)HPLC柱填料的了解（六）柱填料的了解（六）硅膠的活性.主要影響堿性化合物的保留行為：k.生產(chǎn)硅膠時(shí)處理溫度不同，硅膠活性也不同.是選擇性差異的主要來源硅膠的雜質(zhì)含量.重金屬含量低，硅羥基活性小，拖尾減小.是色譜柱質(zhì)量

5、好壞的重要標(biāo)志對(duì)對(duì)HPLC柱填料的了解（七）柱填料的了解（七）填料的穩(wěn)定性.硅膠填料.pH：2-8聚合物填料.pH：2-12.pH值小于2時(shí)鍵合相水解1 2 3 4 5 6 7 8 9 pH硅膠的溶解曲線填料基質(zhì)物理性質(zhì)的影響填料基質(zhì)物理性質(zhì)的影響所有C18柱都是相同的嗎?填料基質(zhì)的物理性質(zhì)對(duì)色譜柱的影響.平均孔徑及其分布 影響被分析樣品的分子量，大孔徑的可分析高分子量樣品.平均孔體積及其分布 影響同孔徑.含碳量 影響化合物的保留時(shí)間，高含碳量保留時(shí)間長.填料的端基封口 主要影響堿性化合物的峰形，未封口會(huì)使堿性化合物拖尾.硅膠的活性 主要影響堿性化合物的保留行為：K，高活性的K大.硅膠的雜質(zhì)含

6、量 更苛刻條件下的堿性化合物峰形Waters色譜柱的內(nèi)徑色譜柱的內(nèi)徑分析柱：Waters Spherisorb及其它公司品牌的色譜柱多為4.6mm內(nèi)徑。Waters傳統(tǒng)品牌的分析柱以3.9m m 內(nèi) 徑 為 主 ， 比 一 般 分 析 柱(4.6mm)細(xì)，因此：.相對(duì)靈敏度高.省溶劑，可用相對(duì)較低的流速.同樣的流速下，柱壓較高(高效柱尤為明顯)注意在用文獻(xiàn)方法時(shí)轉(zhuǎn)換流速,即:降低流速,以保持線速度相同。色譜柱化學(xué)及外形結(jié)構(gòu)的關(guān)系色譜柱化學(xué)及外形結(jié)構(gòu)的關(guān)系液液相相色色譜譜柱柱填填 料料柱柱 管管顆粒表面性質(zhì)顆粒度長 度內(nèi) 徑材 料化學(xué)性質(zhì) k，a分辨率機(jī)械因素N壽命，柱效，速度，溶劑消耗對(duì)對(duì)HP

7、LC柱的了解柱的了解理論塔板數(shù)(N),容量因子(K),選擇性系數(shù)(a),其影響因素有.N：受平均顆粒度及顆粒度分布的影響,顆 粒度越小,N越高.a：受填料表面化學(xué)性質(zhì)對(duì)色譜柱的影響, 不同鍵合相對(duì)不同種類樣品分離不同.K：受鍵合相表面含碳量的影響,含碳量高 時(shí)保留時(shí)間長在同樣情況下保留行為也有差異在同樣情況下保留行為也有差異因此：.需要對(duì)色譜化學(xué)品(色譜柱)有更多的了解.需要不同品牌，即各個(gè)因素有較大差異的色譜柱，以得到更多種選擇性Waters擁有眾多不同品牌的色譜柱，目的就是：供不同應(yīng)用的要求用不同品牌的色譜柱時(shí)，色譜方法有時(shí)可能需要重新開發(fā)Waters各種硅膠基質(zhì)的色譜柱各種硅膠基質(zhì)的色譜

8、柱C 1C 1C 4C 4C 6C 6C 8C 8C 18C 18PhenylPhenylC NC NN HN H2 2m mBandaPakBandaPakResol veResol veN ova-PakN ova-PakD el t a-PakD el t a-PakSym m et rySym m et rySpheri sorbSpheri sorbWaters不同品牌的色譜柱不同品牌的色譜柱m-BondaPak.文獻(xiàn)背景強(qiáng), 是工業(yè)標(biāo)準(zhǔn).平均孔徑125，10mm高活性、無定形硅膠.中等疏水性表面，端基封口。有獨(dú)特選擇性Nova-Pak.平均孔徑60，4mm高韌度低活性球形硅膠.低酸

9、性，高疏水性, 極好的端基封口.有利于小分子物質(zhì)的分析Waters不同品牌的色譜柱不同品牌的色譜柱Resolve.平均孔徑90，5/10 mm低活性硅膠.非常高的疏水性, 無端基封口.有利于低保留的中性及酸性化合物分離Delta-Pak.有100和300兩種孔徑，5/15 mm硅膠.中到高的疏水性，端基封口.適合于多肽、蛋白的分離及制備色譜新一代硅膠基質(zhì)的色譜柱新一代硅膠基質(zhì)的色譜柱 Symmetry.高純度硅膠：Fe, Al, Mg等均85%) 2 提取板及小柱可獲得一致的回收率(RSDs5%) 3 容易使用Oasis HLB 固相提取小柱C18與Oasis HLB 吸附劑浸潤能力的比較H

10、L HLHLHLHLHLLLLLLLLL LLLL HLBH = 親水單元L = 親脂單元C18特征二，通用型吸附劑4優(yōu)勢(shì): l在很寬極性范圍內(nèi)保留酸性、堿性及中性化合物l樣品不會(huì)穿透小柱4益處: l對(duì)極性化合物可獲得較高回收率l使用同一方法，提取藥物及其極性代謝產(chǎn)物可獲得高而重現(xiàn)性好的回收率l一種吸附劑適用于大多數(shù)SPE提取過程Oasis HLB固相提取小柱結(jié)果: 通用型吸附劑020406080100AcidsNeutralsBases% 回收率Ibuprofen (2.5 ?g)Naproxen (2 ?g)Salicylic Acid (5 ?g)Sulfadiazine (10 ?g)

11、Sulfamerazine (10 ?g)Acetaminophen (0.5 ?g)Theobromine (0.5 ?g)Paraxanthine (0.5 ?g)Theophylline (0.5 ?g)Caffeine (0.5 ?g)Procainamide (0.5 ?g)Ranitidine (0.5 ?g)Oxycodone (1 ?g)Propranolol (4 ?g)Naltrexone (1 ?g)Salbutamol (2 ?g)Doxepin (4 ?g) Spiked Serum on 1 cc 30 mg Oasis? HLB CartridgesOasis小柱

12、的使用方法小柱的使用方法 平衡/活化小柱1mL甲醇/1mL水上樣可上200 mL樣品清洗1mL5%甲醇/水洗脫1mL甲醇揮發(fā)并用流動(dòng)相重組樣品制備將樣品用水稀釋準(zhǔn)備進(jìn)樣Oasis HLB ：優(yōu)化的提取方法Oasis HLB 固相提取小柱特征三，重現(xiàn)性O(shè)asis HLB吸附劑填料在Waters ISO 9002-認(rèn)可的工廠中生產(chǎn) 確保重現(xiàn)性.l 優(yōu)勢(shì)4每批吸附劑進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制，建立SPE填料重現(xiàn)性的新標(biāo)準(zhǔn)l 益處:4每盒產(chǎn)品附帶合格證書4不同批次具有重現(xiàn)的回收率Oasis 不同批次間重現(xiàn)性Batch ABatch BBatch C 0.96% 1.21% 2.02% 3.66% 2.40%

13、3.06% 3.67% RSD020406080100% RecoveryProcainamideRanitidineAcetaminophenPropranololDP-phthalateDoxepinb-Methasone ValerateOasis HLB -應(yīng)用各種藥物提取，尤其是生理體液中的藥物， 如血漿、尿液中的藥物等天然產(chǎn)物提取農(nóng)業(yè)化學(xué)應(yīng)用，如提取除草劑、殺蟲劑等環(huán)境化學(xué)應(yīng)用，如提取多環(huán)芳烴等色譜圖常見問題色譜圖常見問題色譜圖常見問題主要有兩類:.色譜峰峰形異常問題例如負(fù)峰,寬峰,肩峰,雙峰,峰形不對(duì)稱等.色譜峰保留時(shí)間問題保留時(shí)間不穩(wěn)定等色譜圖常見問題分析色譜圖常見問題分析(一

14、一)色譜峰峰形異常問題:.色譜圖中未出峰:進(jìn)樣問題:未進(jìn)樣或樣品分解流動(dòng)相問題:泵未輸液或流動(dòng)相不正確檢測(cè)器設(shè)置不正確,或檢測(cè)器有問題.一個(gè)或幾個(gè)峰是負(fù)峰流動(dòng)相吸收本底高進(jìn)樣過程中進(jìn)了空氣離子對(duì)分離中的系統(tǒng)峰樣品組分的吸收(RI或UV)低于流動(dòng)相色譜圖常見問題分析色譜圖常見問題分析(一一)(續(xù)續(xù))色譜峰峰形異常問題:.所有的峰均為負(fù)峰:信號(hào)電纜接反或檢測(cè)器輸出極性設(shè)置顛倒光學(xué)裝置尚未達(dá)到平衡.所有的峰都是寬峰系統(tǒng)未平衡或未達(dá)到化學(xué)平衡溶樣的溶劑比流動(dòng)相強(qiáng)很多色譜柱類型或尺寸不正確色譜柱或保護(hù)柱被污染或降級(jí)溫度變化對(duì)色譜柱的影響色譜圖常見問題分析色譜圖常見問題分析(一一)(續(xù)續(xù))色譜峰峰形異常問

15、題:.較早洗脫的峰呈寬峰進(jìn)樣體積過大或樣品濃度太高進(jìn)樣器有問題,定量環(huán)(Loop)大小不合適在線過濾器,保護(hù)柱,色譜柱或管路堵塞管路問題:內(nèi)徑不對(duì)或切管不正確管路連接問題:接頭或錐箍不正確檢測(cè)器時(shí)間常數(shù)不正確色譜圖常見問題分析色譜圖常見問題分析(一一)(續(xù)續(xù))色譜峰峰形異常問題:.峰比預(yù)想的要小樣品粘度過大進(jìn)樣器有問題或進(jìn)樣體積有誤檢測(cè)器設(shè)置不正確,定量環(huán)(Loop)體積不正確檢測(cè)器輸出未置零用了不正確的檢測(cè)器輸出信號(hào)檢測(cè)池被污染檢測(cè)器的燈可能有問題色譜圖常見問題分析色譜圖常見問題分析(一一)(續(xù)續(xù))色譜峰峰形異常問題:.雙峰或肩峰進(jìn)樣量或樣品濃度過大保護(hù)柱或色譜柱進(jìn)口堵塞保護(hù)柱或色譜柱污染或

16、失效.前伸峰進(jìn)樣量或樣品濃度過大溶樣的溶劑相對(duì)于流動(dòng)相太強(qiáng)保護(hù)柱或色譜柱污染或失效色譜圖常見問題分析色譜圖常見問題分析(一一)(續(xù)續(xù))色譜峰峰形異常問題:.拖尾峰保護(hù)柱或色譜柱問題:污染或失效進(jìn)樣問題檢測(cè)器時(shí)間常數(shù)不正確.平頭峰檢測(cè)器設(shè)置不正確進(jìn)樣體積太大或樣品濃度太高色譜峰保留時(shí)間問題:.保留時(shí)間飄忽不定(各次運(yùn)行之間)系統(tǒng)不穩(wěn)定或未達(dá)化學(xué)平衡泵壓力不穩(wěn)(泵頭里有氣泡)進(jìn)樣體積過大或樣品濃度過大溫度波動(dòng)流動(dòng)相混合不均勻色譜柱被污染色譜圖常見問題分析色譜圖常見問題分析(二二)色譜峰保留時(shí)間問題:.保留時(shí)間增加或減少(各次運(yùn)行之間)系統(tǒng)不穩(wěn)定或化學(xué)平衡不足泵流速變化溫度變化色譜柱污染,柱效下降流

17、動(dòng)相被污染溶劑入口過濾器堵或管路堵塞系統(tǒng)滲漏色譜圖常見問題分析色譜圖常見問題分析(二二)(續(xù)續(xù))色譜圖常見問題分析色譜圖常見問題分析(二二)(續(xù)續(xù))色譜峰保留時(shí)間問題:.保留時(shí)間改變到一個(gè)新的恒定值流動(dòng)相不正確或其組成不正確泵流速變化實(shí)際輸液的流速不正確(泵失靈或故障)環(huán)境溫度變化；柱溫不正確色譜柱尺寸或類型不正確色譜柱被污染流動(dòng)相含有穩(wěn)定劑或穩(wěn)定劑發(fā)生變化輸液系統(tǒng)的梯度滯后體積不正確HPLC常見問題常見問題系統(tǒng)壓力問題.壓力高.壓力低或沒有壓力.壓力不穩(wěn)流路基線噪音問題.基線不穩(wěn)定(不重復(fù)).長、短程振蕩.基線漂移.噪音脈沖尖刺HPLC常見問題分析常見問題分析系統(tǒng)壓力問題.壓力高的原因溫度太

18、低流速太高流動(dòng)相粘度大管路堵塞儀器或色譜柱堵塞壓力傳感器問題HPLC常見問題分析常見問題分析(續(xù)續(xù))系統(tǒng)壓力問題.壓力低或沒有壓力溫度太高;流速太低泵關(guān)閉或保險(xiǎn)絲斷了泵未輸送流動(dòng)相儲(chǔ)液瓶中無溶劑 低壓限設(shè)置不當(dāng)泵未正確排氣溶劑入口過濾頭堵 入口管路中有空氣泵失效系統(tǒng)內(nèi)有滲漏處所用溶劑不正確自動(dòng)進(jìn)樣器在Purge時(shí)卡住HPLC常見問題分析常見問題分析(續(xù)續(xù))系統(tǒng)壓力問題.壓力不穩(wěn)壓力傳感器問題泵排氣不充分泵失效流動(dòng)相未正確脫氣所用溶劑不混溶或易揮發(fā)HPLC常見問題分析常見問題分析(續(xù)續(xù))流路基線噪音問題.基線不穩(wěn)定(不重復(fù))檢測(cè)池中有大的氣泡流路中有小氣泡流過系統(tǒng)未穩(wěn)定或未達(dá)到化學(xué)平衡流動(dòng)相被污染檢測(cè)器流動(dòng)池漏色譜柱污染HPLC常見問題分析常見問題分析(續(xù)續(xù))流路基線噪音問題.基線漂移系統(tǒng)不穩(wěn)或未化學(xué)平衡溫度波動(dòng)流動(dòng)相未正確脫氣流動(dòng)相被污染;流動(dòng)相中有穩(wěn)定劑或穩(wěn)定劑變化檢測(cè)器流動(dòng)池漏;系統(tǒng)中有滲漏色譜柱污染;固定相滲漏選用不正確的檢測(cè)波長(相對(duì)于溶劑)有遲流出的組分HPLC常見問題分析常見問題分析(續(xù)續(xù))流路基線噪音問題.短程振蕩泵壓不穩(wěn)泵入口管松,彎或堵塞溶劑混合不充分檢測(cè)池中有大氣泡泵入口閥臟或失效泵柱塞桿密封墊磨損檢測(cè)器出口溶液成滴狀流入廢液瓶HPLC常見問題分析常見問題分析(續(xù)續(xù))流路基線噪音問題.長程振蕩溫度波動(dòng)溶劑被循環(huán)通過系統(tǒng).噪音脈沖