文獻(xiàn)講讀-何孟

1、何何 孟孟 2012年年12月月6號號 1研究簡介2實(shí)驗(yàn)材料和方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論與結(jié)論34目目 錄錄基于薄片的基于薄片的TEBV天然支架TEBV1986年開始使用利用活體血管細(xì)胞和天然基質(zhì)分子已有多例報道存在力學(xué)性能問題包含活的纖維母細(xì)胞和組織良好的基質(zhì)天然蛋白收獲和種植細(xì)胞花費(fèi)時間，限制應(yīng)用1.1方法比較方法比較1.2 選材及原因選材及原因AM（羊膜）（羊膜）單層上皮細(xì)胞單層上皮細(xì)胞無血管基質(zhì)無血管基質(zhì)基底膜基底膜和型膠原纖連蛋白層纖連蛋白1,5去表皮化的去表皮化的AM無無免疫源性，且它在免疫源性，且它在眼部手術(shù)，表面移眼部手術(shù)，表面移植的通暢性，已經(jīng)植的通暢性，已經(jīng)在臨床上得到驗(yàn)證在臨床上得

2、到驗(yàn)證對于促進(jìn)上皮細(xì)胞對于促進(jìn)上皮細(xì)胞粘連有重要作用粘連有重要作用以以AM為基質(zhì)的培為基質(zhì)的培養(yǎng)的養(yǎng)的EC相應(yīng)的表達(dá)相應(yīng)的表達(dá)更多的血管內(nèi)鈣連更多的血管內(nèi)鈣連蛋白和整合素蛋白和整合素種植在種植在AM上的內(nèi)皮細(xì)上的內(nèi)皮細(xì)胞（胞（EC）的選擇素）的選擇素E和選擇素和選擇素P的表達(dá)降低的表達(dá)降低（相對于在培養(yǎng)皿培（相對于在培養(yǎng)皿培養(yǎng)），相應(yīng)的其對于白養(yǎng)），相應(yīng)的其對于白血球的黏附也相應(yīng)減少血球的黏附也相應(yīng)減少AM（羊膜）（羊膜）證明戊二醛交聯(lián)的證明戊二醛交聯(lián)的AM.可以縮短可以縮短TEBV的合成時間的合成時間 并能解決內(nèi)皮細(xì)胞對于并能解決內(nèi)皮細(xì)胞對于TEBV的黏附問題的黏附問題將將AM做成管狀做成管

3、狀用戊二醛交聯(lián)用戊二醛交聯(lián)用豬血管內(nèi)皮用豬血管內(nèi)皮對材料進(jìn)行內(nèi)皮化對材料進(jìn)行內(nèi)皮化在一定時間和生物條件下在一定時間和生物條件下通過不同剪切力處理通過不同剪切力處理對細(xì)胞黏附進(jìn)行表征對細(xì)胞黏附進(jìn)行表征 戊二醛交聯(lián)戊二醛交聯(lián) 內(nèi)皮化內(nèi)皮化剪切力剪切力影響影響1.3 實(shí)驗(yàn)思路實(shí)驗(yàn)思路2.胰蛋白酶消化，刮去胰蛋白酶消化，刮去EC1.PBS無菌洗滌無菌洗滌4.繞在聚四氟乙烯棒上繞在聚四氟乙烯棒上3.無菌水沖洗，切塊無菌水沖洗，切塊6.甘氨酸中和甘氨酸中和5.戊二醛交聯(lián)戊二醛交聯(lián)8.4無菌保存無菌保存7.雙蒸水沖洗雙蒸水沖洗交聯(lián)交聯(lián)AM管管AM棒棒去上皮的去上皮的AM人的人的AMAM的獲取的獲取2.1 A

4、M的準(zhǔn)備的準(zhǔn)備 和支架制備和支架制備2.2 細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)豬動脈上皮細(xì)胞的提取（步驟同前）豬動脈上皮細(xì)胞的提?。ú襟E同前） 甘氨酸處理后，低速離心獲得細(xì)胞甘氨酸處理后，低速離心獲得細(xì)胞 M199重懸后傳代培養(yǎng)（重懸后傳代培養(yǎng)（1:3傳代）傳代） 取取P2，P3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn) 41232.3 TEBV的剪切力測試的剪切力測試1交聯(lián)的AM管內(nèi)壁種植EC密度：2105cm-22培養(yǎng)兩天，TEBV上形成單層細(xì)胞，然后放入進(jìn)行生物反應(yīng)器測試（測試時間均為四天）生物反應(yīng)器構(gòu)成生物反應(yīng)器構(gòu)成剪切力計(jì)算公式剪切力計(jì)算公式：剪切力（達(dá)因每平方厘米） 1 達(dá)因 = 10-5牛：培養(yǎng)液粘稠度 d :

5、 TEBV的內(nèi)壁直徑 Q :流速（立方厘米每秒）通過流速控制剪切力大小測試及檢驗(yàn)方法測試及檢驗(yàn)方法通過控制流速使剪切力在通過控制流速使剪切力在0.5-12達(dá)因的達(dá)因的范圍范圍培養(yǎng)培養(yǎng)2-4天，進(jìn)行免疫學(xué)和組織學(xué)檢測天，進(jìn)行免疫學(xué)和組織學(xué)檢測在靜止?fàn)顟B(tài)下，采用相同條件進(jìn)行培養(yǎng)在靜止?fàn)顟B(tài)下，采用相同條件進(jìn)行培養(yǎng)培養(yǎng)時間相同，進(jìn)行相同檢測培養(yǎng)時間相同，進(jìn)行相同檢測AM管內(nèi)細(xì)胞通過核染色進(jìn)行計(jì)數(shù)管內(nèi)細(xì)胞通過核染色進(jìn)行計(jì)數(shù)隨機(jī)抽取三個區(qū)域進(jìn)行熒光顯微計(jì)數(shù)并隨機(jī)抽取三個區(qū)域進(jìn)行熒光顯微計(jì)數(shù)并拍照拍照2.4 免疫熒光染色免疫熒光染色肌動蛋白 用 Alexa Fluor-phalloidin 染色PECAM-

6、1(血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子-1)，用小鼠抗大鼠CD31抗體結(jié)合， 再用與 與熒光蛋白結(jié)合的山羊抗小鼠IgG蛋白染色VE-鈣粘蛋白：用大鼠抗豬的CD144抗體結(jié)合，再用 德州紅共軛的山羊 抗小鼠IgG蛋白染色整合素1：小鼠抗豬整合素1的抗體結(jié)合，再用熒光蛋白結(jié)合的山羊 抗小鼠蛋白染色 細(xì)胞核：碘化丙啶染色共聚焦顯微鏡和熒光顯微鏡觀察2.5 蛋白印跡分析蛋白印跡分析EC細(xì)胞蛋白的SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)移到PVDF膜脫脂牛奶封閉小鼠抗大鼠PECAM-1抗體標(biāo)記 PECAM-1小鼠抗豬VE-鈣粘蛋白標(biāo)記 VE-鈣粘蛋白HRP（辣根過氧化物酶）結(jié)合的IgG二抗標(biāo)記顯色分析2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)分析t分

7、布檢驗(yàn)選取顯著值P0.05標(biāo)準(zhǔn)誤的方法表示結(jié)果（SEM）3.1 剪切力的影響剪切力的影響內(nèi)皮化內(nèi)皮化剪切力剪切力處理處理觀察觀察結(jié)果結(jié)果取制備好的取制備好的AM管管用豬的內(nèi)皮用豬的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行內(nèi)細(xì)胞進(jìn)行內(nèi)皮化皮化培養(yǎng)兩天培養(yǎng)兩天實(shí)驗(yàn)組用在實(shí)驗(yàn)組用在有剪切力的有剪切力的情況下培養(yǎng)情況下培養(yǎng)四天四天對照組培養(yǎng)對照組培養(yǎng)相同時間相同時間進(jìn)行核染色計(jì)進(jìn)行核染色計(jì)數(shù)數(shù)隨機(jī)抽樣計(jì)數(shù)隨機(jī)抽樣計(jì)數(shù)經(jīng)顯微觀察經(jīng)顯微觀察細(xì)胞數(shù)目細(xì)胞數(shù)目無明顯變化無明顯變化3.2 免疫熒光研究免疫熒光研究肌動蛋白和細(xì)胞核染色肌動蛋白和細(xì)胞核染色肌動蛋白：綠色肌動蛋白：綠色細(xì)胞核：紅色細(xì)胞核：紅色顯示出了細(xì)胞的方向性顯示出了細(xì)胞的方

8、向性3.2 免疫熒光研究免疫熒光研究PECAM-1和和VE-鈣粘蛋白的分布和表達(dá)分析鈣粘蛋白的分布和表達(dá)分析PECAM-1 ：藍(lán)色：藍(lán)色VE-鈣粘蛋白鈣粘蛋白：綠色：綠色PECAM-1和和VE-鈣鈣粘蛋白的分布性差粘蛋白的分布性差異異3.2 免疫熒光研究免疫熒光研究整合素整合素1的分布和表達(dá)分析的分布和表達(dá)分析整合素整合素1 ：藍(lán)色：藍(lán)色細(xì)胞核細(xì)胞核：紅色：紅色A-F顯示：靜止顯示：靜止培養(yǎng)時只在培養(yǎng)時只在AM與與EC作用面表作用面表達(dá)，剪切力影達(dá)，剪切力影響下，出現(xiàn)其響下，出現(xiàn)其在細(xì)胞間的表在細(xì)胞間的表達(dá)量達(dá)量3.3 蛋白印跡研究蛋白印跡研究分別增長分別增長729%677%3.3 蛋白印跡研

9、究蛋白印跡研究增長增長259%激活的整激活的整合素卻有合素卻有降低降低整合素整合素v3的分布和表達(dá)分析的分布和表達(dá)分析整合素整合素v3 ：藍(lán)色：藍(lán)色細(xì)胞核細(xì)胞核：紅色：紅色A-F顯示：剪切顯示：剪切力對其分布無力對其分布無影響影響整合素整合素v3的表達(dá)分析的表達(dá)分析分別增加分別增加298% 和和 5313%其中其中 P0.05AM作為作為TEBV合成材料的優(yōu)勢合成材料的優(yōu)勢AM最大承受腔內(nèi)最大承受腔內(nèi)壓力壓力300mmHg材料合成周期短材料合成周期短AM與細(xì)胞的黏附與細(xì)胞的黏附性良好，促進(jìn)黏性良好，促進(jìn)黏附因子表達(dá)附因子表達(dá)基質(zhì)凝膠蛋白存基質(zhì)凝膠蛋白存在力學(xué)性能缺陷在力學(xué)性能缺陷基于薄片的組織

10、基于薄片的組織工程相對耗時工程相對耗時PGA黏附的黏附的EC會會被血流沖刷脫落被血流沖刷脫落人工聚合物和天人工聚合物和天然基質(zhì)在移植時然基質(zhì)在移植時經(jīng)常出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)經(jīng)常出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞脫落問題胞脫落問題生物相容性已得生物相容性已得到臨床驗(yàn)證到臨床驗(yàn)證關(guān)于測得關(guān)于測得-肌動蛋白含量減少的解釋肌動蛋白含量減少的解釋但是其他黏附因子的相對含量仍但是其他黏附因子的相對含量仍有升高有升高-肌動蛋白含量顯示較少肌動蛋白含量顯示較少剪切力處理提高了剪切力處理提高了PECAM-1和和VE-鈣粘蛋白的表達(dá)量鈣粘蛋白的表達(dá)量剪切力處理剪切力處理剪切力處理后，剪切力處理后，EC比較難從比較難從AM上用解上用解離下來，需要

11、更長離下來，需要更長的解離時間。同時的解離時間。同時解離出來的細(xì)胞可解離出來的細(xì)胞可能含有能含有AM的成分的成分并可能稀釋了并可能稀釋了-肌肌動蛋白動蛋白種有種有EC的的TEBV在剪切力作用下形在剪切力作用下形成了仿天然血管的細(xì)胞連接網(wǎng)絡(luò)成了仿天然血管的細(xì)胞連接網(wǎng)絡(luò).EC的方向性利于連接蛋白的表達(dá)的方向性利于連接蛋白的表達(dá)，并促進(jìn)，并促進(jìn)EC的生長和成熟的生長和成熟可以提前制備并儲存，減少制備移可以提前制備并儲存，減少制備移植體所花的時間植體所花的時間已在眼科診所中廣泛使用，生物相已在眼科診所中廣泛使用，生物相容性問題已得到驗(yàn)證容性問題已得到驗(yàn)證AMn TEBV移植后的平滑肌細(xì)胞的遷移和重塑成型過程 因?yàn)橐浦财交〖?xì)胞可以增加TEBV的