文獻講讀-何孟

1、何何 孟孟 2012年年12月月6號號 1研究簡介2實驗材料和方法實驗結果討論與結論34目目 錄錄基于薄片的基于薄片的TEBV天然支架TEBV1986年開始使用利用活體血管細胞和天然基質分子已有多例報道存在力學性能問題包含活的纖維母細胞和組織良好的基質天然蛋白收獲和種植細胞花費時間，限制應用1.1方法比較方法比較1.2 選材及原因選材及原因AM（羊膜）（羊膜）單層上皮細胞單層上皮細胞無血管基質無血管基質基底膜基底膜和型膠原纖連蛋白層纖連蛋白1,5去表皮化的去表皮化的AM無無免疫源性，且它在免疫源性，且它在眼部手術，表面移眼部手術，表面移植的通暢性，已經植的通暢性，已經在臨床上得到驗證在臨床上得

2、到驗證對于促進上皮細胞對于促進上皮細胞粘連有重要作用粘連有重要作用以以AM為基質的培為基質的培養(yǎng)的養(yǎng)的EC相應的表達相應的表達更多的血管內鈣連更多的血管內鈣連蛋白和整合素蛋白和整合素種植在種植在AM上的內皮細上的內皮細胞（胞（EC）的選擇素）的選擇素E和選擇素和選擇素P的表達降低的表達降低（相對于在培養(yǎng)皿培（相對于在培養(yǎng)皿培養(yǎng)），相應的其對于白養(yǎng)），相應的其對于白血球的黏附也相應減少血球的黏附也相應減少AM（羊膜）（羊膜）證明戊二醛交聯的證明戊二醛交聯的AM.可以縮短可以縮短TEBV的合成時間的合成時間 并能解決內皮細胞對于并能解決內皮細胞對于TEBV的黏附問題的黏附問題將將AM做成管狀做成管

3、狀用戊二醛交聯用戊二醛交聯用豬血管內皮用豬血管內皮對材料進行內皮化對材料進行內皮化在一定時間和生物條件下在一定時間和生物條件下通過不同剪切力處理通過不同剪切力處理對細胞黏附進行表征對細胞黏附進行表征 戊二醛交聯戊二醛交聯 內皮化內皮化剪切力剪切力影響影響1.3 實驗思路實驗思路2.胰蛋白酶消化，刮去胰蛋白酶消化，刮去EC1.PBS無菌洗滌無菌洗滌4.繞在聚四氟乙烯棒上繞在聚四氟乙烯棒上3.無菌水沖洗，切塊無菌水沖洗，切塊6.甘氨酸中和甘氨酸中和5.戊二醛交聯戊二醛交聯8.4無菌保存無菌保存7.雙蒸水沖洗雙蒸水沖洗交聯交聯AM管管AM棒棒去上皮的去上皮的AM人的人的AMAM的獲取的獲取2.1 A

4、M的準備的準備 和支架制備和支架制備2.2 細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)豬動脈上皮細胞的提?。ú襟E同前）豬動脈上皮細胞的提?。ú襟E同前） 甘氨酸處理后，低速離心獲得細胞甘氨酸處理后，低速離心獲得細胞 M199重懸后傳代培養(yǎng)（重懸后傳代培養(yǎng)（1:3傳代）傳代） 取取P2，P3代細胞進行實驗代細胞進行實驗 41232.3 TEBV的剪切力測試的剪切力測試1交聯的AM管內壁種植EC密度：2105cm-22培養(yǎng)兩天，TEBV上形成單層細胞，然后放入進行生物反應器測試（測試時間均為四天）生物反應器構成生物反應器構成剪切力計算公式剪切力計算公式：剪切力（達因每平方厘米） 1 達因 = 10-5牛：培養(yǎng)液粘稠度 d :

5、 TEBV的內壁直徑 Q :流速（立方厘米每秒）通過流速控制剪切力大小測試及檢驗方法測試及檢驗方法通過控制流速使剪切力在通過控制流速使剪切力在0.5-12達因的達因的范圍范圍培養(yǎng)培養(yǎng)2-4天，進行免疫學和組織學檢測天，進行免疫學和組織學檢測在靜止狀態(tài)下，采用相同條件進行培養(yǎng)在靜止狀態(tài)下，采用相同條件進行培養(yǎng)培養(yǎng)時間相同，進行相同檢測培養(yǎng)時間相同，進行相同檢測AM管內細胞通過核染色進行計數管內細胞通過核染色進行計數隨機抽取三個區(qū)域進行熒光顯微計數并隨機抽取三個區(qū)域進行熒光顯微計數并拍照拍照2.4 免疫熒光染色免疫熒光染色肌動蛋白 用 Alexa Fluor-phalloidin 染色PECAM-

6、1(血小板內皮細胞黏附因子-1)，用小鼠抗大鼠CD31抗體結合， 再用與 與熒光蛋白結合的山羊抗小鼠IgG蛋白染色VE-鈣粘蛋白：用大鼠抗豬的CD144抗體結合，再用 德州紅共軛的山羊 抗小鼠IgG蛋白染色整合素1：小鼠抗豬整合素1的抗體結合，再用熒光蛋白結合的山羊 抗小鼠蛋白染色 細胞核：碘化丙啶染色共聚焦顯微鏡和熒光顯微鏡觀察2.5 蛋白印跡分析蛋白印跡分析EC細胞蛋白的SDS-PAGE電泳轉移到PVDF膜脫脂牛奶封閉小鼠抗大鼠PECAM-1抗體標記 PECAM-1小鼠抗豬VE-鈣粘蛋白標記 VE-鈣粘蛋白HRP（辣根過氧化物酶）結合的IgG二抗標記顯色分析2.6 統(tǒng)計學分析統(tǒng)計學分析t分

7、布檢驗選取顯著值P0.05標準誤的方法表示結果（SEM）3.1 剪切力的影響剪切力的影響內皮化內皮化剪切力剪切力處理處理觀察觀察結果結果取制備好的取制備好的AM管管用豬的內皮用豬的內皮細胞進行內細胞進行內皮化皮化培養(yǎng)兩天培養(yǎng)兩天實驗組用在實驗組用在有剪切力的有剪切力的情況下培養(yǎng)情況下培養(yǎng)四天四天對照組培養(yǎng)對照組培養(yǎng)相同時間相同時間進行核染色計進行核染色計數數隨機抽樣計數隨機抽樣計數經顯微觀察經顯微觀察細胞數目細胞數目無明顯變化無明顯變化3.2 免疫熒光研究免疫熒光研究肌動蛋白和細胞核染色肌動蛋白和細胞核染色肌動蛋白：綠色肌動蛋白：綠色細胞核：紅色細胞核：紅色顯示出了細胞的方向性顯示出了細胞的方

8、向性3.2 免疫熒光研究免疫熒光研究PECAM-1和和VE-鈣粘蛋白的分布和表達分析鈣粘蛋白的分布和表達分析PECAM-1 ：藍色：藍色VE-鈣粘蛋白鈣粘蛋白：綠色：綠色PECAM-1和和VE-鈣鈣粘蛋白的分布性差粘蛋白的分布性差異異3.2 免疫熒光研究免疫熒光研究整合素整合素1的分布和表達分析的分布和表達分析整合素整合素1 ：藍色：藍色細胞核細胞核：紅色：紅色A-F顯示：靜止顯示：靜止培養(yǎng)時只在培養(yǎng)時只在AM與與EC作用面表作用面表達，剪切力影達，剪切力影響下，出現其響下，出現其在細胞間的表在細胞間的表達量達量3.3 蛋白印跡研究蛋白印跡研究分別增長分別增長729%677%3.3 蛋白印跡研

9、究蛋白印跡研究增長增長259%激活的整激活的整合素卻有合素卻有降低降低整合素整合素v3的分布和表達分析的分布和表達分析整合素整合素v3 ：藍色：藍色細胞核細胞核：紅色：紅色A-F顯示：剪切顯示：剪切力對其分布無力對其分布無影響影響整合素整合素v3的表達分析的表達分析分別增加分別增加298% 和和 5313%其中其中 P0.05AM作為作為TEBV合成材料的優(yōu)勢合成材料的優(yōu)勢AM最大承受腔內最大承受腔內壓力壓力300mmHg材料合成周期短材料合成周期短AM與細胞的黏附與細胞的黏附性良好，促進黏性良好，促進黏附因子表達附因子表達基質凝膠蛋白存基質凝膠蛋白存在力學性能缺陷在力學性能缺陷基于薄片的組織

10、基于薄片的組織工程相對耗時工程相對耗時PGA黏附的黏附的EC會會被血流沖刷脫落被血流沖刷脫落人工聚合物和天人工聚合物和天然基質在移植時然基質在移植時經常出現內皮細經常出現內皮細胞脫落問題胞脫落問題生物相容性已得生物相容性已得到臨床驗證到臨床驗證關于測得關于測得-肌動蛋白含量減少的解釋肌動蛋白含量減少的解釋但是其他黏附因子的相對含量仍但是其他黏附因子的相對含量仍有升高有升高-肌動蛋白含量顯示較少肌動蛋白含量顯示較少剪切力處理提高了剪切力處理提高了PECAM-1和和VE-鈣粘蛋白的表達量鈣粘蛋白的表達量剪切力處理剪切力處理剪切力處理后，剪切力處理后，EC比較難從比較難從AM上用解上用解離下來，需要

11、更長離下來，需要更長的解離時間。同時的解離時間。同時解離出來的細胞可解離出來的細胞可能含有能含有AM的成分的成分并可能稀釋了并可能稀釋了-肌肌動蛋白動蛋白種有種有EC的的TEBV在剪切力作用下形在剪切力作用下形成了仿天然血管的細胞連接網絡成了仿天然血管的細胞連接網絡.EC的方向性利于連接蛋白的表達的方向性利于連接蛋白的表達，并促進，并促進EC的生長和成熟的生長和成熟可以提前制備并儲存，減少制備移可以提前制備并儲存，減少制備移植體所花的時間植體所花的時間已在眼科診所中廣泛使用，生物相已在眼科診所中廣泛使用，生物相容性問題已得到驗證容性問題已得到驗證AMn TEBV移植后的平滑肌細胞的遷移和重塑成型過程 因為移植平滑肌細胞可以增加TEBV的