核酸化學實驗技術導學

1、生化實驗技術 第一講 核酸化學實驗技術 第二講 蛋白質(zhì)化學實驗技術 第三講 酶學實驗技術 第四講 糖類化學實驗技術 第五講 脂類化學實驗技術 第六講 維生素和輔酶化學實驗技術實驗授課內(nèi)容課堂理論：課前輔導生化大分子基本性質(zhì)、提取、分離純化、含量檢測等相關生化物質(zhì)的分離分析技術。項目任務：設計案例，引導學生去解決案例問題的方式向學生布置項目任務、實驗設計和實施要求。實驗設計：學生分組查閱資料設計實驗方案網(wǎng)上遞交教師修改及審核大組討論評價實驗操作：各小組（2人）為單位進行實驗試劑、器材的準備，按實驗設計完成實驗內(nèi)容操作。實驗論文：根據(jù)任務要求，每位學生獨立完成課程論文。課堂討論：大組為單位進行全班

2、ppt形式交流匯報實驗實施流程課程內(nèi)容課程內(nèi)容學時綜合訓練內(nèi)容綜合訓練內(nèi)容理論輔導與實驗設計評價2實驗設計要求，實驗設計要求，DNA提取與鑒定提取與鑒定技術，案例引導，項目任務發(fā)布；技術，案例引導，項目任務發(fā)布；學生設計方案評價交流學生設計方案評價交流實驗1 基因組DNA的提取與PCR鑒定16基因組基因組DNA提取提取DNA含量和純度測定含量和純度測定DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR及產(chǎn)物檢測及產(chǎn)物檢測 課堂研討2實驗過程總結，實驗成果、創(chuàng)新實驗過程總結，實驗成果、創(chuàng)新技術分享，教師點評和總結技術分享，教師點評和總結 第一講 核酸化學實驗技術案例1 目前，人們的生活中充斥了越來

3、越多的轉基因產(chǎn)品，目前，人們的生活中充斥了越來越多的轉基因產(chǎn)品，如轉基因大豆、轉基因棉花、轉基因玉米、馬鈴薯、如轉基因大豆、轉基因棉花、轉基因玉米、馬鈴薯、水稻等等。水稻等等。 轉基因作為一種新興的生物技術手段，它的不成熟轉基因作為一種新興的生物技術手段，它的不成熟和不確定性，使得和不確定性，使得轉基因食品的安全性成為人們關轉基因食品的安全性成為人們關注的焦點注的焦點。 問題：如何檢測轉基因食品？第一節(jié) 實驗項目發(fā)布與設計方案評價什么是轉基因食品？ 轉基因食品：以轉基因食品：以轉基因生物轉基因生物為直接食品或為原料加為直接食品或為原料加工生產(chǎn)的食品。工生產(chǎn)的食品。 轉基因食品利用現(xiàn)代分子生物技

4、術，將某些生物的轉基因食品利用現(xiàn)代分子生物技術，將某些生物的基因轉移到其他物種基因轉移到其他物種中去，改造生物的遺傳物質(zhì)，中去，改造生物的遺傳物質(zhì)，使其在形狀、營養(yǎng)品質(zhì)、消費品質(zhì)等方面向人們所使其在形狀、營養(yǎng)品質(zhì)、消費品質(zhì)等方面向人們所需要的目標轉變。需要的目標轉變。 轉基因育種的程序？標記基因 啟動子 外源目的基因 終止序列載體的構建轉基因食品的核酸檢測技術 檢測對象檢測對象：轉基因的啟動子、終止子、抗性篩選：轉基因的啟動子、終止子、抗性篩選基因、目的基因等外源基因基因、目的基因等外源基因 檢測方法檢測方法：普通定性：普通定性PCR、實時熒光定量、實時熒光定量PCR、基因芯片基因芯片 其中以

5、普通定性其中以普通定性PCR、實時熒光定量、實時熒光定量PCR最常用。最常用。核酸定性PCR法檢測轉基因食品 樣品基因組DNA的提取 DNA提取質(zhì)量檢測 特有序列的PCR 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物 進一步驗證：測序、PCR產(chǎn)物酶切鑒定、實時熒光定量PCR方法等一般步驟核酸定性PCR法檢測轉基因食品案例2 某實驗人員從土壤中分離篩選出一株產(chǎn)植酸酶的菌株，某實驗人員從土壤中分離篩選出一株產(chǎn)植酸酶的菌株，經(jīng)形態(tài)學和生理生化特性初步鑒定為真菌。經(jīng)形態(tài)學和生理生化特性初步鑒定為真菌。 真菌種類繁多，地球上大約存在真菌種類繁多，地球上大約存在150150萬種真菌，已經(jīng)萬種真菌，已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)和運用的大約有

6、被發(fā)現(xiàn)和運用的大約有6900069000種。種。 生物遺傳物質(zhì)攜帶了物種的特異信息，在屬種間具有高度的保守性。因此，可應用分子生物學鑒定手段對真菌進行種類鑒定和系統(tǒng)分類。 問題：如何準確鑒定其種屬 ？圖1 真菌rDNA轉錄區(qū)和相關引物l真核生物基因組中編碼核糖體的基因包括28S、5S、18S和5.8S rDNA 4種，在染色體上頭尾相連，串聯(lián)排列，相互間由間隔區(qū)分隔。l18S、5.8S和28S rDNA基因組成一個轉錄單元（圖1），三者高度保守，適合較高等級水平生物群體間的系統(tǒng)分析。l其間的間隔區(qū)為內(nèi)轉錄間隔區(qū)（Internal Transcribed Spacer，ITS），包括ITS1和I

7、TS2，進化相對迅速，具有多態(tài)性，適合較低等級水平的系統(tǒng)學研究。18S rDNA5.8S rDNA28S rDNA53ITS1ITS2ITS1 primerITS2 primerITS3 primerITS4 primer 設計特定引物對該真菌菌株中的基因組中的設計特定引物對該真菌菌株中的基因組中的rDNA轉錄區(qū)的特定核苷酸片段進行轉錄區(qū)的特定核苷酸片段進行PCR擴增，擴增，通過對所獲得的通過對所獲得的PCR產(chǎn)物進行測序分析，與已知產(chǎn)物進行測序分析，與已知真菌序列比對即可確定該菌株在系統(tǒng)分類學上的真菌序列比對即可確定該菌株在系統(tǒng)分類學上的位置。位置?；趓DNA-ITS序列在真菌分子鑒定中的應

8、用，你如何獲得高質(zhì)量的基因組DNA并鑒定菌株的目的基因序列？ PrimerSequence（5- 3）Length(bp)ITS1TCCGTAGGTGAACCTGCGG19ITS2GCTGCGTTCTTCATCGATGC20ITS3GCATCGATGAAGAACGCAGC20ITS4TCCTCCGCTTATTGATATGC20表1 真菌rDNA-ITS通用擴增引物18S rDNA5.8S rDNA28S rDNA53ITS1ITS2ITS1 primerITS2 primerITS3 primerITS4 primer圖1 真菌rDNA轉錄區(qū)和相關引物真菌rDNA-ITS通用引物實驗設計要求：

9、 根據(jù)案例提交一個具體解決基因組提取及分離鑒定的實驗設計方案，包括從提供的不同材料中提取、分離得到基因組DNA，測定所得DNA的含量、純度及分子大小，并利用已知引物進行PCR擴增，分析PCR檢測的結果。 實驗題目： 基因組DNA的提取與PCR鑒定實驗項目與任務布置分組題目 項目1：定性PCR法檢測轉基因食品 項目2：rDNA-ITS擴增法鑒定真菌種類全班分成4大組，各選一個題目。每個大組3個小組，2名同學一個小組。以大組為單位進行實驗準備和討論。以小組為單位進行實驗設計和操作。實驗目標l學習從各種材料（動物、植物組織、微生物）中提取和純化DNA的原理和操作技術。 l學習水平式瓊脂糖凝膠電泳及紫

10、外檢測，確定DNA的純度、含量與分子大小。l學習PCR的基本原理和操作方法。l掌握高速冷凍離心機、微量移液槍、水平電泳儀、PCR儀等儀器設備的使用。實驗設計需包含的主要技術內(nèi)容 基因組DNA提?。嚎蛇x用濃鹽法、陰離子去污劑法、苯酚抽提法、水抽提法、試劑盒法等 DNA含量測定：可選用二苯胺法、紫外分光光度法等 DNA純度測定：紫外分光光度法 DNA分子大小測定：瓊脂糖凝膠電泳 PCR技術實驗結果要求l各標準曲線l基因組DNA產(chǎn)品得率（mg/100g)l基因組DNA產(chǎn)品純度l基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖lPCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖lPCR產(chǎn)物分子大?。╞p）l檢測結論 基因組DNA提取 4學時 D

11、NA的含量與純度測定 4學時 DNA的瓊脂糖凝膠電泳 4學時 PCR及產(chǎn)物檢測 4學時實驗時間安排實驗時間安排課后研討題 1.DNA提取的方法主要有哪些？并說明各方法的原理。 2.結合本人實驗操作的體會，試述在提取過程中應如何避免大分子DNA的降解和斷裂？ 3.查閱資料，說明提取的基因組DNA有哪些方面的用途？ 4.查閱資料，舉例說明DNA瓊脂糖凝膠電泳的應用和發(fā)展。 5.瓊脂糖凝膠電泳所用DNA染料EB具有潛在的致癌性，查閱資料，查找可替代EB的染料并說明優(yōu)缺點。課后研討題 6.結合本次實驗，說明PCR技術的主要用途和發(fā)展。 7.通過本次實驗，談談你對轉基因食品安全性的認識。 8.查閱資料，

12、說明轉基因食品檢測的常規(guī)方法。 9.查閱資料，綜述常用的物種分子鑒定技術。 10.案例分析：在美國海豹突擊隊擊斃本拉登幾個小時后，美國總統(tǒng)奧巴馬向全世界宣布拉登已被成功擊斃，死者確定為本拉登的可能性是99.9%。查閱資料，根據(jù)所學核酸分子鑒定技術，分析如何對其進行法醫(yī)鑒定。 相關事項相關事項 實驗習慣 藥品配制與保存 實驗記錄 實驗交流 實驗論文材料名稱材料名稱份份 數(shù)數(shù)分值分值實驗設計方案實驗設計方案115%實驗記錄實驗記錄110%實驗論文實驗論文250%課后研討題課后研討題210%匯報匯報ppt115%小組上交材料論文格式模板研討課要求 以大組為單位課后總結結果，討論，制作一份ppt，課內(nèi)

13、討論匯報。 ppt內(nèi)容包括：實驗背景和目的，實驗主要原理，實驗條件的選擇，各小組實驗結果和分析，課后研討題，實驗體會等。 l基因組是指細胞內(nèi)遺傳信息的攜帶者DNA的總體。l為了研究DNA分子在生命代謝中的作用，常常需要從不同的生物材料中提取DNA。由于DNA分子在生物體內(nèi)的分布及含量不同，要選擇適當?shù)牟牧咸崛NA。l 從各種材料中提取DNA方法不同，分離提取的難易程度也不同。真核生物的DNA主要存在于細胞核中，與蛋白質(zhì)結合構成染色體，原核生物的DNA不與任何蛋白質(zhì)結合。理論介紹一、內(nèi)容提要 保持基因組DNA結構相對完整：防止各種因素引起的降解。 純度高：盡量排除其他大分子成分的污染（蛋白質(zhì)、

14、多糖和RNA等）。 得率好：選用合適的方法獲得足夠量的DNA。二、分離純化核酸的總原則三、基因組三、基因組DNADNA提取的原理和方法提取的原理和方法裂解細胞，釋放DNA核酸分離純化沉淀并吸附核酸核酸溶解（緩沖液）準備適宜的材料去除蛋白質(zhì)、RNA等雜質(zhì)細胞破碎細胞破碎 細菌溶菌酶（降解細胞壁），EDTA（抑制DNA酶，防止DNA降解），去垢劑SDS（破壞細胞膜） 酵母破壁酶或液氮研磨 植物材料液氮研磨（使細胞凍結，用研缽碾制成粉狀） 動物組織勻漿或液氮研磨 化學法、機械法、生物法DNA與蛋白質(zhì)的分離 SDS：真核生物的DNA與組蛋白結合形成DNP，SDS能夠破壞DNA與蛋白質(zhì)之間的靜電引力或配

15、位鍵，可使DNA與蛋白質(zhì)解聚，釋放出DNA。 CTAB：是一種陽離子去污劑，可溶解細胞膜，能與核酸形成復合物，在高鹽溶液（NaCl0.7M）中是可溶的，當NaCl降低到0.3M 時，可沉淀CTAB-核酸復合物。 苯酚-氯仿-異戊醇：苯酚、氯仿能變性蛋白質(zhì)，離心分層，DNA溶于上層水相，變性蛋白質(zhì)位于水相和有機相之間。異戊醇可減少抽提過程的泡沫產(chǎn)生。1.DNP中DNA與蛋白質(zhì)的分離2.蛋白質(zhì)的去除核酸分離純化RNA的去除 用不含DNA酶的RNase處理，使RNA降解。 添加RNase處理后，可再用等量的苯酚/氯仿抽提，離心除去蛋白質(zhì)及寡核苷酸。核酸分離純化 含DNA的水相可用1倍體積的異丙醇或2

16、倍體積的無水乙醇沉淀。 基因組的大分子DNA沉淀形成纖維狀絮團漂浮其中，可用吸頭將其挑出，而小分子DNA則只形成顆粒狀沉淀附在壁上及底部。 如果DNA沉淀量少或無法撈出，可離心獲取沉淀。 沉淀DNA前，為提高沉淀效果，可加入NaAC、乙酸銨等鹽類促進沉淀。 獲取的沉淀需再用70%乙醇洗滌除去殘留的有機物、無機鹽等。沉淀并吸附核酸基因組基因組DNADNA提取注意事項提取注意事項 使用新鮮、幼嫩的材料；材料應適量，過少造成核酸提取量少，過多影響裂解，導致DNA量少。（推薦0.2-5g）。 簡化操作步驟，縮短提取過程，避免物理、化學和生物的因素對核酸的降解，如機械剪切力、高溫和DNase等酶，防止過

17、酸、過堿，避免劇烈振蕩和混合。 采用酚-氯仿抽提時應采用上下顛倒的方法充分混勻，但動作要輕柔，離心分離兩相時，應保證一定的轉速和時間。 沉淀DNA用的異戊醇、乙醇事先放入-20冰箱，待用時取出。特別注意特別注意 液氮研磨時為防止凍傷，需戴棉線手套操作，研磨越細越好。 苯酚腐蝕性極強，并可引起嚴重灼傷，操作時應戴手套。 一定要搞清提取原理，知道每一步操作DNA所在的位置，防止出錯。四、基因組DNA的檢測1、二苯胺顯色法測定DNA濃度 二苯胺法定量測定DNA的原理為：在強酸、加熱條件下，可以使DNA中的嘌呤堿基與脫氧核糖間的糖苷鍵斷裂，產(chǎn)生嘌呤堿基、脫氧核糖與嘧啶核苷酸。其中，2-脫氧核糖在酸性環(huán)

18、境中成為w-羥基-r-酮基戊醛，此物與二苯胺反應生成藍色化合物，在595nm處有最大吸收。DNA在40-400ug范圍內(nèi)光吸收值與DNA含量成正比。 詳見教材：實驗二十二 二苯胺顯色法測定DNA濃度2、紫外分光光度法測定DNA含量 核酸、核苷酸及其衍生物都具有共軛雙鍵，具有紫外吸收。DNA的紫外吸收峰為260nm。一般在260nm波長下，在pH7.0時每毫升含1g DNA溶液的光吸收值約為0.020。故測定待測DNA溶液260nm的光吸收值即可計算出其中核酸的含量。此法操作簡便，迅速。詳見實驗課件：核酸定量測定3、紫外分光光度法測定DNA純度 當DNA樣品中含有蛋白質(zhì)、酚或其他小分子污染物時，

19、會影響DNA吸光度的準確測定。DNA純度的判斷根據(jù)OD260/OD280值判斷，符合要求、純度高的純化DNA其比值為1.8。如果樣品中污染有蛋白質(zhì)或酚，其OD260/OD280將明顯低于此值。此時無法對樣品中的核酸進行精確定量。4、瓊脂糖凝膠電泳法測定DNA分子大小 電泳電泳是荷電溶質(zhì)或粒子在電場作用下發(fā)生定向泳動的現(xiàn)象。核酸的分離和鑒定通常采用瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳。 不同大小大小、不同形狀形狀和不同構象構象的DNA 分子在相同的電泳條件下（如凝膠濃度、電流、電壓、緩沖液等），有不同的遷移率，所以可通過電泳使其分離。瓊脂糖凝膠電泳分離后的DNA可用溴化乙啶溴化乙啶（EB）染色。詳見實驗

20、課件：DNA的瓊脂糖凝膠電泳五、PCR檢測技術 聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction, PCR），是一種選擇性的體外擴增DNA或RNA的分子生物學技術。 PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。 PCR由變性、退火、延伸三個基本反應步驟構成： 模板DNADNA的變性：模板DNADNA經(jīng)加熱至9494左右一定時間后，使模板DNADNA雙鏈或經(jīng)PCRPCR擴增形成的雙鏈DNADNA解離，成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備； 模板DNADNA與引物的退火：模板DNADNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至5050

21、左右，引物與模板DNADNA單鏈的互補序列配對結合； 引物的延伸：DNADNA模板引物結合物在TaqDNATaqDNA聚合酶的作用下，以dNTPdNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基互補配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNADNA鏈互補的半保留復制鏈。 PCR反應示意圖 重復循環(huán)：變性退火延伸這三個過程就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。 每完成一個循環(huán)需24分鐘，23小時就能將待擴增目的基因擴增放大幾百萬倍。 PCR動畫演示 第一講 核酸化學實驗技術 第二講 蛋白質(zhì)化學實驗技術 第三講 酶學實驗技術 第四講 糖類化學實驗技術 第五講 脂類化學實驗技術

22、 第六講 維生素和輔酶化學實驗技術實驗授課內(nèi)容課堂理論：課前輔導生化大分子基本性質(zhì)、提取、分離純化、含量檢測等相關生化物質(zhì)的分離分析技術。項目任務：設計案例，引導學生去解決案例問題的方式向學生布置項目任務、實驗設計和實施要求。實驗設計：學生分組查閱資料設計實驗方案網(wǎng)上遞交教師修改及審核大組討論評價實驗操作：各小組（2人）為單位進行實驗試劑、器材的準備，按實驗設計完成實驗內(nèi)容操作。實驗論文：根據(jù)任務要求，每位學生獨立完成課程論文。課堂討論：大組為單位進行全班ppt形式交流匯報實驗實施流程案例2 某實驗人員從土壤中分離篩選出一株產(chǎn)植酸酶的菌株，某實驗人員從土壤中分離篩選出一株產(chǎn)植酸酶的菌株，經(jīng)形態(tài)

23、學和生理生化特性初步鑒定為真菌。經(jīng)形態(tài)學和生理生化特性初步鑒定為真菌。 真菌種類繁多，地球上大約存在真菌種類繁多，地球上大約存在150150萬種真菌，已經(jīng)萬種真菌，已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)和運用的大約有被發(fā)現(xiàn)和運用的大約有6900069000種。種。 生物遺傳物質(zhì)攜帶了物種的特異信息，在屬種間具有高度的保守性。因此，可應用分子生物學鑒定手段對真菌進行種類鑒定和系統(tǒng)分類。 問題：如何準確鑒定其種屬 ？圖1 真菌rDNA轉錄區(qū)和相關引物l真核生物基因組中編碼核糖體的基因包括28S、5S、18S和5.8S rDNA 4種，在染色體上頭尾相連，串聯(lián)排列，相互間由間隔區(qū)分隔。l18S、5.8S和28S rDNA基因組成一個轉錄單元（圖1），三者高度保守，適合較高等級水平生物群體間的系統(tǒng)分析。l其間的間隔區(qū)為內(nèi)轉錄間隔區(qū)（Internal Transcribed Spacer，ITS），包括ITS1和ITS2，進化