免疫膠乳濁度分析在自動生化分析儀上的應(yīng)用

1、免疫膠乳濁度分析在自動生化分析儀上的應(yīng)用n免疫比濁回顧n免疫膠乳濁度分析（immunolatex turbidimetry）n在生化分析儀上進(jìn)行測定的有關(guān)問題23免疫檢測的基礎(chǔ) 抗原抗體間的特異性反應(yīng)抗原抗體間的特異性反應(yīng) 手工操作 自動化分析核心核心基礎(chǔ)基礎(chǔ)n免疫比濁技術(shù)是在免疫沉淀反應(yīng)（Precipitation）檢測法的基礎(chǔ)上建立的。n最早應(yīng)用的免疫沉淀反應(yīng)是Ouchterlony在1948年建立的瓊脂雙向擴(kuò)散法。n1965年Mancini等和Fahey等分別建立了可以定量的單向（輻射狀）免疫擴(kuò)散技術(shù)。nLaurell等1966年建立了電免疫擴(kuò)散法，使報告結(jié)果的時間由單向免疫擴(kuò)散法的24

2、h縮短到4-5h。4n經(jīng)典的免疫沉淀試驗通常是在抗原與相應(yīng)抗體反應(yīng)的終點判定結(jié)果，存在費(fèi)時、操作繁瑣、敏感度低（10100mg/L）、不能自動化等缺陷。n根據(jù)沉淀反應(yīng)時，抗原抗體結(jié)合后可使反應(yīng)系統(tǒng)透光度發(fā)生改變，建立了以測定透光度為特征的微量免疫沉淀測定法法，既免疫濁度測定技術(shù)。5n1967年由Richie首次報告，20世紀(jì)70年代逐步完善，80年代初期初步應(yīng)用臨床常規(guī)檢查。n抗原抗體在液相（特殊的緩沖液）中快速結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物，反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。6n液相中抗原與抗體的反應(yīng)結(jié)果與兩者的濃度比例有關(guān)?？乖蚩贵w顯著過量時，都只能生成少量的可溶性免疫復(fù)合物，分子極小，不適于免疫比濁法檢測。

3、n免疫比濁技術(shù)要求溶液中抗體要保持中等過量，此時免疫復(fù)合物（immunecomplex，IC）仍是可溶性的。n在這種情況下，抗原與抗體的反應(yīng)遵循質(zhì)量作用定律（Ag+Ab），形成IC的量是抗原或抗體的函數(shù)。n當(dāng)抗體固定時，IC的量與抗原的量成正比。78LIGHTSOURCEFILTERREACTIONCUVETTETURBIDIMETRIC DETECTORNEPHELOMETRICDETECTORICIC散射比濁、透射比濁光路圖 透射光透射光+ +散射光散射光散散光光射射平光線平光線n目前，國內(nèi)開展的各項免疫檢驗，均求使用國家食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）準(zhǔn)入和批準(zhǔn)的儀器和試劑。這樣做不僅能使

4、各項檢查更加統(tǒng)一，規(guī)范，各實驗室之間檢查結(jié)果更具可比性，而且也可避免很多不必要的醫(yī)療糾紛。n免疫比濁技術(shù)中散射比濁法目前均用獲國家食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）批準(zhǔn)進(jìn)口的自動化分析儀器和配套的各種檢測項目的專用試劑。n透射比濁法（生化分析儀）可用國產(chǎn)試劑。9全國臨床檢驗操作規(guī)程 第3版透射還是散射n散射比濁 專用儀器 專用配套試劑 原裝進(jìn)口試劑昂貴n透射比濁 生化分析儀 開放試劑 （可用國產(chǎn)試劑）10速率法和終點法測定；速率法的靈敏度和特異性優(yōu)于終點法；終點法的穩(wěn)定性較好；透射還是散射n目前，由于技術(shù)的發(fā)展，兩種比濁法的靈敏度和特異性已接近，而全自動生化儀的自動化程度和精密度要勝于專用散射比濁

5、儀，透射免疫比濁法在臨床上的應(yīng)用日益廣泛。生化分析儀通過免疫比濁法技術(shù)，架起了現(xiàn)代生化檢驗和現(xiàn)代免疫技術(shù)的橋梁。n免疫化學(xué)是免疫學(xué)技術(shù)和生物化學(xué)技術(shù)的結(jié)合。既具有免疫學(xué)抗原抗體結(jié)合的特異性，又具有生物化學(xué)反應(yīng)動力學(xué)特點。11透射還是散射n可溶性抗原與其特異性抗體，在一定緩沖液中形成的復(fù)合物，經(jīng)一段時間聚合后出現(xiàn)濁度，人射光在滲過反應(yīng)液時，由于溶液內(nèi)IC粒子對光線的反射和吸收，引起透射光減少，可用吸光度A表示。n用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)參考品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，測出待測抗原的含量。n透射比濁法主要用于生化分析儀。12n免疫復(fù)合物直徑為35lOOnm，這一范圍要求近紫外光處入射光發(fā)出最大的干擾(最大吸收峰)，選

6、擇290410nm波長測定最佳。n由于抗原抗體結(jié)合后在短時間內(nèi)(19s)形成可見的復(fù)合物，才能進(jìn)行比濁。n為了提高復(fù)合物形成速度，加入促聚劑，如4聚乙二醇(MW：60008000)，可使復(fù)合物形成在310min完成。13n比濁法中，少量的小的抗原抗體復(fù)合物極難形成濁度，除非放置較長時間；如形成較大的復(fù)合物，則抗原和抗體用量也較大，顯然不符合微量化的要求。n為解決快速反應(yīng)及微量化的要求，建立了免疫膠乳濁度法（immunolatex turbidimetry）。14n其基本原理是：v將特異性抗體吸附在大小適中、均勻一致的膠乳顆粒上，當(dāng)遇到相應(yīng)抗原時，則使膠乳顆粒發(fā)生凝集。v單個膠乳顆粒在入射光波之

7、內(nèi)，不阻礙光線透過；兩個或兩個以上膠乳顆粒凝聚時則使透過光減少。v免疫微球凝聚的程度為被測物濃度的函數(shù)，由此可測出標(biāo)本中待測物的含量。1516(a)帶抗體的膠乳在帶抗體的膠乳在1個波長之內(nèi)可透過光線個波長之內(nèi)可透過光線 (b)結(jié)合后，則形成光線衰減結(jié)合后，則形成光線衰減該技術(shù)的關(guān)鍵在于兩個方面：n首先是選擇適用的膠乳，其大?。ㄖ睆剑┮孕∮诓ㄩL。用500nm波長者，選擇100nm顆粒較適合；用585nm波長者，則選用100200nm顆粒為好。目前多用200nm的膠乳顆粒。n其次，膠乳與抗體結(jié)合時用化學(xué)交聯(lián)雖好，但失活也較嚴(yán)重；一般用吸附法即可。1718n膠乳顆粒多為惰性微球和羧基化微球n氨基化

8、高分子納米微球氨基化納米微球的顆粒大小較傳統(tǒng)的微球更?。sm），它與抗體的結(jié)合是通過其表面的氨基與抗體的氨基端共價結(jié)合，在微球與抗體之間有一個橋聯(lián)化學(xué)臂，降低了位阻效應(yīng)，不僅提高了抗體的結(jié)合率，而且還為抗體提供合適的三維空間立體結(jié)構(gòu)，有效地保護(hù)了抗體與抗原結(jié)合的活性區(qū)域。與采用惰性納米微球的傳統(tǒng)技術(shù)相比，檢測的靈敏度得到了極大的改善，最高可達(dá)到。19（1）操作簡單，可在幾分鐘內(nèi)快速、準(zhǔn)確地檢測血清蛋白含量，真實反映病情進(jìn)展和評估治療效果，對于疾病的早期診斷和治療具有重要的臨床意義；（2）不易受人為操作和外界因素干擾，檢測穩(wěn)定性和重復(fù)性都很好；（3）能利用普通的生化分析儀進(jìn)行檢測，容易實現(xiàn)自動化

9、，可在各級基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)普及和應(yīng)用。20n膠乳比濁分析n顆粒增強(qiáng)透射免疫比濁法（particle-enhanced turbidimetric immunoassay, PETIA）n膠乳增強(qiáng)免疫濁度測定（Latex enhanced turbidimetric immunoassay , LETIA ）n粒子強(qiáng)化免疫濁度測定2122serum proteins 血清蛋白類IgA（免疫球蛋白A）IgG（免疫球蛋白G）IgM（免疫球蛋白M）IgE（免疫球蛋白E）C3（補(bǔ)體C3）C4（補(bǔ)體C4）Microalbumin （微量白蛋白）2-microglobulin （ 2球蛋白）-1- acid g

10、lycoprotein （ -1酸性糖蛋白）Ferritin（鐵蛋白）Transferrin（轉(zhuǎn)鐵蛋白） 心血管疾病監(jiān)測Apo A-1（載脂蛋白A1）Apo B（載脂蛋白B）Lp(a)（脂蛋白a）h-CRP(超敏感C反應(yīng)蛋白）Homocysteine （同型半胱氨酸）D-Dimer（D二聚體）Myoglobin（肌紅蛋白）cTnI（肌鈣蛋白I）23Rheuma 風(fēng)濕病RF（類風(fēng)濕因子）ASO（抗鏈O）CRP（C-反應(yīng)蛋白）腎小球過濾率最敏感的指標(biāo)cystatin C （胱抑素C ）2425TDM治療藥物監(jiān)測Phenobarbital （苯巴比妥）Phenytoin（苯妥英納）Valproic

11、acid（丙戊酸）Carbamazepine （卡馬西平）Theophylline（茶堿）Gentamicin（慶大霉素）Digoxin（地高辛）Digitoxin（洋地黃）Vitamins維生素Vitamin B12 （維生素B12）Folate（葉酸）infectious Diseases 傳染性疾病TOXO（弓形體）RUBELLA（風(fēng)疹病毒）26R1（試劑試劑 I）: 緩沖液緩沖液R2（試劑試劑 II）: 啟動試劑啟動試劑 ( (帶或不帶乳膠顆粒帶或不帶乳膠顆粒) )STANDARDS（標(biāo)準(zhǔn)液標(biāo)準(zhǔn)液） ( (一點或多點標(biāo)準(zhǔn)一點或多點標(biāo)準(zhǔn)) )CONTROLS（質(zhì)控液質(zhì)控液）27免疫比濁法

12、試劑的組成免疫比濁法試劑的組成R R1 1緩沖液緩沖液 R R2 2啟動試劑啟動試劑 校準(zhǔn)血清校準(zhǔn)血清反應(yīng)類型（不需要乳膠）AgAb (Reagent)28反應(yīng)類型（需要乳膠）LATEX PARTICLEAg2930緩沖液: 使反應(yīng)有最大限度的敏感性使反應(yīng)有最大限度的敏感性 避免非特異的結(jié)果避免非特異的結(jié)果 降低反應(yīng)時間降低反應(yīng)時間啟動試劑: 產(chǎn)生抗原產(chǎn)生抗原-抗體反應(yīng)抗體反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)液: 建立濃度與信號（吸光度）之間的關(guān)系建立濃度與信號（吸光度）之間的關(guān)系質(zhì)控液: 檢查定標(biāo)的情況檢查定標(biāo)的情況3132nCRM 歐共體參考局（ BCR ）的認(rèn)可參考品。nCRM470是14種（血清）蛋白分析物的參考

13、制品。nCRM470基于人血清（人血清蛋白參考制備物 lot 5 ，RPPHS lot 5）的Certified Reference Materialn由以下組織共同發(fā)展： IFCC BCR Brussels CAP USA 33nCRM 470在歐洲由BCR制備提供。在美國則由美國病理協(xié)會（CAP）提供材料。n生產(chǎn)廠家用CRM470對自己的定標(biāo)液和質(zhì)控液進(jìn)行標(biāo)化。nCRM和SRM（Standard Reference Material標(biāo)準(zhǔn)參考材料）可以認(rèn)為是目前可以提供的最高質(zhì)量的材料。SRM主要用于USA（國家標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)研究院NIST）。 CRM470參考物及其參考范圍血漿蛋白質(zhì)每個CRM

14、470的參考范圍（g/L）白蛋白3552-1-抗胰蛋白酶（-1-抗胰蛋白酶抑制劑）C3C-補(bǔ)體C4-補(bǔ)體銅蘭蛋白C-反應(yīng)蛋白（CRP）-1-酸性糖蛋白（類粘蛋白）觸珠蛋白IgG716-2-巨球蛋白前白蛋白（transthyretin）轉(zhuǎn)鐵蛋白 注：C3C在新鮮樣本中可期望較低的參考范圍3435v對實驗室的生化分析儀盡可能充分的掌握并理對實驗室的生化分析儀盡可能充分的掌握并理解。解。v理解各個檢測項目的方法學(xué)原理。理解各個檢測項目的方法學(xué)原理。v仔細(xì)認(rèn)真閱讀商品化試劑的說明書。仔細(xì)認(rèn)真閱讀商品化試劑的說明書。v銷售商或者廠家技術(shù)部門的支持。銷售商或者廠家技術(shù)部門的支持?！八^生化分析儀就是將實驗

15、參數(shù)輸入儀器，由儀器按照試驗指令來完成整個試驗。參數(shù)設(shè)置，基本功在儀器之外，如果對分析化學(xué)、對酶動力學(xué)、儀器性能沒有一定的掌握，是很難設(shè)置好參數(shù)的?！?6免疫濁度法在生化分析儀上常見的測定（分析）方式FINAL POINT DFINAL - SAMPLE BLANK D - AFINAL - INITIAL D - BKINETIC (C - B)/ timeR2 (LATEX OR ANTISERA)SAMPLEAND R1 (BUFFER)TIME OD increment37測定CRP分析方式 采用雙試劑、兩步終點法采用雙試劑、兩步終點法37 5min37 5minA1A2Samplee

16、nR1R2R1R2End38Heidelberger & Kendall ExperienceExcess antibodyzone Equivalence zoneExcess antigen zoneAntigen concentration TURBIDITY ( OD )（useful zone）ABCn依據(jù)抗原抗體反應(yīng)特性，免疫比濁測量選擇在A區(qū)，IC的濁度隨著抗原的增加而增加，但不是呈線性的對應(yīng)關(guān)系（曲線往往有截距或呈S形），要得到正確的結(jié)果，必須做一個多點定標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。n自動生化分析儀多推薦5點或6點定標(biāo)，然后選擇適當(dāng)?shù)臄?shù)學(xué)模型作曲線擬合，如：Logit-Log變換；

17、y=d+cx+bx2+ax33940多點定標(biāo)：RF、CRPREAL RELATION AND CURVEOF CALIBRATIONSTRAIGHT LINE CALIBRATION(THERE IS AN ERROR)concentrationOD increment41CONCENTRATIONOD incrementREAL RELATIONSTRAIGHT LINECALIBRATION一點定標(biāo)：例如ASO校準(zhǔn)曲線的選擇和擬合效果檢驗：v選擇何種校準(zhǔn)曲線作數(shù)據(jù)處理，是試驗成功的關(guān)鍵之一。v一般用試劑廠家提供的或文獻(xiàn)介紹的校準(zhǔn)模式。v應(yīng)該對擬合曲線作檢驗和比較。42n抗原或抗體過剩使免疫復(fù)合物部分或全部解離的現(xiàn)象，稱為帶現(xiàn)象。n免疫濁度測定中常表現(xiàn)為抗原過剩時免疫復(fù)合物形成的量反而下降，又稱鉤狀效應(yīng)（hook effe