海洋生物活性物質(zhì)-活性蛋白、肽、氨基酸

1、 魚精蛋白魚精蛋白是存在于許多魚類的成熟精是存在于許多魚類的成熟精細(xì)胞中的一種堿性蛋白，分子量較小，大細(xì)胞中的一種堿性蛋白，分子量較小，大約為約為400010000400010000，精氨酸精氨酸占其氨基酸組成占其氨基酸組成的三分之二以上的三分之二以上 1、魚精蛋白 魚精蛋白的結(jié)構(gòu)魚精蛋白的結(jié)構(gòu) 魚精蛋白的結(jié)構(gòu)因魚種不同而有差異，但魚精蛋白的結(jié)構(gòu)因魚種不同而有差異，但是它們存在許多相似的特征，如是它們存在許多相似的特征，如N-N-端均為精氨端均為精氨酸或者丙氨酸，各種魚精蛋白分子肽鏈中都含酸或者丙氨酸，各種魚精蛋白分子肽鏈中都含有有4 4個較長的和個較長的和2 2個較短的個較短的精氨酸簇精氨酸

2、簇，并且分別，并且分別被特征性的殘基被特征性的殘基SerSer或或ThrThr，Pro-IlePro-Ile，Gly-GlyGly-Gly或或Val-ValVal-Val分隔開。以鮭魚魚精蛋白為例，其分隔開。以鮭魚魚精蛋白為例，其氨基酸的序列如下：氨基酸的序列如下： Pro-Arg-Arg-Arg-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg-Pro-Val-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Pro-Arg-Val-Ser-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Gly-Gly-Arg-Arg-Arg-Arg 菌菌 種種 鯡精蛋白鯡精蛋白 鮭精蛋白鮭精蛋白 Pseudomonas fl

3、uorescensSerratiamarcesensProteus morganiiEscherichia coliSalmonella enteritidisVibrio parahaemolyticusEnterobacter areogenesStaphylococcus aureusBacillus coagulans - - - - + + + - - - + + + 產(chǎn)氣腸桿菌金色葡萄球菌芽孢型乳酸菌C菌1931年年McClean首先報道了魚首先報道了魚精蛋白具有抑菌活性精蛋白具有抑菌活性菌菌 種種鯡精蛋白鯡精蛋白鮭精蛋白鮭精蛋白BMegaterium：巨大芽孢桿菌巨大芽孢桿菌 B

4、Licheniformis：地衣芽孢地衣芽孢 BSubtilisruberBSubtilis niger枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌 B.Subtilis mesentericus馬鈴薯芽孢桿菌馬鈴薯芽孢桿菌 Lactobacillus plantarum胚芽乳桿菌胚芽乳桿菌 Lactobacillus casei干酪乳桿菌干酪乳桿菌 Streptococcus faecalis糞鏈球菌糞鏈球菌 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 小鼠急性毒性實驗、蓄積毒性實驗、小鼠骨髓小鼠急性毒性實驗、蓄積毒性實驗、小鼠骨髓微核實驗、小鼠睪丸染色體畸變

5、實驗等的結(jié)果表微核實驗、小鼠睪丸染色體畸變實驗等的結(jié)果表明，魚精蛋白的明，魚精蛋白的LD5010g/kg，蓄積系數(shù)，蓄積系數(shù)K 5 ，對雄性小鼠骨髓微核率沒有增加作用，對小鼠睪對雄性小鼠骨髓微核率沒有增加作用，對小鼠睪丸初級精母細(xì)胞染色體沒有致畸作用。采用丸初級精母細(xì)胞染色體沒有致畸作用。采用Ames法對魚精蛋白的致突變性進(jìn)行了試驗，也未法對魚精蛋白的致突變性進(jìn)行了試驗，也未 發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)其具有致突變作用。其具有致突變作用。（1）來源 藍(lán) 藻 （ C y a n o p h y c e a e ） 、 紅 藻（Rhodophyceae）、隱藻（Cryptophyceae）和少數(shù)一些甲藻（Pyrro

6、phyceae）中，它是藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白、藻紅藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白的總稱。按照光譜類型來分類，藻膽蛋白則可以分為六大類：異藻藍(lán)蛋白B（APB）、異藻藍(lán)蛋白（AP）、藻藍(lán)蛋白（PC）、藻紅藍(lán)蛋白（PEC）、藻紅蛋白I（PE I）和藍(lán)藻中含藻尿膽素的藻紅蛋白（PE）。2、藻膽蛋白l螺旋藻的藻藍(lán)蛋白l紫球藻的B-藻紅蛋白l鹵腥藻和念珠藻的C-藻藍(lán)蛋白微藻藻膽蛋白的研究尤為重要l比如藻藍(lán)蛋白在可見光區(qū)620nm的吸收與紫外光區(qū)280nm的吸收之比大于4.5，而異藻藍(lán)蛋白在可見光區(qū)650nm的吸收與紫外光區(qū)280nm的吸收之比大于4.0。（2）藻膽蛋白分子的組成 藻膽蛋白是由脫輔基蛋白（載體蛋白）和四吡

7、咯結(jié)構(gòu)的色基（發(fā)色團(tuán)）藻膽素所組成。發(fā)現(xiàn)所有的色基均是與多肽鏈中的半胱氨酸殘基以硫醚鍵共價結(jié)合，結(jié)合的方式分別是通過色基的A環(huán)或者D環(huán)單鏈相連，也有的色基A環(huán)和D環(huán)同時與脫輔基蛋白相連。在藻膽蛋白的色基色基分為：藻紅膽素（PEB）、藻藍(lán)膽素（PCB）、藻尿膽素（PUB）。（3）主要特點藻膽蛋白是一種古老的捕光色素蛋白質(zhì)。組成藻膽蛋白的氨基酸發(fā)生了一些特異性修飾，使之免遭蛋白酶的水解。蛋白質(zhì)的一種保護(hù)機(jī)制蛋白質(zhì)的一種保護(hù)機(jī)制（4）生理活性1、R-R-藻紅蛋白藻紅蛋白可以和胰島素抗體產(chǎn)生特異的免疫反應(yīng)，這表明R-藻紅蛋白的構(gòu)象或結(jié)構(gòu)的某些部位和胰島素有一定程度的相似，可能對糖尿病有一定的療效。2、

8、藻膽蛋白可以刺激人B-淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)，提高機(jī)體的免疫力。3、與血紅素結(jié)構(gòu)相似，在相似消化環(huán)境下，藻藍(lán)蛋白可以和鐵形成可溶性化合物，提高鐵的吸收率。4、從螺旋藻中提取的藻藍(lán)蛋白，動物實驗表明它有極強(qiáng)的抗癌作用，尤其是對肝癌細(xì)胞。安全無毒，藻類含量極為豐富，食品色素和化妝品5、藻膽蛋白結(jié)合激光輻射，可以有效地殺傷腫瘤細(xì)胞。l0.25mg/ml藻藍(lán)蛋白處理小白鼠骨髓瘤細(xì)胞，與對照組相比，激光輻射后細(xì)胞存活率由15%提高到71%，且對骨髓造血具有刺激作用。提示可用于臨床治療血液病及血癌。l低濃度的藻紅蛋白，分別對人口腔8113癌細(xì)胞和小鼠S180瘤細(xì)胞的殺傷率高達(dá)75%和76%。這種光敏殺傷作用與

9、藻膽蛋白的濃度規(guī)律附合曲線為：lgY=-0.1252973-0.2391394（X+0.52） 以此可以推導(dǎo)治療中藻膽蛋白用量和調(diào)節(jié)激光能量大小，以發(fā)揮最大的殺傷效能。l海洋附著生物能永久或暫時性地黏附于各種固體表面, 對海上生產(chǎn)、運(yùn)輸?shù)榷紟聿恍〉穆闊?但另一方面, 海洋附著生物所分泌的黏附物質(zhì)在水下所展現(xiàn)出來的優(yōu)異黏附性能是目前其他的粘合劑所不能取代的。l目前主要有兩類：貽貝的足絲蛋白( mussel foot protein) 和藤壺膠 ( Barnacle cement ) 3、黏附蛋白l藤壺屬于節(jié)肢動物門、甲殼綱、蔓足目、藤壺科，是附著在海邊巖石上的一簇簇灰白色、有石灰質(zhì)外殼的小動

10、物。l藤壺，雖屬甲殼動物，但成體卻既不游泳，也不爬行，而是營固著生活。 l藤壺粘液的粘性甚強(qiáng)，甚至藤壺的化石經(jīng)過幾千年的滄桑仍牢固地附著在其他物體上。人工合成這種粘液，可用來補(bǔ)牙，粘接建筑材料（又稱超級水泥）；還可用來修船和粘接漏洞；在醫(yī)療上粘合傷口，手術(shù)開刀后只需涂上這種粘液即可。l貽貝屬軟體動物門 Mollusca、 瓣鰓綱 Lamellibranchia、 翼形亞綱 Pterimorphia、 貽貝目 Mytioida、 貽貝科l貽貝足絲中富含蛋白質(zhì)成分, 從外形上可以分為兩部分, 足絲纖維 ( byssus ) 和足絲盤 ( pad)。貽貝的足絲蛋白的粘合力粘合力及防水性能防水性能極強(qiáng)

11、且無毒無毒性, 是現(xiàn)有任何粘合劑均無法比擬的, 因此在醫(yī)藥、 造船、 涂料等行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用前景。l從加州貽貝和紫貽貝足絲中鑒定到至少8 種足絲蛋白mfp , 分別為 mfp- 1 mfp- 6、 膠原蛋白preColD和 preColNG。l膠原蛋白主要構(gòu)成貽貝足絲纖維的核心骨架部分并延伸至足絲盤; lmfp- 1則覆蓋在整個足絲表面而構(gòu)成足絲的保護(hù)外套, 以防止海水的溶解及微生物的降解。lmfp- 2 mfp- 6 則主要定位于貽貝的足絲盤, 是貽貝足絲用以和外界固體表面形成黏附的主要蛋白成分l以上足絲蛋白分子量從 5 kDa ( mfp- 3) 240 kDa ( preCol- D)

12、 不等, 但仍具有一些相似的理化性質(zhì), 例如, 它們的等電點相似, 均為堿性蛋白 ( pI9) , 并且成熟足絲蛋白大都含有大量的翻譯后修飾的3, 4-二羥基苯丙氨酸 ( 3, 4-dihydroxyphenyl- L- alanine, DOPA)。l貽貝足絲纖維的主要成分, 分子量達(dá)到了108kD。l一級結(jié)構(gòu)具有7580個串聯(lián)起來的十肽重復(fù)單元。其序列中通常含有2 種修飾性氨基酸DOPA DOPA 和和羥基脯氨酸羥基脯氨酸。十肽重復(fù)單元十肽重復(fù)單元是高度親堿和親水性的，且DOPA 含量較高，通過交聯(lián)和絡(luò)合將大量鐵離子交聯(lián)和絡(luò)合將大量鐵離子變?yōu)閳皂g而致密的涂層，保護(hù)其結(jié)構(gòu)免受磨蝕和細(xì)變?yōu)閳皂g

13、而致密的涂層，保護(hù)其結(jié)構(gòu)免受磨蝕和細(xì)菌等微生物的降解菌等微生物的降解。lmfp-1mfp-1的糖基化和羥基化程的糖基化和羥基化程度均非常高, 肽鏈交聯(lián)緊密, 所以結(jié)構(gòu)異常復(fù)雜，并且不同來源的 mfp- 1 在結(jié)構(gòu)上存在較大差異。l mfp- 1 mfp- 1 在貽貝足絲中主要負(fù)責(zé)對足絲的保護(hù)在貽貝足絲中主要負(fù)責(zé)對足絲的保護(hù), , 而而非與外界的粘合作用。非與外界的粘合作用。l Mfp-2最早從地中海貽貝 Mytilus galloprovincialis 的足絲中分離到, 其分子量為 45 kDa；l序列中同樣含有 DOPA, 但含量較低 ( 5 mol%) , 一個重要特征在于其序列中含有大

14、量半胱氨酸半胱氨酸l因mfp- 2主要定位在足絲盤, 因此推測該蛋白可能與足絲盤黏附蛋白之間形成交聯(lián)有關(guān)。lMfp-3 的DOPA 摩爾分?jǐn)?shù)較高，分子量為57 kD，無重復(fù)單元，且富含精氨酸，這些殘基有許多被修飾成4-4-羥基羥基-L-L-精氨酸精氨酸(R)(R)。lMfp- 3 存在很強(qiáng)的蛋白多態(tài)性現(xiàn)象, 例如, 在加洲貽貝足絲蛋白中檢測到 mfp- 3 有 20 多種, 氨基酸殘基從 42 到 54 個不等, 序列相似性較高。l不同貽貝來源的mfp- 3 在其分子量, DOPA 含量, 序列方面均有有較高的相似性, 特別是在其序列的C 端,均存在一個Gly- Trp- Asn- X- Gl

15、y- Trp- X( X 為Lys 或者Asn) 的七肽片段lmfp- 4也是一種定位于足絲盤的黏附蛋白,是一類質(zhì)量為93 kD的蛋白質(zhì)。lmfp- 4 的序列中有 36 個富含組氨酸His ( 22 mol%)的十肽重復(fù)片段; 此外Lys、 Arg以及Asp 的含量也較高;表現(xiàn)在N端和C端分別含有 16 個富含 Asp 的十一肽重復(fù)片段。但DOPA 的含量僅2 mol%。l推測這類大質(zhì)量的蛋白質(zhì)在足絲附著基中很可能是起穩(wěn)定作用 。lMfp-5分子量9kDa左右，含74個殘基l序列中DOPADOPA的摩爾分?jǐn)?shù)達(dá)到的摩爾分?jǐn)?shù)達(dá)到30%30%。Mfp-5中超過1/3的殘基是翻譯后被羥基化或磷酸化修

16、飾，其中酪氨酸羥基化作用轉(zhuǎn)變?yōu)镈OPA，或絲氨酸磷酸化作用轉(zhuǎn)變?yōu)镺-O-磷酸絲氨酸磷酸絲氨酸。研究發(fā)現(xiàn)，因含磷酸絲氨酸的蛋含磷酸絲氨酸的蛋白質(zhì)對鈣的親和力很強(qiáng)白質(zhì)對鈣的親和力很強(qiáng)，被修飾后的磷酸絲氨酸有助于貽貝附著在毗鄰的貽貝外殼上，解釋了為何Mfp-5中含有如此高的O-磷酸絲氨酸。l研究發(fā)現(xiàn)足絲蛋白的粘合性能與 DOPA含量呈正相關(guān)。mfp- 3 和 mfp- 5 因低分子量和高低分子量和高DOPADOPA含量含量以及由此表現(xiàn)的強(qiáng)的粘合能力而成為貽貝粘合蛋白研究中最受關(guān)注的兩個蛋白分子 lMfp-6也是一種定位于足絲盤中的黏附蛋白, 分子量 11.6 kDal序列中含量最豐富的氨基酸是酪氨酸

17、 Tyr ( 20.2 mol%) , 其次是 Gly ( 14.1 mol%) , Cys 的含量也較高 ( 11 mol%) , 且約有 1/3 的Cys保留了自由的巰基, 但 DOPA的含量不到 5 mol%l mfp- 6 與足絲盤黏附蛋白的固化黏附蛋白的固化有很大關(guān)系, 它能通過含自由巰基的半胱氨酸 Cys 介導(dǎo)足絲盤黏附蛋白分子中的DOPA之間形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)。l膠原蛋白 preColD 和preColNG 主要構(gòu)成貽貝足絲纖維的核心骨架部分(fibrous core)并延伸至足絲盤lmfp- 4 可能負(fù)責(zé)足絲纖維中的膠原蛋白 與足絲盤的黏附蛋白之間的連接, 同時在足絲盤黏附蛋白之間也

18、發(fā)揮著連接作用。l糖蛋白(glycoprotein)是指由鏈較短、往往帶分支的寡糖與多肽鏈某些特定部位的羥或酰氨基以共價鍵形式連接的一類結(jié)合蛋白質(zhì)，在生物體內(nèi)廣泛存在糖生物學(xué) (glycobiology)。l糖蛋白中的糖鏈對蛋白質(zhì)的功能起重要修飾作用，如糖鏈影響蛋白質(zhì)的構(gòu)象、折疊、溶解度、半衰期、構(gòu)象、折疊、溶解度、半衰期、抗原性及其他生物活性抗原性及其他生物活性。l由于糖蛋白研究的復(fù)雜性，對海洋動物中糖蛋白的研究相對較少，近年來才陸續(xù)開展起這方面的研究工作，多集中在粗提物的生理、藥理活性研究方面，對均一的糖蛋白的結(jié)構(gòu)以及構(gòu)效關(guān)系方面的研究報道則較少。 4、糖蛋白抗腫瘤抗腫瘤l生物活性肽是介于

19、氨基酸與蛋白質(zhì)之間的分子聚合物，它小至由兩個氨基酸組成，大至由數(shù)百個氨基酸通過肽鍵連接而成，具有十分重要的生物學(xué)意義。l生物活性肽的生物學(xué)意義主要體現(xiàn)：吸收機(jī)制優(yōu)于蛋白質(zhì)和氨基酸（指小肽）具有氨基酸不可比擬的生理功能l兩類海洋生物多肽：多肽：天然存在天然存在與與酶解酶解得到的得到的多肽多肽天然存在的海洋生物活性肽的種類：海綿多肽、海天然存在的海洋生物活性肽的種類：海綿多肽、海鞘多肽、?？嚯摹⒂舐荻嚯?、海藻多肽、魚類多鞘多肽、?？嚯?、芋螺多肽、海藻多肽、魚類多肽、貝類多肽、海星多肽、海兔多肽等肽、貝類多肽、海星多肽、海兔多肽等由于海洋的特殊環(huán)境，組成海洋多肽化合物的氨基由于海洋的特殊環(huán)境，組

20、成海洋多肽化合物的氨基酸除常見的氨基酸外，還有酸除常見的氨基酸外，還有- -氨基異丁酸氨基異丁酸等多種海等多種海洋天然產(chǎn)物特有的氨基酸類型，具有多種生理活性洋天然產(chǎn)物特有的氨基酸類型，具有多種生理活性l1. 1 海鞘多肽l海鞘(Ascidian) 屬于脊索動物門,海鞘綱與尾索動物亞門的另外兩個綱稱為被囊動物( Tunicate) ,約有2000 種,海鞘是被囊動物中種類最豐富、含有重要生物活性物質(zhì)最多的一類。海鞘多肽是存在于海鞘中的海鞘多肽是存在于海鞘中的環(huán)肽環(huán)肽， 對L1210鼠性白血病細(xì)胞，ID50為0.35g/ml。 它們對RNA病毒和DNA病毒的增殖有抑制作用，對白血病細(xì)胞和B16黑色

21、素瘤細(xì)胞有毒性作用。其中didemnineB的抗癌作用最強(qiáng)，只需0.0011g/ml的濃度就能抑制白血病細(xì)胞的生長，目前已進(jìn)入臨床試驗，是很有發(fā)展前途的抗癌物質(zhì)。去氫膜海鞘素 l1. 2 海兔多肽l海兔屬于海洋腹足類軟體動物。對海兔抗腫瘤括性肽的研究最早由Pettit小組以小鼠白血病淋巴瘤模型P388為篩選體系，對耳狀截尾海兔（dolabella auricularia）進(jìn)行系統(tǒng)的抗癌活性成分追蹤分離，已分離到dolastatin118，多為環(huán)膚類，具有強(qiáng)烈抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用。其中dolastatin 3(2-9) 對P388腫瘤細(xì)胞的ED50為2.7l0-7 1g mL-1。機(jī)理：抑制微

22、管聚合，促進(jìn)其解聚，干擾腫瘤細(xì)胞的有絲分裂，對許多癌細(xì)胞有誘導(dǎo)凋亡作用，是一種細(xì)胞生長抑制劑(cytostasis)。環(huán)脯-亮-纈-谷酰胺）Thz-(甘)Thzkahalalide Fkahalalide F 海洋環(huán)肽具有強(qiáng)的抗病毒和抗腫瘤活性,這些環(huán)肽主要來源于海鞘和海兔 1. 3 海葵多肽l文獻(xiàn)報道從海洋生物海葵中提取得到的溶細(xì)胞性活性肽有：l(1) 存在于16 種?？械那柿字种菩詨A性多肽,平均相對分子質(zhì)量在15，00021，000 之間。l(2) 從Metrid rumsenile 屬?？蟹蛛x得到的具膽固醇抑制活性肽,其平均相對分子質(zhì)量在80，000 左右。l1. 4 海綿多肽v海

23、綿多肽是存在于離海綿目、海綿多肽是存在于離海綿目、外射海綿目、石海綿外射海綿目、石海綿目目、軟海綿目以及硬海綿目等海綿中的環(huán)肽化合物，、軟海綿目以及硬海綿目等海綿中的環(huán)肽化合物，目前已分離得到近目前已分離得到近4040種。種。vdiscodermins Adiscodermins AD D是從日本伊豆諸島海域采集的海是從日本伊豆諸島海域采集的海綿中獲得，綿中獲得，A A可抑制枯草桿菌和奇異變形桿菌，具有可抑制枯草桿菌和奇異變形桿菌，具有抗炎作用?？寡鬃饔谩 AD D均能抑制海星胚胎發(fā)育，且是磷酯均能抑制海星胚胎發(fā)育，且是磷酯酶酶A2A2的有效抑制劑，的有效抑制劑，IC50IC50為為3503

24、50700nmol700nmolL L-1-1。 l1. 5 1. 5 芋螺多肽芋螺多肽l芋螺芋螺(Conus) (Conus) 是海洋腹足綱軟體動物是海洋腹足綱軟體動物, ,其在獵取魚、其在獵取魚、海洋蠕蟲、軟體動物時常分泌一系列毒性物質(zhì)海洋蠕蟲、軟體動物時常分泌一系列毒性物質(zhì), ,稱稱為芋螺毒素為芋螺毒素(Conotoxin)(Conotoxin)即芋螺多肽。即芋螺多肽。 目前已發(fā)現(xiàn)的芋螺毒素有近百種，大多為由目前已發(fā)現(xiàn)的芋螺毒素有近百種，大多為由10103030個氨基酸殘基組成的小肽，富含兩對或三個氨基酸殘基組成的小肽，富含兩對或三對二硫鍵，是迄今發(fā)現(xiàn)的對二硫鍵，是迄今發(fā)現(xiàn)的最小核酸編碼

25、的動物神最小核酸編碼的動物神經(jīng)毒素肽，也是二硫鍵密度最高的小肽經(jīng)毒素肽，也是二硫鍵密度最高的小肽。主要有。主要有-芋螺毒素、芋螺毒素、-芋螺毒素、芋螺毒素、-芋螺毒素及芋螺毒素及-芋螺毒素等。其活性與蛇毒、蝎毒等動物神經(jīng)毒芋螺毒素等。其活性與蛇毒、蝎毒等動物神經(jīng)毒素相似素相似, ,可引起動物出現(xiàn)驚厥、顫抖及麻痹等癥狀可引起動物出現(xiàn)驚厥、顫抖及麻痹等癥狀花冠芋螺織錦芋螺番紅花芋螺將軍芋螺l1. 8 生物防御素l生物防御素(Defensin) 是近年來發(fā)現(xiàn)的一組新型抗菌活性肽。它們通常都是由3550 個氨基酸殘基組成,且分子內(nèi)富含二硫鍵。由于其具有牢固的分子骨架、廣泛的分布以及生物活性功能,因而對

26、它們的研究已成為當(dāng)前國際學(xué)術(shù)界中一個引人關(guān)注的研究熱點。v海藻多肽已從綠藻、藍(lán)藻等中分離得到。海藻多肽已從綠藻、藍(lán)藻等中分離得到。據(jù)報道，利用綠藻水提物制得一種內(nèi)含活據(jù)報道，利用綠藻水提物制得一種內(nèi)含活性多肽成分。從培養(yǎng)的藍(lán)藻中也分離出一性多肽成分。從培養(yǎng)的藍(lán)藻中也分離出一種具有種具有魚毒性、抗菌、殺細(xì)胞活性的生物魚毒性、抗菌、殺細(xì)胞活性的生物活性肽活性肽, , 已具備大規(guī)模生產(chǎn)能力。另外，已具備大規(guī)模生產(chǎn)能力。另外，還從海藻還從海藻Pyymnesium patelliferumPyymnesium patelliferum屬中提屬中提取出一種毒素肽取出一種毒素肽HormothaminHorm

27、othamin，從藍(lán)，從藍(lán)- -綠海綠海藻屬藻屬Lyngbya majusculaLyngbya majuscula中分離得到具有細(xì)中分離得到具有細(xì)胞毒活性的環(huán)肽胞毒活性的環(huán)肽Majusculamide C Majusculamide C 存在于魚貝類組織中的天然肽類只有:三肽的谷胱甘肽；是一種特殊的Aa衍生物，又是含有巰基的三肽； 鵝肌肽、鯨肌肽：屬咪唑化合物，統(tǒng)稱為咪唑二肽，是肉品風(fēng)味的前體物質(zhì)。 這些咪唑化合物一般在游泳能力強(qiáng)的魚類及鯨類肌肉中含量較多，因為咪唑環(huán)的pK值在生理pH附近，被認(rèn)為是具有緩沖作用的物質(zhì)。l 天然存在的活性肽大部分或含量微少,或提取難,不足以大量生產(chǎn)供給所需;化

28、學(xué)人工合成又費(fèi)時費(fèi)力,成本昂貴;因此,人們更多地把目光投向開發(fā)蛋白酶解產(chǎn)物這條途徑上來。l水解營養(yǎng)蛋白生產(chǎn)生物活性肽的理論依據(jù)水解營養(yǎng)蛋白生產(chǎn)生物活性肽的理論依據(jù): : 在貯藏、營養(yǎng)蛋白的多肽鏈內(nèi)部可能普遍存在著功能區(qū),選擇適當(dāng)?shù)牡鞍酌杆?這些多肽有可能被釋放出來,從而制備各種各樣的生物活性肽。目前，應(yīng)用于酶解海洋動物蛋白的酶主要還是陸源蛋白酶，包括胰蛋白酶、胃蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、熱菌蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、膠原蛋白酶、木瓜蛋白酶等l 從生物進(jìn)化上看從生物進(jìn)化上看, ,營養(yǎng)和貯藏蛋白應(yīng)該營養(yǎng)和貯藏蛋白應(yīng)該是從功能蛋白進(jìn)化而來的是從功能蛋白進(jìn)化而來的, ,因為原始的生物因為原始的生物是

29、不可能合成大量此類蛋白的。當(dāng)生物進(jìn)是不可能合成大量此類蛋白的。當(dāng)生物進(jìn)化到需要為后代發(fā)育提供營養(yǎng)時化到需要為后代發(fā)育提供營養(yǎng)時, ,它不可能它不可能憑空制造出一種營養(yǎng)蛋白憑空制造出一種營養(yǎng)蛋白, ,最好的方法就是最好的方法就是通過若干功能區(qū)通過若干功能區(qū)( (結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域,DomainDNA,DomainDNA） “組裝組裝”出營養(yǎng)或貯藏蛋白基因。所以出營養(yǎng)或貯藏蛋白基因。所以, ,在在不同的營養(yǎng)和貯藏蛋白的多肽中可能廣泛不同的營養(yǎng)和貯藏蛋白的多肽中可能廣泛存在著不同的功能區(qū)存在著不同的功能區(qū), ,選擇適當(dāng)?shù)牡鞍酌妇瓦x擇適當(dāng)?shù)牡鞍酌妇涂蓪⑵溽尫懦鰜砜蓪⑵溽尫懦鰜? ,還原其功能特性還原其功能特

30、性, ,通過這通過這種方法可以獲得相當(dāng)廣泛的生物活性短肽。種方法可以獲得相當(dāng)廣泛的生物活性短肽。l從免疫學(xué)看從免疫學(xué)看, ,盡管不同的生物都具有功能上非常相似的蛋白質(zhì),但是由于其非功能區(qū)存在著較大氨基酸差異,所以不能互相使用,因為生物正是通過免疫系統(tǒng)識別自身蛋白和外來蛋白的這些非功能區(qū)的差異來清除異己和保持自身穩(wěn)定性的。如果我們把注意力放在這些具有不同生理功能的生物活性短肽上,則我們可能有效地避免免疫排斥反應(yīng)的困擾。l例如例如, ,乳轉(zhuǎn)鐵蛋白用于注射可能會產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng),但如果用其水解所得到的短肽,就可能安全地用于注射。l又如又如, ,實驗證明免疫活性肽和白細(xì)胞介素相似,可以激活T 細(xì)胞和巨

31、噬細(xì)胞,從而增強(qiáng)機(jī)體免疫力,雖然它來源于動物蛋白,但研究表明它可能安全地用于醫(yī)藥。 易消化吸收（比氨基酸更易吸收）、保護(hù)胃粘膜及抗?jié)冏饔?、抗菌、抗氧化、抗過敏、降血壓、降膽固醇、抗衰老、抑制腫瘤細(xì)胞生長、抑制AIDS病毒、促進(jìn)傷口愈合、增強(qiáng)骨強(qiáng)度和預(yù)防骨質(zhì)疏松、預(yù)防關(guān)節(jié)炎、促進(jìn)角膜上皮損傷的修復(fù)和促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞的生長等原l活性評價方法：體外實驗法和動物實驗法。l體外實驗法：1971年Cushman建立了體外紫外光度法在37、pH8.3即模仿體內(nèi)環(huán)境的條件下, ACE降解血管緊張素I的模擬物Hippuryl-L-Histidyl-L-Leucine (HHL)產(chǎn)生馬尿酸，當(dāng)加入降血壓肽抑制A

32、CE的降解作用后，馬尿酸的生成量減小，通過在紫外228nm處測量馬尿酸的光吸收值得到馬尿酸的生成量，從而評價降血壓肽的抑制效果。l 從海洋低值魚蝦中分離出具有抗高血壓活從海洋低值魚蝦中分離出具有抗高血壓活性的活性肽。其氨基酸序列如下性的活性肽。其氨基酸序列如下: :lC8 C8 肽肽( ( 沙丁魚沙丁魚) : Leu-Lys-Val-Gly-Val-) : Leu-Lys-Val-Gly-Val-Lys-Gln-TyrLys-Gln-TyrlC11 C11 肽肽( ( 沙丁魚沙丁魚) : Tyr-Lys-Ser-Phe-) : Tyr-Lys-Ser-Phe-Ile-Lys-Gly-Tyr-P

33、ro-Val-MetIle-Lys-Gly-Tyr-Pro-Val-MetlC8 C8 肽肽( ( 金槍魚金槍魚) : Pro-Thr-His-Ile-Lys-) : Pro-Thr-His-Ile-Lys-Trp-Gly-AspTrp-Gly-AsplC3 C3 肽肽( (南極磷蝦南極磷蝦) :Leu-Lys-Tyr) :Leu-Lys-Tyr提高抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶ACE的活性而具有降壓功能。水解Pr條件溫和，食用安全性極高，突出優(yōu)點是對血壓正常的人無降壓作用。l 從從鱈魚鱈魚排中分離得到的分子量分別為排中分離得到的分子量分別為30K,10K,5K30K,10K,5K和和3K3K的四種活性

34、寡聚肽，具有的四種活性寡聚肽，具有ACE ACE 抑制活性，且抑制活性，且ACEACE抑制活性隨相對分子量抑制活性隨相對分子量降低而顯著增加，分子質(zhì)量為降低而顯著增加，分子質(zhì)量為3 K3 K 的多肽具的多肽具有有最強(qiáng)的最強(qiáng)的ACE ACE 抑制活性抑制活性 。此肽具有很好的水。此肽具有很好的水溶性，且無苦味，因此溶性，且無苦味，因此, ,更易投入實際應(yīng)用。更易投入實際應(yīng)用。 相對分子質(zhì)量為相對分子質(zhì)量為5 K5 K的多肽具有顯著的的多肽具有顯著的抗氧化活性抗氧化活性, ,其抗氧化活性與其抗氧化活性與-生育酚相當(dāng)。生育酚相當(dāng)。1 實驗方法1.1 選取復(fù)合蛋白酶P1，在不同酶解條件下對貽貝蛋白進(jìn)行

35、水解，采取Uniform Design(均勻設(shè)計)方案，研究不同酶量、酶解時間、酶解溫度、pH等因素對ACE的抑制效果，并選擇最佳的酶解條件。1.2 酶解液經(jīng)純化、加入活性修飾劑MAl，提取，冷凍干燥，制備降血壓肽，進(jìn)行活性檢測。文獻(xiàn)閱讀1.3 酶解樣品ACE抑制效果評價l用紫外分光光度法分析不同酶解條件下制備的酶解降血壓肽的ACE抑制活性。228nm下測定其吸光值。l將各酶解液反應(yīng)值與空白樣品對照，分析所得酶解降壓肽的ACE抑制率P： P=A-A(control)/A1001.4 高效液相色譜法測相對分子質(zhì)量-標(biāo)準(zhǔn)曲線法l色譜條件：Waters 600高效液相色譜儀；色譜柱：TSK gel

36、2000；流動相：V(乙腈)：V(水)：V(三氟乙酸)=45：55：01，檢測波長：220 nm，體積流量：05 mL/min，柱溫：30。l相對分子質(zhì)量校正曲線所用標(biāo)準(zhǔn)品：細(xì)胞色素c(MW 12500)，抑肽酶(MW6500)，桿菌酶(MW 1450)，乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(MW 451)，乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(MW 189)。l取酶解降血壓肽溶解，定容，取上清液濾紙過濾，再用022um微孔濾膜過濾，以供進(jìn)樣。1.5 降血壓肽氨基酸組成分析l水解氨基酸檢測：取樣品，加6 mol/L鹽酸水解，110，24h，然后用03 mm膜微孔過濾，定容，進(jìn)樣氨基酸自動分析系統(tǒng)進(jìn)行檢測。l 游離

37、氨基酸檢測：取樣品，加水溶解，超聲波振蕩混勻，加適量鹽酸調(diào)酸，0.3 mm膜微孔過濾，定容，進(jìn)樣氨基酸自動分析系統(tǒng)進(jìn)行檢測。1.6 降血壓肽的動物試驗l 將樣品以3.0 gkg-1體重的劑量進(jìn)行灌喂。灌喂前和灌喂之后第2、4、6、8、10小時分別檢測收縮壓1次，記錄各血壓值。2 結(jié)果及討論2.1 酶解條件對降血壓肽ACE抑制率的影響 回歸分析得回歸方程：Y=70.464-1.195X1+15.299X2+11.971X3-4.310X22+0.194 X1X2-0.141X3X4 由此最佳的ACE抑制活性為90.23，但試驗結(jié)果ACE抑制率為8655。 2.2 降血壓肽的相對分子質(zhì)量組成檢測結(jié)

38、果 降血壓肽樣品相對分子質(zhì)量范圍在1.6 ku以內(nèi)，從11.6ku，即lO15、16肽的范圍，其含量為49.66，0.61ku，即5 10肽范圍，樣品含量為15.73，0.20.6ku范圍內(nèi)為796，主要為2肽4肽的小肽。 目前比較公認(rèn)的是酶解降血壓肽的分子量相對于蛋白質(zhì)來說較小，一般在幾個ku以內(nèi)。2.3 降血壓肽的氨基酸組成檢測結(jié)果l分析氨基酸組成與酶解質(zhì)量和降血壓活性之間的關(guān)系 樣品含有較高比例的必需氨基酸 8.57水解氨基酸總量為59.6 游離氨基酸總量為8.8 谷氨酸被認(rèn)為能促進(jìn)腦細(xì)胞進(jìn)行呼吸，利于腦組織中氨的排除，調(diào)節(jié)人體的新陳代謝，而這將會對血壓造成一定的影響2.4 降血壓肽的降

39、壓效果l 處理4 h和6 h血壓變化的F值0.05(2，9)，說明服用降血壓肽4 h和6 h效果有顯著差異；l 降血壓肽在26 h之內(nèi)的降壓效果具有顯著性(P=005)，血壓平均降低幅度為1828mmHg。在6 h處降壓效果達(dá)到最大值為28mmHg，且效果極為顯著(P=001)。 水生動物抗菌肽的研究主要集中于甲殼綱動物水生動物抗菌肽的研究主要集中于甲殼綱動物: :l19881988年，從中國鱟血細(xì)胞用酸提取法得到一種含年，從中國鱟血細(xì)胞用酸提取法得到一種含17 17 個氨基酸的抗菌肽個氨基酸的抗菌肽鱟素，能與細(xì)菌細(xì)胞壁鱟素，能與細(xì)菌細(xì)胞壁中的脂多糖成分結(jié)合形成復(fù)合物，在很低濃度下中的脂多糖成

40、分結(jié)合形成復(fù)合物，在很低濃度下就能抑制就能抑制G G- -及及G G+ +細(xì)菌的生長。鱟素在低細(xì)菌的生長。鱟素在低pHpH、高溫、高溫下相當(dāng)穩(wěn)定，是一種有應(yīng)用前景的抗菌活性物質(zhì)。下相當(dāng)穩(wěn)定，是一種有應(yīng)用前景的抗菌活性物質(zhì)。19951995年，從年，從鱟鱟體中分離得到一個體中分離得到一個79 79 肽肽, ,與兔和牛與兔和牛的的嗜中性白血球防御素嗜中性白血球防御素相似相似; ;lNoga Noga 等認(rèn)為美洲等認(rèn)為美洲藍(lán)蟹藍(lán)蟹的血細(xì)胞具有抗菌活性的血細(xì)胞具有抗菌活性; ;lSchnapp Schnapp 等從等從青緣蟹青緣蟹的血細(xì)胞中分離得到的血細(xì)胞中分離得到3 3 種具種具有殺菌作用的肽有殺菌

41、作用的肽, ,它們能夠它們能夠選擇性地作用于細(xì)菌外選擇性地作用于細(xì)菌外層細(xì)胞膜的某些組分層細(xì)胞膜的某些組分, ,如帶陰離子的磷脂如帶陰離子的磷脂, ,增大其增大其滲透性而殺死或抑制細(xì)菌的生長滲透性而殺死或抑制細(xì)菌的生長; ; lChisholm Chisholm 等研究包括等研究包括龍蝦龍蝦和和對蝦對蝦在內(nèi)的在內(nèi)的8 8 種甲殼種甲殼動物的動物的血細(xì)胞溶泡上清液血細(xì)胞溶泡上清液對數(shù)種細(xì)菌的殺菌作用對數(shù)種細(xì)菌的殺菌作用, ,證明其含有能殺滅細(xì)菌的因子證明其含有能殺滅細(xì)菌的因子; ; lSongSong等發(fā)現(xiàn)等發(fā)現(xiàn)羅氏沼蝦羅氏沼蝦受感染后會誘導(dǎo)產(chǎn)生類似殺受感染后會誘導(dǎo)產(chǎn)生類似殺菌肽類的物質(zhì)；菌肽類

42、的物質(zhì)；lDestoumieux Destoumieux 等從養(yǎng)殖的等從養(yǎng)殖的南美白對蝦南美白對蝦的血細(xì)胞和的血細(xì)胞和血漿中分離出幾種抗菌活性因子血漿中分離出幾種抗菌活性因子, ,其中其中3 3 種具有種具有抗抗真菌和抗細(xì)菌尤其是抗革蘭陽性菌真菌和抗細(xì)菌尤其是抗革蘭陽性菌的活性。的活性。lAzumi Azumi 等從一種等從一種海鞘海鞘Halocy amine roretzi Halocy amine roretzi 的的血細(xì)胞中分離得到的抗菌肽血細(xì)胞中分離得到的抗菌肽Halocyamine A Halocyamine A 不僅不僅在體外可在體外可抑制某些魚抑制某些魚RNA RNA 病毒的生長

43、病毒的生長, ,也能抑制某也能抑制某些海水細(xì)菌的生長些海水細(xì)菌的生長。lFernandes Fernandes 等從等從虹鱒魚皮虹鱒魚皮中分離得到一種具有抗中分離得到一種具有抗菌作用的核蛋白肽菌作用的核蛋白肽, ,在在抵御胞內(nèi)或胞外病毒抵御胞內(nèi)或胞外病毒方面起方面起著關(guān)鍵作用。著關(guān)鍵作用。l最近的研究發(fā)現(xiàn)最近的研究發(fā)現(xiàn), ,魚類魚類中也存在大量的抗菌中也存在大量的抗菌肽肽 Oren Oren 等從等從豹鰨豹鰨中分離得到一種中分離得到一種33 33 肽肽的抗菌肽的抗菌肽, ,具有比具有比蜂毒素蜂毒素更強(qiáng)的抗菌活性更強(qiáng)的抗菌活性, ,其作用可與其他天然的抗菌肽如蛙皮素、其作用可與其他天然的抗菌肽如

44、蛙皮素、殺菌肽等相比殺菌肽等相比; ;電鏡觀察顯示其抑菌機(jī)理是電鏡觀察顯示其抑菌機(jī)理是溶解細(xì)菌的細(xì)胞壁溶解細(xì)菌的細(xì)胞壁。 Conlon Conlon 等從等從海七鰓鰻海七鰓鰻的皮膚上分離得的皮膚上分離得到到富含半胱氨酸和精氨酸富含半胱氨酸和精氨酸的多肽的多肽, ,其氨基酸其氨基酸序列與老鼠的抗菌肽序列與老鼠的抗菌肽corticostatin R4 corticostatin R4 和和兔的抗菌肽兔的抗菌肽corticosta2tin R1 corticosta2tin R1 結(jié)構(gòu)相似。結(jié)構(gòu)相似。l從軟體動物從軟體動物貝類貝類的血液中提取到的血液中提取到2 2 種富含種富含陽離子與胱氨酸的抗菌小

45、肽陽離子與胱氨酸的抗菌小肽, ,其中其中1 1 種含有種含有34 34 個氨基酸殘基個氨基酸殘基, ,命名為命名為Mytilin , Mytilin , 結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)如下如下: Gly-: Gly-CysCys-Ala-Ser-Ala-SerArg-Arg-CysCys-Lys-Lys-Ala-Lys-Ala-Lys-CysCys-Ala-Gly-Arg-Arg-Ala-Gly-Arg-Arg-CysCys-Lys-Lys-Gly-Try-Ala-Ser-Ala-Ser-Phe-Arg-Gly-Gly-Try-Ala-Ser-Ala-Ser-Phe-Arg-Gly-Arg-Arg-CysCys-T

46、yr-Tyr-CysCys-Lys-Lys-CysCys-Phe-Arg-Phe-Arg-CysCys ; ; 另一種含另一種含353543 43 個氨基酸殘基個氨基酸殘基, ,屬于屬于昆蟲防御家族肽昆蟲防御家族肽, ,與上述的與上述的Mytilin Mytilin 的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)相似相似, ,它富含它富含8 8 個胱氨酸，具有廣譜抗細(xì)菌、個胱氨酸，具有廣譜抗細(xì)菌、抗真菌活性。抗真菌活性。p材料：長牡蠣、大連灣牡蠣和近江牡蠣的肉p菌株 溶壁微球菌、生孢梭菌CMCC(B)64941、白色念珠菌CMCC(F)98001、金黃色葡萄球菌JP-04-08、ATCC25922 、表皮葡萄球菌BP-04-1

47、8 、大腸埃希氏菌PC-04-21、ATCC25923 、銅綠假單胞菌LN-04-12、ATCC27853、變形桿菌BX-04-10、肺炎克雷伯桿菌、腸球菌、不動菌屬。p質(zhì)控菌株 金黃色葡萄球菌ATCC 25922、大腸埃希氏菌ATCC25923、銅綠假單胞菌ATCC 27853。美國模式培養(yǎng)物保藏所中國生物制品檢定所p 方法l1. 1. 抗菌蛋白的制備抗菌蛋白的制備1.1粗蛋白的制備：取鮮活牡蠣510 kg,以純水沖洗后取牡蠣軟體,洗凈瀝干約500 g，經(jīng)粉碎、低溫研磨過100目篩,按重量比(w/w)11加入注射用水,在14攪拌提取68 h,勻漿液離心(4000 r/min,40 min),

48、得蛋白粗提上清液。1.2液體濃縮蛋白的制備：將獲得的粗提液采用SMB220生物型錯流超濾系統(tǒng)分級(膜截留分子量為50 kDa),再以截留分子量為10 kDa的膜濃縮5倍。濃縮液密閉存放或制備成凍干粉。1.3蛋白的分離純化：取超濾濃縮液2.0ml,上樣于pH 3.8檸檬酸-Na2HPO4緩沖液充分平衡后的CM-Sepharose FF層析柱(2.5 cm10 cm)進(jìn)行層析,用200 ml含0-1.0 mol/L NaCl的緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫,收集活性峰,脫鹽濃縮后，上樣到以pH 6.5NaH2PO4- Na2HPO4緩沖液充分平衡的SephadexG-100層析柱(1.6 cm60 cm)

49、進(jìn)行層析,用平衡液進(jìn)行洗脫,收集活性峰,脫鹽濃縮后20保存?zhèn)溆?。以上純化操作均?進(jìn)行。2 2 抗菌蛋白性質(zhì)分析抗菌蛋白性質(zhì)分析2.1純度和分子量測定采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定：蛋白濃縮液(10l,15l)直接上樣進(jìn)行SDS-PAGE分析,分離膠濃度為15,電泳條件:電壓200 V,56 min,用0.5考馬斯亮藍(lán)R250染色,使用不同分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白對抗菌蛋白進(jìn)行分子量及其分布測試及分析。采用SDS-PAGE方法測定：純化蛋白測定，分離膠濃度為12%,用0.5%考馬斯亮藍(lán)R250染色。2.2含氮量測定取3批次(200305021、20030808、20040411)牡蠣海洋溶菌酶凍干粉按照

50、中華人民共和國藥典(2000年版二部)附錄D氮測定法測定。3 3 體外實驗體外實驗 3.1 最低抑菌濃度（MIC)測定采用平皿二倍稀釋法和Denlay多點接種器進(jìn)行藥敏試驗，試驗菌用營養(yǎng)肉湯及腦心浸液增菌;抗菌蛋白海洋低溫溶抗菌蛋白海洋低溫溶菌酶菌酶用水解酪蛋白瓊脂(MH) 肉湯二倍稀釋成各種所需濃度,分別加適量至平皿中，MH 培養(yǎng)基熔化后定量注入含藥液平皿內(nèi)混勻：生孢梭菌最終濃度為15106 cfu/ml,白色念珠菌18106cfu/ml,其他菌液為1105 cfu/ml,需氧菌37培養(yǎng)18 h,真菌2025培養(yǎng)48 h,厭氧菌置厭氧孵箱3035孵育48 h后觀察結(jié)果,無菌生長的平皿中所含藥

51、物最小的濃度即為MIC。 3.2 最低殺菌濃度MB測定采用試管二倍稀釋法,先測出試驗菌的MIC,再依次將未見細(xì)菌生長各管培養(yǎng)液分別吸取0.1 ml,轉(zhuǎn)移到不含藥液的瓊脂平皿中,培養(yǎng)條件同MIC測定,觀察測定結(jié)果,平皿上菌落數(shù)5個的最小藥物濃度即為MBC。4 4 透射電鏡觀察抗菌蛋白對大腸埃希氏菌超微結(jié)構(gòu)透射電鏡觀察抗菌蛋白對大腸埃希氏菌超微結(jié)構(gòu)的變化的變化試驗以正常大腸埃希氏菌培養(yǎng)12h制備透射電鏡樣品作陰性對照組。以LB液體培養(yǎng)基將抗菌蛋白稀釋成1.25 mg/ml,加入對數(shù)生長期的大腸埃希氏菌,使?jié)舛葹?105 cfu/ml。搖床中培養(yǎng)(37 min,200 r/min)12 h,離心棄上

52、清,沉淀用磷酸緩沖液洗滌3次,制備透射電鏡樣品。固定、脫水、切片和染色后,作為實驗組。透射電鏡下觀察大腸埃希氏菌超微結(jié)構(gòu)的變化。p 結(jié)果結(jié)果1 1 抗菌蛋白的分離純化抗菌蛋白的分離純化 抗菌蛋白經(jīng)CM-Sepharose FF陽離子交換層析分離后,鹽洗脫峰為活性峰,洗脫曲線見圖1,收集活性峰濃縮后上樣于Sephadex G-100凝膠層析柱,洗脫曲線見圖2,第二個峰為活性峰,收集活性峰透析濃縮后作為純化樣品使用。2 2 抗菌蛋白性質(zhì)分析抗菌蛋白性質(zhì)分析2.1 抗菌蛋白純度和分子量測定l由圖a可見,牡蠣海洋溶菌酶為含多種蛋白的混合物,其分子量分布較寬,從10 KD一直到100 kDa都有分布,其

53、中分子量分布在15 kDa和23 kDa左右的組分含量較多。l三批牡蠣海洋溶菌酶濃縮液均為多種蛋白的混合物,其電泳條帶相同,各條帶的分布及濃度基本相同,說明樣品制備的重現(xiàn)性良好,工藝穩(wěn)定,產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定,見圖b。l 純化樣品為單一條帶,由標(biāo)準(zhǔn)蛋白可知分子量約為39 kDa。2.2 含氮量測定 3批次抗菌蛋白凍干粉蛋白含量見表。2.3 抗菌蛋白對生孢梭菌、白色念珠菌的抗菌作用抗菌蛋白對生孢梭菌最低抑菌濃度為0.0156%,最低殺菌濃度為0.0313%;對白色念珠菌最低抑菌濃度和最低殺菌濃度均為0.0625%2.4 抗菌蛋白對臨床常見致病菌和標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株的抗菌活性表明抗菌蛋白對臨床常見的致病菌具有良

54、好的抗菌作用且呈劑量依賴性對3株標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株也有較好的抗菌作用2.5 抗菌蛋白對大腸桿菌超微結(jié)構(gòu)的作用研究結(jié)果l對照組:正常大腸桿菌形態(tài)為直桿狀,細(xì)胞壁和細(xì)胞膜完整光滑,結(jié)構(gòu)緊密,細(xì)胞膜緊貼細(xì)胞壁,細(xì)胞質(zhì)均勻。l抗菌蛋白(1.25 mg/ml)組,大腸桿菌的形態(tài)發(fā)生改變,隨時間的延長變化越來越明顯:作用1 h后,細(xì)胞壁松弛出現(xiàn)皺褶,菌體變短變粗,呈橢圓形,細(xì)胞質(zhì)固縮;2 h后,大部分菌體呈圓球形;3 h后,菌體呈不規(guī)則形,細(xì)胞壁缺失,細(xì)胞質(zhì)解體出現(xiàn)空腔,菌體裂解。lIwamoto 等研究了鯖魚肽對低密度脂蛋白(LDL) 氧化的抑制作用。結(jié)果表明,鯖魚肽能夠顯著延長氧化反應(yīng)的誘導(dǎo)期。 對16 名

55、平均年齡為19 歲的女性志愿者進(jìn)行了體內(nèi)抗氧化實驗。對照期內(nèi)食用含酪蛋白的食物,實驗期內(nèi)食用含鯖魚肽的食物,劑量按16.9g 蛋白/ d,共10d。其他膳食組分同。提取靜脈血試樣測定LDL的氧化情況，結(jié)果表明,試驗組第10d 時靜脈血試樣LDL 氧化的誘導(dǎo)期(66.2min) 比0d 時靜脈血試樣LDL 氧化的誘導(dǎo)期(57.9min) 長,而對照組在0d 和10d 的靜脈血試樣LDL 氧化的誘導(dǎo)期之間不存在差異。lKim Se-Kwon Kim Se-Kwon 等報道等報道, ,黃鰭舌鰨魚皮膠原酶黃鰭舌鰨魚皮膠原酶解得到的多肽也具有較好的抗氧化活性。解得到的多肽也具有較好的抗氧化活性。l采用現(xiàn)

56、代生物工程技術(shù)采用現(xiàn)代生物工程技術(shù), ,從從櫛孔扇貝櫛孔扇貝中提取中提取的海洋多肽的海洋多肽, , 相對分子質(zhì)量為相對分子質(zhì)量為800 800 1000 ,1000 ,經(jīng)藥理試驗表明經(jīng)藥理試驗表明, ,具有抗氧化損傷作用具有抗氧化損傷作用, ,能清能清除超氧負(fù)離子和羥自由基除超氧負(fù)離子和羥自由基, ,延緩皮膚老化延緩皮膚老化, ,可可顯著增強(qiáng)免疫細(xì)胞的代謝和增殖顯著增強(qiáng)免疫細(xì)胞的代謝和增殖, ,是一種有是一種有潛力的抗氧化劑和免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)劑。潛力的抗氧化劑和免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)劑。1.1 材料、試劑與儀器l鳙魚魚鰾 水產(chǎn)批發(fā)市場；其他試劑均為分析純。lSorvall Evolution RC 7284

57、11型冷凍離心機(jī) 美國熱電公司；超濾設(shè)備及超濾膜 美國Millipower 公司；Lambada 25 型可見紫外檢測儀 美國PE 公司；DS-1 高速組織搗碎機(jī)。1.2 菌種及培養(yǎng)基l米曲霉(Aspergillus oryzae) 中國工業(yè)微生物菌種保藏中心(CICC 40186)l種子培養(yǎng)基( PDA)：馬鈴薯汁1000ml ，葡萄糖20 g ，自然pH 值。1.3.1 魚鰾預(yù)處理 魚鰾用離子水浸泡漂洗，按每100g魚鰾加100ml去離子水進(jìn)行均漿，勻漿液稀釋到蛋白濃度5%(m/V)后進(jìn)行巴氏滅菌(60，30min)，備用。1.3.2 發(fā)酵菌種的制備 從活化的菌種保藏斜面中挑取兩環(huán)接種于種

58、子培養(yǎng)基中，28、120r/min培養(yǎng)36h，使菌體濃度達(dá)到106CFU/ml。1.3.3 魚鰾勻漿液發(fā)酵 按5%(V/V)將發(fā)酵菌株液接種于魚鰾勻漿液28、120r/min 培養(yǎng)，于不同發(fā)酵時間取樣。發(fā)酵液于410000r/min 離心30min，上清液經(jīng)0.45m 微孔濾膜過濾，濾液為魚鰾多肽混合液，冷凍干燥，得魚鰾多肽粗粉，冷凍保藏備用。1.3.4 超濾分離 用去離子水將發(fā)酵液配成10mg/ml的樣液，分別通過截留分子量為10、3、1kD 的超濾膜進(jìn)行超濾，收集不同截留分子量的濾液，分別編號為肽(Mw 1kD)、肽(1kDMw3kD)、肽(3kD Mw10kD)1.3.5 測定方法l 多

59、肽含量的測定采用以酸可溶性多肽酸可溶性多肽計，將等體積的0.4mol/L三氯乙酸(TCA)加入到多肽混合液中，靜置0.5h 后10000r/min離心10min，去除酸不溶性的蛋白和長鏈肽沉淀，用雙縮脲法測定上清液中的多肽含量；測定發(fā)酵液水解度和平均肽鏈長度。l 清除O2-能力測定采用NBT法；l 清除OH 能力測定采用D-2- 脫氧核糖法；l 抗氧化力測定采用亞油酸自氧化法。2.1 發(fā)酵過程中魚鰾蛋白水解動態(tài)l配制多肽液濃度為10mg/ml，測定自由基清除能力和抗氧化能力。2.2 魚鰾發(fā)酵液的抗氧化活性發(fā)酵時間發(fā)酵時間40h40h，水解度為，水解度為22%22%時，所得魚鰾時，所得魚鰾肽的抗

60、氧化力最強(qiáng)。肽的抗氧化力最強(qiáng)。l魚鰾多肽液經(jīng)不同截留分子量的超濾膜超濾后，各片段濾液配成質(zhì)量濃度為10mg/ml的多肽液，分別測定其自由基清除能力和抗氧化能力。2.2 超濾液的抗氧化活性由由5 512 12 個氨基酸殘基組成片段具有較強(qiáng)抗氧化性個氨基酸殘基組成片段具有較強(qiáng)抗氧化性l利用微生物在發(fā)酵過程中所產(chǎn)的蛋白酶水解魚鰾蛋白：魚鰾營養(yǎng)成分全面豐富，良好的生長培養(yǎng)基；高含量的魚鰾蛋白可被微生物酶水解，通過控制發(fā)酵時間，便可制備出鏈長適當(dāng)，具有一定生理活性的魚鰾多肽。顯而易見，其生產(chǎn)成本低廉，因而十分適于工業(yè)化生產(chǎn)。lO2 和OH 等活性氧自由基誘導(dǎo)的氧化損傷一直被認(rèn)為是引起衰老、細(xì)胞損傷和癌變