第五章固定化酶及固定化技術(shù)

1、l在水溶液中不穩(wěn)定在水溶液中不穩(wěn)定l一次性使用一次性使用- -難回收，難連續(xù)化生產(chǎn)難回收，難連續(xù)化生產(chǎn)l用于醫(yī)藥用于醫(yī)藥/ /化學(xué)分析純度要求高化學(xué)分析純度要求高l產(chǎn)物的分離純化困難產(chǎn)物的分離純化困難l。l要求將酶變成不溶性要求將酶變成不溶性l實(shí)際上將酶限制在一定空間實(shí)際上將酶限制在一定空間 固定化固定化l19161916年，美國(guó)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)年，美國(guó)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，酶和載體結(jié)合以后酶和載體結(jié)合以后，在，在水中呈不溶解狀態(tài)時(shí)，水中呈不溶解狀態(tài)時(shí)，仍仍然具有生物催化活性然具有生物催化活性。 固定化酶可重復(fù)使用固定化酶可重復(fù)使用操作穩(wěn)定性操作穩(wěn)定性 酶在固定化后其活力可以緩慢釋放酶在固定化后其活力可以緩慢

2、釋放, , 酶的穩(wěn)定酶的穩(wěn)定性比天然狀態(tài)高性比天然狀態(tài)高, , 可重復(fù)多次使用可重復(fù)多次使用. .l結(jié)果如圖所示: 固定化酶的活力基本保持穩(wěn)定活力損失15% ,由此可見(jiàn)該固定化酶具有良好的操作穩(wěn)定性例:將0.5g DEAE 纖維素固定化殼聚糖酶與10mL 1%殼聚糖溶液在60下連續(xù)反應(yīng)10 次每次反應(yīng)時(shí)間為6h 每次反應(yīng)后分別測(cè)定酶活力水溶性酶水溶性酶水不溶性載體水不溶性載體固定化技術(shù)固定化技術(shù)水不溶性酶水不溶性酶（固定化酶）（固定化酶）什么是固定化酶？什么是固定化酶？固定化酶：是指經(jīng)物理或化學(xué)方法處理，限制固定化酶：是指經(jīng)物理或化學(xué)方法處理，限制在一定的空間范圍內(nèi)，可以反復(fù)使用而又能發(fā)在一定

3、的空間范圍內(nèi)，可以反復(fù)使用而又能發(fā)揮催化作用的酶制劑。揮催化作用的酶制劑。酶的固定化技術(shù)包括酶的固定化技術(shù)包括吸附、交聯(lián)、共價(jià)結(jié)合（吸附、交聯(lián)、共價(jià)結(jié)合（化學(xué)偶聯(lián)）及包埋化學(xué)偶聯(lián)）及包埋等多種方法。等多種方法。 與固定化酶技術(shù)相配套的與固定化酶技術(shù)相配套的是酶生物反應(yīng)器是酶生物反應(yīng)器同一般的化工容器一樣，需要對(duì)酶反應(yīng)同一般的化工容器一樣，需要對(duì)酶反應(yīng)器溫度和器溫度和pHpH等條件進(jìn)行嚴(yán)格的控制；不等條件進(jìn)行嚴(yán)格的控制；不同的是，酶反應(yīng)器必須進(jìn)行無(wú)菌操作。同的是，酶反應(yīng)器必須進(jìn)行無(wú)菌操作。19161916年，年，Nelson & Griffin “Nelson & Griffin

4、 “酶不溶于水而具有活性酶不溶于水而具有活性”19481948年，年，Sumner Sumner 尿素酶制成非溶性酶尿素酶制成非溶性酶19531953年，年，Grubhofer & SchleithGrubhofer & Schleith 第一次實(shí)現(xiàn)了酶的固定化第一次實(shí)現(xiàn)了酶的固定化19601960年，千細(xì)一郎，開(kāi)始了氨基酰化酶固定化研究年，千細(xì)一郎，開(kāi)始了氨基酰化酶固定化研究19691969年，千細(xì)一郎成功的將固定化氨基酰化酶應(yīng)用于年，千細(xì)一郎成功的將固定化氨基酰化酶應(yīng)用于DL-AADL-AA的的光學(xué)分析上光學(xué)分析上19711971年，固定化酶名稱(chēng)提出，年，固定化酶名稱(chēng)提出，

5、Immobilized enzymeImmobilized enzyme19731973年，固定化微生物的應(yīng)用年，固定化微生物的應(yīng)用固定化大腸桿菌中的固定化大腸桿菌中的天冬氨酸酶，由反丁烯二酸連續(xù)生產(chǎn)天冬氨酸酶，由反丁烯二酸連續(xù)生產(chǎn)L-L-天冬氨酸天冬氨酸19761976年，固定化酵母細(xì)胞生產(chǎn)啤酒和酒精年，固定化酵母細(xì)胞生產(chǎn)啤酒和酒精19781978年，日本用固定化細(xì)胞生產(chǎn)酶年，日本用固定化細(xì)胞生產(chǎn)酶固定化枯草桿菌固定化枯草桿菌生產(chǎn)淀粉酶生產(chǎn)淀粉酶19791979年，固定化植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞開(kāi)始研究年，固定化植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞開(kāi)始研究19821982年，日本首次研究用固定化原生質(zhì)生產(chǎn)氨基酸年，

6、日本首次研究用固定化原生質(zhì)生產(chǎn)氨基酸19861986年，郭勇等人固定化原生質(zhì)研究年，郭勇等人固定化原生質(zhì)研究穩(wěn)定性高；穩(wěn)定性高；酶可反復(fù)使用；酶可反復(fù)使用；產(chǎn)物純度高，極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物產(chǎn)物純度高，極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開(kāi)；分開(kāi)；固定化酶的反應(yīng)條件易于控制固定化酶的反應(yīng)條件易于控制生產(chǎn)可連續(xù)化和自動(dòng)化，節(jié)約勞動(dòng)力；生產(chǎn)可連續(xù)化和自動(dòng)化，節(jié)約勞動(dòng)力；設(shè)備小型化、可節(jié)約能源。設(shè)備小型化、可節(jié)約能源。固定化酶同自由酶相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：固定化酶同自由酶相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：固定化所需載體和試劑較貴，成本高，投資大固定化所需載體和試劑較貴，成本高，投資大固定化時(shí)，酶活力有損失固

7、定化時(shí)，酶活力有損失長(zhǎng)期生產(chǎn)，易污染，載體易降解，酶易失活長(zhǎng)期生產(chǎn)，易污染，載體易降解，酶易失活只能用于可溶性底物，較適用于小分子底物，對(duì)大只能用于可溶性底物，較適用于小分子底物，對(duì)大分子底物不適宜分子底物不適宜與完整菌體相比不適宜于多酶反應(yīng)，特別是需要輔與完整菌體相比不適宜于多酶反應(yīng)，特別是需要輔助因子的反應(yīng)助因子的反應(yīng)l必須注意維持酶的催化活性及專(zhuān)一性。必須注意維持酶的催化活性及專(zhuān)一性。酶與載體的結(jié)合部位不應(yīng)當(dāng)是酶的活性部位（酶活性中心的氨基酸殘基不發(fā)生變化）避免那些可能導(dǎo)致酶蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)破壞的條件。由于酶蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)是憑借氫鍵、疏水鍵和離子鍵等弱鍵維持，所以固定化時(shí)要采取盡量溫和的條件

8、，盡可能保護(hù)好酶蛋白的活性基團(tuán)?；驹瓌t：基本原則：l固定化應(yīng)該有利于生產(chǎn)自動(dòng)化、連續(xù)化。固定化應(yīng)該有利于生產(chǎn)自動(dòng)化、連續(xù)化。載體能抗一定的機(jī)械力。l固定化酶應(yīng)有最小的空間位阻。固定化酶應(yīng)有最小的空間位阻。l酶與載體必須結(jié)合牢固，利于固定化酶的回收及反酶與載體必須結(jié)合牢固，利于固定化酶的回收及反復(fù)使用。復(fù)使用。l固定化酶應(yīng)有最大的穩(wěn)定性，所選載體不與廢物、固定化酶應(yīng)有最大的穩(wěn)定性，所選載體不與廢物、產(chǎn)物或反應(yīng)液發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。產(chǎn)物或反應(yīng)液發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。l固定化酶成本要低，以利于工業(yè)使用。固定化酶成本要低，以利于工業(yè)使用。四大類(lèi)方法：四大類(lèi)方法：吸附法（包括電吸附法）吸附法（包括電吸附法）結(jié)合法（

9、無(wú)機(jī)多孔材料）結(jié)合法（無(wú)機(jī)多孔材料）交聯(lián)法（雙功能試劑）交聯(lián)法（雙功能試劑） 包埋法（微膠囊法）包埋法（微膠囊法） 指通過(guò)氫鍵、疏水作用、電子親和力等物理作用指通過(guò)氫鍵、疏水作用、電子親和力等物理作用，將酶吸附到固體吸附劑表面的方法。，將酶吸附到固體吸附劑表面的方法。優(yōu)點(diǎn)：操作條件溫和，固定化時(shí)酶分子的構(gòu)象優(yōu)點(diǎn)：操作條件溫和，固定化時(shí)酶分子的構(gòu)象較少或者不變化；載體廉價(jià)易得較少或者不變化；載體廉價(jià)易得缺點(diǎn)：結(jié)合力弱，易解吸附缺點(diǎn)：結(jié)合力弱，易解吸附選擇載體的原則選擇載體的原則 （1 1）要有巨大的比表面積）要有巨大的比表面積 （2 2） 要有活潑的表面要有活潑的表面 （3 3） 便于裝柱進(jìn)行連

10、續(xù)反應(yīng)便于裝柱進(jìn)行連續(xù)反應(yīng)。SMS:一種硅酸鹽載體有機(jī)載體：纖維素、骨膠原、火棉膠有機(jī)載體：纖維素、骨膠原、火棉膠無(wú)機(jī)載體：氧化鉛、皂土、白土、無(wú)機(jī)載體：氧化鉛、皂土、白土、高嶺土、多孔玻璃、高嶺土、多孔玻璃、硅藻土、二氧化鈦等硅藻土、二氧化鈦等離子鍵結(jié)合法是指通過(guò)離子鍵將酶結(jié)合到具有離子交換基團(tuán)的非水溶性載是指通過(guò)離子鍵將酶結(jié)合到具有離子交換基團(tuán)的非水溶性載體上的方法。體上的方法。l陰離子交換劑：陰離子交換劑：DEAE-DEAE-纖維素，纖維素，DEAE-DEAE-葡聚糖凝膠，葡聚糖凝膠，AmberliteAmberlite IRA-93IRA-93，410410，900900；陽(yáng)離子交換劑

11、：陽(yáng)離子交換劑：CM-CM-纖維素，纖維素，AmberliteAmberlite CG-50 CG-50，IRC-50IRC-50，IR-IR-120120，Dowex-50Dowex-50等。等。l使用注意使用注意：pHpH、離子強(qiáng)度、溫度、離子強(qiáng)度、溫度l離子結(jié)合法的離子結(jié)合法的操作簡(jiǎn)單，處理?xiàng)l件溫和操作簡(jiǎn)單，處理?xiàng)l件溫和，酶的高，酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)和活性中心的氨基酸殘基不易被破壞，能級(jí)結(jié)構(gòu)和活性中心的氨基酸殘基不易被破壞，能得到酶活回收率較高的固定化酶。得到酶活回收率較高的固定化酶。l但是載體和酶的結(jié)合力比較弱，容易受緩沖液種但是載體和酶的結(jié)合力比較弱，容易受緩沖液種類(lèi)或類(lèi)或pHpH的影響，在

12、的影響，在離子強(qiáng)度高的條件下進(jìn)行反應(yīng)離子強(qiáng)度高的條件下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，酶往往會(huì)從載體上脫落。時(shí)，酶往往會(huì)從載體上脫落。l這是酶與載體以共價(jià)鍵結(jié)合的固定化方法，是這是酶與載體以共價(jià)鍵結(jié)合的固定化方法，是載體結(jié)合法中報(bào)道最多的方法。載體結(jié)合法中報(bào)道最多的方法。l歸納起來(lái)有二類(lèi)：歸納起來(lái)有二類(lèi)：l將載體有關(guān)基團(tuán)活化，然后與酶有關(guān)基團(tuán)將載體有關(guān)基團(tuán)活化，然后與酶有關(guān)基團(tuán)發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)。發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)。l在載體上接上一個(gè)雙功能試劑，然后將酶在載體上接上一個(gè)雙功能試劑，然后將酶偶聯(lián)上去。偶聯(lián)上去。( (與交聯(lián)法合用）與交聯(lián)法合用）酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)和載體表面上的功能基團(tuán)之間形成共酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)和載體表面上的功能基

13、團(tuán)之間形成共價(jià)鍵而固定的方法。價(jià)鍵而固定的方法。l可以形成共價(jià)鍵的基團(tuán)：可以形成共價(jià)鍵的基團(tuán)： 游離氨基，游離氨基， 游離羧基，游離羧基， 巰巰基，基， 咪唑基，咪唑基， 酚基，酚基， 羥基，羥基， 甲硫基，甲硫基， 吲哚基，二吲哚基，二硫鍵硫鍵l常用載體：天然高分子、人工合成的高聚物、無(wú)機(jī)載常用載體：天然高分子、人工合成的高聚物、無(wú)機(jī)載體體首先載體上引進(jìn)活潑基團(tuán)首先載體上引進(jìn)活潑基團(tuán) 然后活化該活潑基團(tuán)然后活化該活潑基團(tuán) 最后此活潑基團(tuán)再與酶分子上某一基團(tuán)形成共價(jià)鍵最后此活潑基團(tuán)再與酶分子上某一基團(tuán)形成共價(jià)鍵關(guān)鍵關(guān)鍵載體活化載體活化活化基團(tuán)酶分子基團(tuán)活化基團(tuán)酶分子基團(tuán)酶分子和載體連接的功能基

14、團(tuán)：酶分子和載體連接的功能基團(tuán)：酶蛋白酶蛋白N-N-端的端的- -氨基或賴(lài)氨酸殘基的氨基氨基或賴(lài)氨酸殘基的氨基酶蛋白酶蛋白C-C-端的羧基以及端的羧基以及AspAsp殘基的殘基的- -和和- -羧基羧基CysCys殘基的巰基殘基的巰基SerSer、TyrTyr、ThrThr殘基的羥基殘基的羥基PhePhe、TyrTyr殘基的苯環(huán)殘基的苯環(huán)HisHis殘基的咪唑基殘基的咪唑基TrpTrp殘基的吲哚基殘基的吲哚基lA A重氮法重氮法lB B疊氮法疊氮法lC C烷基化反應(yīng)法烷基化反應(yīng)法lD D硅烷化法硅烷化法lE E溴化氰法溴化氰法載體活化的方法載體活化的方法l優(yōu)點(diǎn)：酶與載體結(jié)合牢固，一般不會(huì)因底物

15、濃度高優(yōu)點(diǎn)：酶與載體結(jié)合牢固，一般不會(huì)因底物濃度高或存在鹽類(lèi)等原因而輕易脫落?；虼嬖邴}類(lèi)等原因而輕易脫落。l缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：l該方法反應(yīng)條件苛刻，操作復(fù)雜；該方法反應(yīng)條件苛刻，操作復(fù)雜；l由于采用了比較激烈的反應(yīng)條件，會(huì)引起酶蛋白由于采用了比較激烈的反應(yīng)條件，會(huì)引起酶蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)變化，因此往往不能得到比活高的固定高級(jí)結(jié)構(gòu)變化，因此往往不能得到比活高的固定化酶，酶活回收率一般為化酶，酶活回收率一般為3030左右，甚至底物的左右，甚至底物的專(zhuān)一性等酶的性質(zhì)也會(huì)發(fā)生變化。專(zhuān)一性等酶的性質(zhì)也會(huì)發(fā)生變化。l只能用于酶，不能用于微生物的固定化只能用于酶，不能用于微生物的固定化是指通過(guò)雙功能試劑，將酶是指通過(guò)雙

16、功能試劑，將酶和酶聯(lián)結(jié)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的方法和酶聯(lián)結(jié)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的方法OH(CH2)3CHO+E-CH=N-E-N=CH(CH2)3CH=N-E-N=CH-NCH(CH2)3CHN-CH=N-E-N=CH(CH2)3CH=N-E-N=CH-交聯(lián)法使用的交聯(lián)劑是戊二醛、交聯(lián)法使用的交聯(lián)劑是戊二醛、己二胺、雙偶氮苯等水溶性化合己二胺、雙偶氮苯等水溶性化合物。物。戊二醛的兩個(gè)醛基都可以與酶或者蛋白質(zhì)的游離氨基酸反應(yīng)，形成Schiff堿，從而使酶或者菌體蛋白交聯(lián)，形成固定化酶或固定化菌體。l例：采用天然高分子聚合物幾丁質(zhì)作載體，以戊二醛為交聯(lián)劑，通過(guò)化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)將纖維素酶固定在幾丁質(zhì)上，在戊二醛濃度1.25%

17、，pH值4.0時(shí)固定纖維素酶，該固定化酶的半衰期為60天。用于降解殼聚糖，效果明顯。l交聯(lián)法反應(yīng)條件比較激烈，固定化的酶活回收率交聯(lián)法反應(yīng)條件比較激烈，固定化的酶活回收率一般較低，但是盡可能降低交聯(lián)劑濃度和縮短反一般較低，但是盡可能降低交聯(lián)劑濃度和縮短反應(yīng)時(shí)間將有利于固定化酶比活的提高。應(yīng)時(shí)間將有利于固定化酶比活的提高。l單獨(dú)使用交聯(lián)法所得到的固定化酶顆粒小、機(jī)械單獨(dú)使用交聯(lián)法所得到的固定化酶顆粒小、機(jī)械性能差，酶活低，故常與其他方法聯(lián)用性能差，酶活低，故常與其他方法聯(lián)用酶分子之間共價(jià)交聯(lián)和與水不溶性載體共價(jià)偶聯(lián)酶分子之間共價(jià)交聯(lián)和與水不溶性載體共價(jià)偶聯(lián) 酶分子酶分子: :（a a）酶分子之間

18、用雙功能基團(tuán)的化學(xué)交聯(lián)試劑相互交聯(lián)成水不溶性的固定化酶）酶分子之間用雙功能基團(tuán)的化學(xué)交聯(lián)試劑相互交聯(lián)成水不溶性的固定化酶（b b）酶分子被偶聯(lián)到水不溶性載體上形成水不溶性的固定化酶）酶分子被偶聯(lián)到水不溶性載體上形成水不溶性的固定化酶是指將酶或含酶微生物包裹在多孔的載體中。是指將酶或含酶微生物包裹在多孔的載體中。網(wǎng)格型網(wǎng)格型；微囊型微囊型。 網(wǎng)格法網(wǎng)格法將酶分子或微生物包埋在凝膠格子里。將酶分子或微生物包埋在凝膠格子里。天然凝膠：瓊脂凝膠、海藻酸鈣凝膠、角叉菜膠、明膠等天然凝膠：瓊脂凝膠、海藻酸鈣凝膠、角叉菜膠、明膠等合成材料：聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏樹(shù)脂等。合成材料：聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光

19、敏樹(shù)脂等。網(wǎng)格型包埋法是固定化微生物中用得最多、最有效的方法。網(wǎng)格型包埋法是固定化微生物中用得最多、最有效的方法。半透膜包埋法（微囊化法）：半透膜包埋法（微囊化法）： 將酶包埋在有各種高分子聚合物制成的小囊中，將酶包埋在有各種高分子聚合物制成的小囊中，制成固定化酶。制成固定化酶。 半透膜：聚酰胺膜、火棉膠膜等半透膜：聚酰胺膜、火棉膠膜等l微囊型固定化酶通常直微囊型固定化酶通常直徑為幾微米到幾百微米徑為幾微米到幾百微米的球狀體，顆粒比網(wǎng)格的球狀體，顆粒比網(wǎng)格型要小得多，比較有利型要小得多，比較有利于底物和產(chǎn)物擴(kuò)散，但于底物和產(chǎn)物擴(kuò)散，但是反應(yīng)條件要求高，制是反應(yīng)條件要求高，制備成本也高。備成本也

20、高。 微囊發(fā)生器微囊發(fā)生器比較項(xiàng)目比較項(xiàng)目吸附法吸附法結(jié)合法結(jié)合法 交聯(lián)法交聯(lián)法包埋法包埋法物理吸附物理吸附.共價(jià)鍵結(jié)合共價(jià)鍵結(jié)合離子鍵結(jié)合離子鍵結(jié)合 制備難易制備難易易易難難易易 較難較難較難較難固定化程度固定化程度弱弱強(qiáng)強(qiáng)中等中等 強(qiáng)強(qiáng)強(qiáng)強(qiáng)活力回收率活力回收率較高較高低低高高 中等中等高高載體再生載體再生可能可能不可能不可能可能可能 不可能不可能不可能不可能費(fèi)用費(fèi)用低低高高低低 中等中等低低底物專(zhuān)一性底物專(zhuān)一性不變不變可變可變不變不變 可變可變不變不變適用性適用性酶源多酶源多較廣較廣廣泛廣泛 較廣較廣小分子底小分子底物、藥用物、藥用酶酶l沒(méi)有一個(gè)方法是十全十美的沒(méi)有一個(gè)方法是十全十美的l包

21、埋、共價(jià)結(jié)合、共價(jià)交聯(lián)三種雖結(jié)合力強(qiáng)、但不包埋、共價(jià)結(jié)合、共價(jià)交聯(lián)三種雖結(jié)合力強(qiáng)、但不能再生、回收；能再生、回收；l吸附法制備簡(jiǎn)單，成本低，能回收再生，但結(jié)合差吸附法制備簡(jiǎn)單，成本低，能回收再生，但結(jié)合差，在受到離子強(qiáng)度、，在受到離子強(qiáng)度、pHpH變化影響后，酶會(huì)從載體上變化影響后，酶會(huì)從載體上游離下來(lái)。游離下來(lái)。l包埋法各方面較好，但不適于大分子底物和產(chǎn)物。包埋法各方面較好，但不適于大分子底物和產(chǎn)物。其他固定化酶方法l結(jié)晶法：結(jié)晶法：l分散法：分散法：l熱處理法熱處理法l等等等等判斷固定化方法的優(yōu)劣及其固定化酶的實(shí)用性的指標(biāo)有判斷固定化方法的優(yōu)劣及其固定化酶的實(shí)用性的指標(biāo)有: : (1) (

22、1)相對(duì)酶活力相對(duì)酶活力l具有相同酶蛋白量的固定化酶與游離酶活力的比值具有相同酶蛋白量的固定化酶與游離酶活力的比值l通常高于通常高于75%75% (2) (2)酶的活力回收率酶的活力回收率l固定化酶的總活力與用于固定化的酶的活力之百分比稱(chēng)為酶的活力固定化酶的總活力與用于固定化的酶的活力之百分比稱(chēng)為酶的活力回收率?；厥章省一般情況下一般情況下, ,活力回收率應(yīng)小于活力回收率應(yīng)小于1,1,若大于若大于1,1,可能由于固定化活細(xì)胞增可能由于固定化活細(xì)胞增殖或某些抑制因素排除的結(jié)果殖或某些抑制因素排除的結(jié)果. . (3)(3)固定化酶的半衰期固定化酶的半衰期 衡量操作穩(wěn)定性的關(guān)鍵衡量操作穩(wěn)定性的關(guān)鍵

23、. .固定化酶的過(guò)程中還存在幾個(gè)亟待解決解決的難題固定化酶的過(guò)程中還存在幾個(gè)亟待解決解決的難題 ：l酶的活性中心發(fā)生物理化學(xué)變化導(dǎo)致酶活力降低酶的活性中心發(fā)生物理化學(xué)變化導(dǎo)致酶活力降低l酶固定化后多了空間屏障酶固定化后多了空間屏障, ,增加了傳質(zhì)阻增加了傳質(zhì)阻力力l酶和載體結(jié)合不牢固酶和載體結(jié)合不牢固, ,容易脫落容易脫落, ,酶活力損失大酶活力損失大l固定化顆粒成型困難固定化顆粒成型困難 固定化技術(shù)的改進(jìn)固定化技術(shù)的改進(jìn)l定點(diǎn)固定化技術(shù)定點(diǎn)固定化技術(shù) l抗體偶聯(lián)、生物素親和素親和、氨基酸置換（抗體偶聯(lián)、生物素親和素親和、氨基酸置換（CysCys）l多酶系統(tǒng)的共固定化多酶系統(tǒng)的共固定化l多種酶

24、同時(shí)固定在膜材料上多種酶同時(shí)固定在膜材料上, ,利用各自的功能協(xié)同催化復(fù)雜利用各自的功能協(xié)同催化復(fù)雜的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程l新型的固定化技術(shù)新型的固定化技術(shù)l高分子技術(shù)、納米技術(shù)、光、輻射等作用高分子技術(shù)、納米技術(shù)、光、輻射等作用 l加入表面活性劑加入表面活性劑 l可使酶活性大幅度提高，最高的達(dá)可使酶活性大幅度提高，最高的達(dá)100100 倍，并增加了酶使倍，并增加了酶使用次數(shù)用次數(shù)l等等等等l不同制備方法，對(duì)酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生的影響不同不同制備方法，對(duì)酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生的影響不同l假定：假定：l酶固定化后，在載體表面或多孔介質(zhì)中的分布酶固定化后，在載體表面或多孔介質(zhì)中的分布完全均質(zhì)完全均質(zhì)l整個(gè)

25、系統(tǒng)各相同性整個(gè)系統(tǒng)各相同性l固定化酶制備物的性質(zhì)取決于所用的酶及固定化酶制備物的性質(zhì)取決于所用的酶及載體材料的性質(zhì)及相互作用。載體材料的性質(zhì)及相互作用。成分成分參數(shù)參數(shù)酶酶生物化學(xué)性質(zhì)：生物化學(xué)性質(zhì)：分子量，輔基，蛋白質(zhì)表面的功能基團(tuán)，純度（雜質(zhì)的失活或保護(hù)作用）分子量，輔基，蛋白質(zhì)表面的功能基團(tuán)，純度（雜質(zhì)的失活或保護(hù)作用）動(dòng)力學(xué)參數(shù)：動(dòng)力學(xué)參數(shù)：專(zhuān)一性，專(zhuān)一性，pHpH及溫度曲線(xiàn)，活性及抑制性的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，對(duì)及溫度曲線(xiàn)，活性及抑制性的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，對(duì)pHpH，溫度，溶劑，去污劑及雜，溫度，溶劑，去污劑及雜質(zhì)的穩(wěn)定性質(zhì)的穩(wěn)定性。載體載體化學(xué)特征：化學(xué)特征：化學(xué)組成，功能基，膨脹行為，基質(zhì)的可

26、及體積，微孔大小及載體的化學(xué)穩(wěn)定性化學(xué)組成，功能基，膨脹行為，基質(zhì)的可及體積，微孔大小及載體的化學(xué)穩(wěn)定性 機(jī)械性質(zhì)：機(jī)械性質(zhì)：顆粒直徑，單顆粒壓縮行為，流動(dòng)抗性（固定床反應(yīng)器），沉降速率（流體床），對(duì)攪顆粒直徑，單顆粒壓縮行為，流動(dòng)抗性（固定床反應(yīng)器），沉降速率（流體床），對(duì)攪拌罐的磨損。拌罐的磨損。固定固定化酶化酶固定化方法：固定化方法： 所結(jié)合的蛋白所結(jié)合的蛋白, ,活性酶的產(chǎn)量活性酶的產(chǎn)量, ,內(nèi)在的動(dòng)力學(xué)參數(shù)內(nèi)在的動(dòng)力學(xué)參數(shù)質(zhì)量轉(zhuǎn)移效應(yīng)質(zhì)量轉(zhuǎn)移效應(yīng): :分配效應(yīng)（催化劑顆粒內(nèi)外不同的溶質(zhì)濃度），外部或內(nèi)部（微孔）擴(kuò)散效應(yīng)；這些給分配效應(yīng)（催化劑顆粒內(nèi)外不同的溶質(zhì)濃度），外部或內(nèi)部（微孔

27、）擴(kuò)散效應(yīng)；這些給出了游離酶在合適反應(yīng)條件下的效率。出了游離酶在合適反應(yīng)條件下的效率。穩(wěn)定性穩(wěn)定性: :操作穩(wěn)定性操作穩(wěn)定性( (表示為工作條件下的活性降低表示為工作條件下的活性降低) )，貯藏穩(wěn)定性，貯藏穩(wěn)定性效能效能: :生產(chǎn)力（產(chǎn)品量生產(chǎn)力（產(chǎn)品量/ /單位活性或酶量），酶的消耗（酶單位數(shù)單位活性或酶量），酶的消耗（酶單位數(shù)/ /公斤產(chǎn)品）公斤產(chǎn)品）l酶本身的變化酶本身的變化: :主要由于活性中心的氨基酸殘基、高級(jí)結(jié)構(gòu)和電荷狀主要由于活性中心的氨基酸殘基、高級(jí)結(jié)構(gòu)和電荷狀態(tài)等發(fā)生變化態(tài)等發(fā)生變化; ;l載體的影響載體的影響：在固定化酶的周?chē)纬闪四軐?duì)底物產(chǎn)生立體影響的在固定化酶的周?chē)?/p>

28、形成了能對(duì)底物產(chǎn)生立體影響的擴(kuò)散層以及靜電的相互作用等引起的變化。擴(kuò)散層以及靜電的相互作用等引起的變化。l載體與酶的相互作用：載體與酶的相互作用：載體與酶的直接作用可能表現(xiàn)為活力喪失、破壞酶結(jié)載體與酶的直接作用可能表現(xiàn)為活力喪失、破壞酶結(jié)構(gòu)、封閉酶活性部位等。構(gòu)、封閉酶活性部位等。l構(gòu)象改變：構(gòu)象改變： 酶分子構(gòu)象發(fā)生某種扭曲，導(dǎo)致酶分子構(gòu)象發(fā)生某種扭曲，導(dǎo)致酶與底物結(jié)合能力或催化能力下降酶與底物結(jié)合能力或催化能力下降l立體屏蔽：立體屏蔽： 固定化后，使得酶的活性中心或固定化后，使得酶的活性中心或調(diào)節(jié)部位造成某種空間障礙，使得效調(diào)節(jié)部位造成某種空間障礙，使得效應(yīng)物或者底物與酶的臨近或者接觸受應(yīng)

29、物或者底物與酶的臨近或者接觸受到干擾到干擾l微環(huán)境：微環(huán)境：微環(huán)境微環(huán)境是指在固定化酶附近是指在固定化酶附近的局部環(huán)境，而把主體溶液的局部環(huán)境，而把主體溶液稱(chēng)為稱(chēng)為宏觀環(huán)境宏觀環(huán)境。l分配效應(yīng)：分配效應(yīng)：由于載體性質(zhì)，造成底物和由于載體性質(zhì)，造成底物和效應(yīng)物等在微觀體系和宏觀效應(yīng)物等在微觀體系和宏觀體系之間的不等性分配，從體系之間的不等性分配，從而影響酶促反應(yīng)速度而影響酶促反應(yīng)速度l擴(kuò)散限制效應(yīng)：底物、產(chǎn)物和效應(yīng)物等，在環(huán)擴(kuò)散限制效應(yīng)：底物、產(chǎn)物和效應(yīng)物等，在環(huán)境中的遷移運(yùn)轉(zhuǎn)速度收到限制境中的遷移運(yùn)轉(zhuǎn)速度收到限制DEAE 纖維素固定化殼聚糖酶纖維素固定化殼聚糖酶: :以以DEAE DEAE 纖

30、維素為載體戊二醛為交聯(lián)劑纖維素為載體戊二醛為交聯(lián)劑固定殼聚糖酶固定殼聚糖酶l由于載體的親水、疏水作用和介質(zhì)的介電常數(shù)等由于載體的親水、疏水作用和介質(zhì)的介電常數(shù)等性質(zhì)性質(zhì), , 直接影響酶的催化能力或酶對(duì)效應(yīng)物作出直接影響酶的催化能力或酶對(duì)效應(yīng)物作出反應(yīng)的能力反應(yīng)的能力l固定化酶的活力在固定化酶的活力在多數(shù)情況多數(shù)情況下比天然酶小，其專(zhuān)一性也能發(fā)下比天然酶小，其專(zhuān)一性也能發(fā)生改變。生改變。l例如：例如：用羧甲基纖維素載體固定的胰蛋白酶消化不同底物：用羧甲基纖維素載體固定的胰蛋白酶消化不同底物： 酪蛋白（酪蛋白（高分子）原酶活力的高分子）原酶活力的3030% % 苯酞精氨酸苯酞精氨酸- -對(duì)硝基酰

31、替苯胺對(duì)硝基酰替苯胺( (低分子低分子) )原酶活力的原酶活力的8080% %。一般認(rèn)為高分子底物受到一般認(rèn)為高分子底物受到空間位阻的影響空間位阻的影響比低比低分子底物大。分子底物大。l原因：原因：酶結(jié)構(gòu)的變化酶結(jié)構(gòu)的變化 空間位阻空間位阻l不過(guò)，也有個(gè)別情況，酶在固定化后反不過(guò)，也有個(gè)別情況，酶在固定化后反而比原酶活力提高，原因可能是偶聯(lián)過(guò)而比原酶活力提高，原因可能是偶聯(lián)過(guò)程中酶得到化學(xué)修飾，或固定化過(guò)程提程中酶得到化學(xué)修飾，或固定化過(guò)程提高了酶的穩(wěn)定性。高了酶的穩(wěn)定性。l在同一測(cè)定條件下，固定化酶的活力要低于等摩爾原酶的在同一測(cè)定條件下，固定化酶的活力要低于等摩爾原酶的活力的原因可能是：活

32、力的原因可能是：v酶分子在固定化過(guò)程中，空間構(gòu)象會(huì)有所變化，甚至影酶分子在固定化過(guò)程中，空間構(gòu)象會(huì)有所變化，甚至影響了活性中心的氨基酸；響了活性中心的氨基酸；v固定化后，酶分子空間自由度受到限制（空間位阻），固定化后，酶分子空間自由度受到限制（空間位阻），會(huì)直接影響到活性中心對(duì)底物的定位作用；會(huì)直接影響到活性中心對(duì)底物的定位作用；v內(nèi)擴(kuò)散阻力使底物分子與活性中心的接近受阻；內(nèi)擴(kuò)散阻力使底物分子與活性中心的接近受阻；v包埋時(shí)酶被高分子物質(zhì)半透膜包圍，大分子底物不能過(guò)包埋時(shí)酶被高分子物質(zhì)半透膜包圍，大分子底物不能過(guò)膜與酶接近。膜與酶接近。lMerloseMerlose曾選擇曾選擇5050種固定化酶

33、，就其穩(wěn)定性與固定化前的酶種固定化酶，就其穩(wěn)定性與固定化前的酶進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)：進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)：l3030種酶穩(wěn)定性提高，種酶穩(wěn)定性提高，l1212種酶無(wú)變化，種酶無(wú)變化，l8 8種酶穩(wěn)定性降低。種酶穩(wěn)定性降低。l然而，由于目前尚未找到固定化方法與穩(wěn)定性之間規(guī)律性，然而，由于目前尚未找到固定化方法與穩(wěn)定性之間規(guī)律性，因此要預(yù)測(cè)怎樣才能提高穩(wěn)定性還有一定困難，但因此要預(yù)測(cè)怎樣才能提高穩(wěn)定性還有一定困難，但大多數(shù)情大多數(shù)情況下酶經(jīng)過(guò)固定化后穩(wěn)定性提高了況下酶經(jīng)過(guò)固定化后穩(wěn)定性提高了。l可能有以下幾點(diǎn)：可能有以下幾點(diǎn)：v固定化后酶分子與載體多點(diǎn)連接，可防止酶固定化后酶分子與載體多點(diǎn)連接，可防止酶分子伸

34、展變形。分子伸展變形。v酶活力的緩慢釋放。酶活力的緩慢釋放。v抑制酶的自降解。將酶與固態(tài)載體結(jié)合后，抑制酶的自降解。將酶與固態(tài)載體結(jié)合后，由于酶失去了分子間相互作用的機(jī)會(huì)，從而抑由于酶失去了分子間相互作用的機(jī)會(huì)，從而抑制了降解制了降解v 固定化青霉素?；腹潭ɑ嗝顾仵；竩 將酶于將酶于0.05 mol0.05 molL L的的PBSPBS（pH 7.5pH 7.5）中分別在）中分別在不同溫度下保溫不同溫度下保溫6 6小時(shí)，小時(shí)，冷卻后測(cè)定酶活力。冷卻后測(cè)定酶活力。v 固定化酶的熱穩(wěn)定性?xún)?yōu)固定化酶的熱穩(wěn)定性?xún)?yōu)于自然酶于自然酶。固定化酶的穩(wěn)定性變化固定化酶的穩(wěn)定性變化1.1.固定化酶；固定化酶

35、；2. 2. 自然酶自然酶l測(cè)試結(jié)果測(cè)試結(jié)果:5:5天后其活性仍可保留天后其活性仍可保留96% .96% .例例:將將DEAE 纖維素固定化殼聚糖酶纖維素固定化殼聚糖酶浸泡在浸泡在95%的的乙醇乙醇中，中，連續(xù)連續(xù)5天測(cè)其催化活性天測(cè)其催化活性 l提高固定化酶對(duì)各種有機(jī)溶劑的穩(wěn)定性，使本來(lái)提高固定化酶對(duì)各種有機(jī)溶劑的穩(wěn)定性，使本來(lái)不能在有機(jī)溶劑中進(jìn)行的酶反應(yīng)成為可能。不能在有機(jī)溶劑中進(jìn)行的酶反應(yīng)成為可能。l提高酶對(duì)某些抑制劑的穩(wěn)定性提高酶對(duì)某些抑制劑的穩(wěn)定性l可以預(yù)計(jì)，今后固定化酶在有機(jī)合成中應(yīng)用會(huì)進(jìn)可以預(yù)計(jì)，今后固定化酶在有機(jī)合成中應(yīng)用會(huì)進(jìn)一步發(fā)展。一步發(fā)展。l青霉素?；冈诓煌嗝顾仵；?/p>

36、在不同pHpH值的緩沖液中，于值的緩沖液中，于37 37 保溫保溫16 h16 h測(cè)定酶活力。測(cè)定酶活力。l固定化酶在固定化酶在pH 5.5-pH 5.5-10.310.3活力穩(wěn)定；活力穩(wěn)定；l游離酶則僅在游離酶則僅在 pH pH 7.0-9.07.0-9.0穩(wěn)定。穩(wěn)定。l固定化酶的固定化酶的pHpH穩(wěn)定性明穩(wěn)定性明顯優(yōu)于游離酶。顯優(yōu)于游離酶。 固定化后載體與酶的緊密連接對(duì)其起一定保護(hù)作用固定化后載體與酶的緊密連接對(duì)其起一定保護(hù)作用, , 并在空間上阻礙酶與大分子物質(zhì)接近并在空間上阻礙酶與大分子物質(zhì)接近, , 從而降低了酶與從而降低了酶與大分子物質(zhì)結(jié)合的幾率大分子物質(zhì)結(jié)合的幾率, ,防止酶被其

37、他蛋白酶水解防止酶被其他蛋白酶水解. .l有些固定化酶經(jīng)過(guò)貯藏，可以提高其活性。有些固定化酶經(jīng)過(guò)貯藏，可以提高其活性。 大多數(shù)酶經(jīng)固定化后提高了貯藏的穩(wěn)定性，如固定化木瓜蛋白酶（瓊脂）在4下，120天酶活力無(wú)變化。對(duì)操作穩(wěn)定性都有影響對(duì)操作穩(wěn)定性都有影響 如圖：固定化酶的最適如圖：固定化酶的最適溫度為溫度為6060C C ，而游離酶而游離酶的最適溫度為的最適溫度為5050C C 而固而固定化酶在定化酶在50- 6550- 65C C 范圍范圍內(nèi)都保持了較高的酶活力內(nèi)都保持了較高的酶活力, ,這說(shuō)明殼聚酶經(jīng)固定化這說(shuō)明殼聚酶經(jīng)固定化后其在較高溫度下的適應(yīng)后其在較高溫度下的適應(yīng)范圍有了明顯提高范圍

38、有了明顯提高固定化后，酶的熱穩(wěn)定性提高，固定化后，酶的熱穩(wěn)定性提高，所以固定化酶的最適溫度提高所以固定化酶的最適溫度提高當(dāng)然，也有報(bào)道最適溫度不變或下降的。當(dāng)然，也有報(bào)道最適溫度不變或下降的。l酶的催化能力對(duì)外部環(huán)境特別是酶的催化能力對(duì)外部環(huán)境特別是pHpH非常敏感。非常敏感。l酶固定化后，對(duì)底物作用的最適酶固定化后，對(duì)底物作用的最適pHpH和和pH-pH-活性活性曲線(xiàn)常常發(fā)生偏移。曲線(xiàn)常常發(fā)生偏移。l1 1） 載體帶負(fù)電荷，載體帶負(fù)電荷，pHpH向堿性方向移動(dòng)。向堿性方向移動(dòng)。 載體帶正電荷，載體帶正電荷，pHpH向酸性方向移動(dòng)。向酸性方向移動(dòng)。（2 2）產(chǎn)物性質(zhì)對(duì)體系）產(chǎn)物性質(zhì)對(duì)體系pHp

39、H的影響的影響l催化反應(yīng)的產(chǎn)物為酸性時(shí)，固定化酶的最適催化反應(yīng)的產(chǎn)物為酸性時(shí)，固定化酶的最適pHpH比游離酶的最適比游離酶的最適pHpH值；反之則低值；反之則低l例例: :取取0.2g DEAE 0.2g DEAE 纖維素固定化殼聚糖酶與纖維素固定化殼聚糖酶與5mL5mL殼殼聚糖酶液各聚糖酶液各8 8份分別于不同份分別于不同pHpH下測(cè)定固定化酶和游下測(cè)定固定化酶和游離酶的活力離酶的活力可見(jiàn)：固定化酶的最適可見(jiàn)：固定化酶的最適pH pH 向酸性偏移向酸性偏移l例：取例：取0.15g0.15g固定化黃曲固定化黃曲霉毒素解毒酶霉毒素解毒酶 和和4ML4ML黃曲黃曲霉毒素解毒酶霉毒素解毒酶 液各液各

40、8 8份，份，分別于不同分別于不同pHpH下測(cè)定固定下測(cè)定固定化酶和游離酶的活力化酶和游離酶的活力 可見(jiàn)：固定化酶的最適可見(jiàn)：固定化酶的最適pH pH 向堿性偏移向堿性偏移l影響固定化酶影響固定化酶K Km m的因素：的因素： 1.1.酶的空間立體障礙酶的空間立體障礙l載體為電中性時(shí)，由于載體為電中性時(shí)，由于擴(kuò)散限制擴(kuò)散限制造成表觀造成表觀KmKm上升。上升。 2. 2. 電荷效應(yīng)電荷效應(yīng)l（1 1） 載體與底物帶相同電荷，載體與底物帶相同電荷，KmKmKmKml（2 2） 載體與底物電荷相反，靜電作用，載體與底物電荷相反，靜電作用，KmKmKmKm 3. 3.溶液的離子強(qiáng)度溶液的離子強(qiáng)度l例

41、：例：取取DEAE DEAE 纖維素固定化纖維素固定化殼聚糖酶殼聚糖酶0.2g 0.2g 與與1%1%殼聚糖殼聚糖酶液酶液5mL 5mL 各各6 6 份分別加入份分別加入2mL 2mL 不同濃度的不同濃度的殼聚糖溶殼聚糖溶液液(0.4% 1.5%)(0.4% 1.5%)于于5050C C 水水浴中保溫浴中保溫60min 60min 測(cè)定還原測(cè)定還原糖濃度，用雙倒數(shù)作圖求糖濃度，用雙倒數(shù)作圖求得米氏常數(shù)得米氏常數(shù)如圖如圖 ：經(jīng)線(xiàn)性擬合可求得：經(jīng)線(xiàn)性擬合可求得K Km(m(固固)=18.87g/L)=18.87g/LK Km(m(游游) ) =2.49g/L =2.49g/L l本實(shí)驗(yàn)中選用的載體

42、本實(shí)驗(yàn)中選用的載體DEAE DEAE 纖維素纖維素和底物和底物殼聚糖殼聚糖所所帶電荷相反使得帶電荷相反使得K Km m 值降低；酶固定化后產(chǎn)生的空值降低；酶固定化后產(chǎn)生的空間立體障礙或間立體障礙或擴(kuò)散阻力擴(kuò)散阻力使得使得K Km m 值升高值升高, , 從實(shí)驗(yàn)從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出固定化過(guò)程中載體所帶的電荷的極結(jié)果可以得出固定化過(guò)程中載體所帶的電荷的極性對(duì)本實(shí)驗(yàn)室所提取的性對(duì)本實(shí)驗(yàn)室所提取的殼聚糖酶殼聚糖酶的米氏常數(shù)的影的米氏常數(shù)的影響較酶經(jīng)固定化后所產(chǎn)生的響較酶經(jīng)固定化后所產(chǎn)生的空間擴(kuò)散阻力空間擴(kuò)散阻力對(duì)酶的對(duì)酶的米氏常數(shù)的影響小米氏常數(shù)的影響小 ，所以最后酶，所以最后酶KmKm提高。提高。l一

43、般評(píng)價(jià)：一般評(píng)價(jià)：l1 1 酶活定義（酶活定義（IU)IU)：在特定條件下，每一分鐘：在特定條件下，每一分鐘催化一個(gè)微摩爾底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量定義為催化一個(gè)微摩爾底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量定義為1 1個(gè)酶活單位。個(gè)酶活單位。l2. 2. 酶比活定義（游離）：每毫克所具有的酶酶比活定義（游離）：每毫克所具有的酶活力單位活力單位l1. 1. 固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶活力單位。的酶活力單位。l或：?jiǎn)挝幻娣e（或：?jiǎn)挝幻娣e（cmcm2 2）的酶活力單位表示（酶膜、）的酶活力單位表示（酶膜、酶管、酶板）。酶管、酶板）。l2. 2. 操作半衰期：衡量穩(wěn)定

44、性的指標(biāo)。操作半衰期：衡量穩(wěn)定性的指標(biāo)。l 連續(xù)測(cè)活條件下固定化酶活力下降為最初活連續(xù)測(cè)活條件下固定化酶活力下降為最初活力一半所需要的時(shí)間（力一半所需要的時(shí)間（t t1/21/2）3.3.偶聯(lián)效率以載體結(jié)合酶量偶聯(lián)效率以載體結(jié)合酶量( (或酶活力或酶活力) )的百分?jǐn)?shù)表示：的百分?jǐn)?shù)表示：由于在偶聯(lián)反應(yīng)中酶往往會(huì)有些失活，因此，測(cè)由于在偶聯(lián)反應(yīng)中酶往往會(huì)有些失活，因此，測(cè)定殘留活力還不能正確反映與載體結(jié)合的酶活力，定殘留活力還不能正確反映與載體結(jié)合的酶活力，所以，仍以測(cè)定蛋白量較為難確。所以，仍以測(cè)定蛋白量較為難確。l4. 活力回收 酶固定化般比溶液酶的活力下降，固定化酶活力占溶液酶活力的百分?jǐn)?shù)

45、稱(chēng)為活力回收率。5.相對(duì)酶活力：具有相同酶蛋白量的固定化酶活力與游離酶活力的比值稱(chēng)為相對(duì)酶活力利用胞內(nèi)酶制作固定化酶時(shí)，需要破碎細(xì)胞，然利用胞內(nèi)酶制作固定化酶時(shí)，需要破碎細(xì)胞，然后提取酶，這就增加了工序和成本。后提取酶，這就增加了工序和成本?？茖W(xué)家設(shè)想直接固定含所需胞內(nèi)酶的細(xì)胞科學(xué)家設(shè)想直接固定含所需胞內(nèi)酶的細(xì)胞固定化細(xì)胞與固定化酶比較，其固定化細(xì)胞與固定化酶比較，其優(yōu)越性?xún)?yōu)越性在于：在于：保持了胞內(nèi)酶系的原始狀態(tài)與天然環(huán)境保持了胞內(nèi)酶系的原始狀態(tài)與天然環(huán)境，因而更穩(wěn)定。，因而更穩(wěn)定。保持了胞內(nèi)原有的多酶系統(tǒng)，而且無(wú)需輔酶再生保持了胞內(nèi)原有的多酶系統(tǒng)，而且無(wú)需輔酶再生。 2020世紀(jì)世紀(jì)707

46、0年代，科學(xué)家研制成固定化細(xì)胞，并且用于年代，科學(xué)家研制成固定化細(xì)胞，并且用于生產(chǎn)。生產(chǎn)。例如，將酵母菌細(xì)胞吸附到多孔塑料的表面上或例如，將酵母菌細(xì)胞吸附到多孔塑料的表面上或包埋在瓊脂中，制成的固定化酵母菌細(xì)胞，可以包埋在瓊脂中，制成的固定化酵母菌細(xì)胞，可以用于酒類(lèi)的發(fā)酵生產(chǎn)用于酒類(lèi)的發(fā)酵生產(chǎn)固定化增殖細(xì)胞固定化增殖細(xì)胞發(fā)酵發(fā)酵更具有顯著優(yōu)越性更具有顯著優(yōu)越性 分類(lèi)方式分類(lèi)方式固定化細(xì)胞類(lèi)型固定化細(xì)胞類(lèi)型細(xì)胞類(lèi)型細(xì)胞類(lèi)型微生物、植微生物、植 物、動(dòng)物、動(dòng) 物物生理狀態(tài)生理狀態(tài)死細(xì)胞：完整細(xì)胞，細(xì)胞碎片，細(xì)胞器死細(xì)胞：完整細(xì)胞，細(xì)胞碎片，細(xì)胞器活細(xì)胞：增殖細(xì)胞，靜止細(xì)胞，饑餓細(xì)胞活細(xì)胞：增殖細(xì)胞

47、，靜止細(xì)胞，饑餓細(xì)胞l固定化細(xì)胞由于其用途和制備方法的不同，可以是顆粒固定化細(xì)胞由于其用途和制備方法的不同，可以是顆粒狀、塊狀、條狀、薄膜狀或不規(guī)則狀（與吸附物形狀相狀、塊狀、條狀、薄膜狀或不規(guī)則狀（與吸附物形狀相同）等，同）等，l目前大多數(shù)制備成顆粒狀珠體，這是因?yàn)椋耗壳按蠖鄶?shù)制備成顆粒狀珠體，這是因?yàn)椋簂不規(guī)則形狀的固定化細(xì)胞易磨損，在反應(yīng)器內(nèi)尤其不規(guī)則形狀的固定化細(xì)胞易磨損，在反應(yīng)器內(nèi)尤其是柱反應(yīng)器內(nèi)易受壓變形，流速不好，是柱反應(yīng)器內(nèi)易受壓變形，流速不好，l圓形珠體由于其表面積最大，與底物接觸面較大，圓形珠體由于其表面積最大，與底物接觸面較大，所以生產(chǎn)效率相對(duì)較高。所以生產(chǎn)效率相對(duì)較高。

48、l細(xì)胞被固定在載體內(nèi)在形態(tài)學(xué)上一般沒(méi)有明顯的變化細(xì)胞被固定在載體內(nèi)在形態(tài)學(xué)上一般沒(méi)有明顯的變化。但是，掃描電鏡觀察到固定化酵母細(xì)胞膜有內(nèi)陷現(xiàn)。但是，掃描電鏡觀察到固定化酵母細(xì)胞膜有內(nèi)陷現(xiàn)象。無(wú)論用海藻酸鈣、聚乙烯醇或聚丙烯酰胺凝膠包象。無(wú)論用海藻酸鈣、聚乙烯醇或聚丙烯酰胺凝膠包埋，都有類(lèi)似情況。形成埋，都有類(lèi)似情況。形成“凹池凹池”的原因尚待進(jìn)一步的原因尚待進(jìn)一步研究。研究。l固定化死細(xì)胞：固定化死細(xì)胞：一般在固定化之前或之后細(xì)胞經(jīng)一般在固定化之前或之后細(xì)胞經(jīng)過(guò)物理或化學(xué)方法的處理，如加熱、勻漿、干燥過(guò)物理或化學(xué)方法的處理，如加熱、勻漿、干燥、冷凍、酸及表面活性劑等處理，目的在于增加、冷凍、酸

49、及表面活性劑等處理，目的在于增加細(xì)胞膜的滲透性或抑制副反應(yīng)，所以比較適于單細(xì)胞膜的滲透性或抑制副反應(yīng)，所以比較適于單酶催化的反應(yīng)。酶催化的反應(yīng)。l固定化靜止細(xì)胞固定化靜止細(xì)胞和和饑餓細(xì)胞饑餓細(xì)胞在固定化之后細(xì)胞是在固定化之后細(xì)胞是活的，但是由于采用了控制措施，細(xì)胞并不生長(zhǎng)活的，但是由于采用了控制措施，細(xì)胞并不生長(zhǎng)繁殖，而是處于休眠狀態(tài)或饑餓狀態(tài)。繁殖，而是處于休眠狀態(tài)或饑餓狀態(tài)。l固定化增殖細(xì)胞固定化增殖細(xì)胞又稱(chēng)固定化生長(zhǎng)細(xì)胞，是將活細(xì)又稱(chēng)固定化生長(zhǎng)細(xì)胞，是將活細(xì)胞固定在載體上并使其在連續(xù)反應(yīng)過(guò)程中保持旺胞固定在載體上并使其在連續(xù)反應(yīng)過(guò)程中保持旺盛的生長(zhǎng)、繁殖能力的一種固定化方法。盛的生長(zhǎng)、繁

50、殖能力的一種固定化方法。l固定化增殖細(xì)胞能夠不斷繁殖、更新，反應(yīng)所需的酶也就可以固定化增殖細(xì)胞能夠不斷繁殖、更新，反應(yīng)所需的酶也就可以不斷更新，而且反應(yīng)酶處于天然的環(huán)境中，更加穩(wěn)定，因此，不斷更新，而且反應(yīng)酶處于天然的環(huán)境中，更加穩(wěn)定，因此，固定化增殖細(xì)胞更適宜于連續(xù)使用。從理論上講，只要載體不固定化增殖細(xì)胞更適宜于連續(xù)使用。從理論上講，只要載體不解體，不污染，就可以長(zhǎng)期使用。固定化細(xì)胞保持了細(xì)胞原有解體，不污染，就可以長(zhǎng)期使用。固定化細(xì)胞保持了細(xì)胞原有的全部酶活性，因此，更適合于進(jìn)行多酶順序連續(xù)反應(yīng)，所以的全部酶活性，因此，更適合于進(jìn)行多酶順序連續(xù)反應(yīng)，所以說(shuō)，固定化增殖細(xì)胞在發(fā)酵工業(yè)中最有

51、發(fā)展前途。說(shuō)，固定化增殖細(xì)胞在發(fā)酵工業(yè)中最有發(fā)展前途。1 1、可增殖，細(xì)胞密度大，可獲得高度密集而體積小的、可增殖，細(xì)胞密度大，可獲得高度密集而體積小的生產(chǎn)菌集合體生產(chǎn)菌集合體 2 2、發(fā)酵穩(wěn)定性好，可以較長(zhǎng)時(shí)間反復(fù)使用或連續(xù)使用、發(fā)酵穩(wěn)定性好，可以較長(zhǎng)時(shí)間反復(fù)使用或連續(xù)使用3 3、發(fā)酵液中含菌體較少，有利于產(chǎn)品分離純化。、發(fā)酵液中含菌體較少，有利于產(chǎn)品分離純化。( (膜的膜的選擇通透性）選擇通透性）4 4、有利于需要輔酶和多酶系統(tǒng)才能進(jìn)行的反應(yīng)、有利于需要輔酶和多酶系統(tǒng)才能進(jìn)行的反應(yīng)5 5、抗污染能力強(qiáng)、抗污染能力強(qiáng)(1)(1)必須保持菌體完整，防止菌體自溶，否則，將影響產(chǎn)品純度。必須保持菌

52、體完整，防止菌體自溶，否則，將影響產(chǎn)品純度。(2)(2)必須防止細(xì)胞內(nèi)蛋白酶對(duì)所需酶的分解，同時(shí)，需抑制胞內(nèi)其必須防止細(xì)胞內(nèi)蛋白酶對(duì)所需酶的分解，同時(shí)，需抑制胞內(nèi)其他酶的活性止副產(chǎn)物的形成。他酶的活性止副產(chǎn)物的形成。(3)(3)細(xì)胞膜、細(xì)胞壁和載體都存在著擴(kuò)散限制作用細(xì)胞膜、細(xì)胞壁和載體都存在著擴(kuò)散限制作用, ,載體形成的孔隙載體形成的孔隙大小影響高分子底物的通透性大小影響高分子底物的通透性. .(4)(4)如利用的僅是胞內(nèi)酶，而細(xì)胞內(nèi)多種酶的存在，會(huì)形成不需要如利用的僅是胞內(nèi)酶，而細(xì)胞內(nèi)多種酶的存在，會(huì)形成不需要的副產(chǎn)物；的副產(chǎn)物；但這些缺點(diǎn)并不影響它的實(shí)用價(jià)值。但這些缺點(diǎn)并不影響它的實(shí)用價(jià)

53、值。 l對(duì)一個(gè)特定的目的和過(guò)程來(lái)說(shuō)，是采用細(xì)胞，還是采用對(duì)一個(gè)特定的目的和過(guò)程來(lái)說(shuō)，是采用細(xì)胞，還是采用分離后的酶作催化劑。要分離后的酶作催化劑。要根據(jù)過(guò)程本身來(lái)決定。根據(jù)過(guò)程本身來(lái)決定。l一般說(shuō)一般說(shuō): :對(duì)于一步或兩步的轉(zhuǎn)化過(guò)程用固定化酶較合適對(duì)于一步或兩步的轉(zhuǎn)化過(guò)程用固定化酶較合適。對(duì)多步轉(zhuǎn)換，采用整細(xì)胞顯然有利。對(duì)多步轉(zhuǎn)換，采用整細(xì)胞顯然有利。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：固定化后的細(xì)胞不易與反應(yīng)物接近，可能導(dǎo)致反應(yīng)效果下降固定化后的細(xì)胞不易與反應(yīng)物接近，可能導(dǎo)致反應(yīng)效果下降l固定化微生物細(xì)胞：用于生產(chǎn)酒類(lèi)、氨基酸、有固定化微生物細(xì)胞：用于生產(chǎn)酒類(lèi)、氨基酸、有機(jī)酸、抗生素以及酶和輔酶，也可以用于有機(jī)溶機(jī)

54、酸、抗生素以及酶和輔酶，也可以用于有機(jī)溶劑生產(chǎn)，廢水處理等劑生產(chǎn)，廢水處理等l固定化植物細(xì)胞：主要用于生產(chǎn)人工種子、香精固定化植物細(xì)胞：主要用于生產(chǎn)人工種子、香精、色素、藥物、酶等、色素、藥物、酶等l固定化動(dòng)物細(xì)胞主要用于生產(chǎn)疫苗固定化動(dòng)物細(xì)胞主要用于生產(chǎn)疫苗 1 1、在工業(yè)上的應(yīng)用、在工業(yè)上的應(yīng)用用固定化酶可以生產(chǎn)用固定化酶可以生產(chǎn)L-L-氨基酸，葡萄糖及葡糖漿、核苷酸、氨基酸，葡萄糖及葡糖漿、核苷酸、半合成的抗生素母核等半合成的抗生素母核等L L氨基酸的生產(chǎn)：用固定化酶（氨基酰化酶）折分氨基酸的生產(chǎn)：用固定化酶（氨基?；福┱鄯諨LDL氨氨基酸可連續(xù)生產(chǎn)基酸可連續(xù)生產(chǎn)L L氨基酸。如固定化

55、的細(xì)胞（大腸桿菌）氨基酸。如固定化的細(xì)胞（大腸桿菌）生產(chǎn)生產(chǎn)L LAspAsp：以：以120L120L柱式反應(yīng)器柱式反應(yīng)器6060天可生產(chǎn)天可生產(chǎn)5 5噸的噸的L LAspAsp。乙酰乙酰 -DL -Ala L -Ala +乙酸乙酸 乙酰乙酰 -D Ala （A-D-Ala）Aminoacylase 氨氨 基基 酰酰 化化 酶酶泵泵儲(chǔ)罐反應(yīng)產(chǎn)物離心機(jī)離心機(jī)消消旋旋反反應(yīng)應(yīng)器器固定化酶柱子晶體 L-AlaL-Ala A-D-AlaA-L-Ala A-D-Alal牛奶中含有牛奶中含有4 43 3-4-45 5的乳糖，乳的乳糖，乳糖酶缺乏癥的人飲用牛奶后將導(dǎo)致不糖酶缺乏癥的人飲用牛奶后將導(dǎo)致不良后果

56、。用乳糖酶可以將乳糖分解為良后果。用乳糖酶可以將乳糖分解為組成乳糖的兩個(gè)單糖：半乳糖和葡萄組成乳糖的兩個(gè)單糖：半乳糖和葡萄糖。用固定化乳糖酶反應(yīng)器可以連續(xù)糖。用固定化乳糖酶反應(yīng)器可以連續(xù)處理牛奶，將乳糖分解處理牛奶，將乳糖分解l乳糖在溫度較低時(shí)易結(jié)晶，用固定化乳糖在溫度較低時(shí)易結(jié)晶，用固定化乳糖酶處理后，可以防止其在冰激淋乳糖酶處理后，可以防止其在冰激淋類(lèi)產(chǎn)品中結(jié)晶改善口感。類(lèi)產(chǎn)品中結(jié)晶改善口感。l嚴(yán)重腎臟疾病，需血液透析。過(guò)濾尿素和尿酸等代謝廢物嚴(yán)重腎臟疾病，需血液透析。過(guò)濾尿素和尿酸等代謝廢物l利用固定化脲酶透析液和活性碳構(gòu)成的體外循環(huán)裝置利用固定化脲酶透析液和活性碳構(gòu)成的體外循環(huán)裝置l固

57、定化脲酶：脲酶與離子交換樹(shù)脂通過(guò)微囊法制備而成的固定化脲酶：脲酶與離子交換樹(shù)脂通過(guò)微囊法制備而成的脲酶水解尿素為氨和脲酶水解尿素為氨和COCO2 2，氨被樹(shù)脂吸附，氨被樹(shù)脂吸附，COCO2 2由肺呼出，由肺呼出，其他代謝物由活性碳吸附其他代謝物由活性碳吸附人工腎：人工腎：治療癌癥治療癌癥l正常細(xì)胞：正常細(xì)胞：L-AsnL-Asn合成酶，合成酶，AsnAsn被消耗的同時(shí)不斷被消耗的同時(shí)不斷合成維持細(xì)胞蛋白質(zhì)合成需要合成維持細(xì)胞蛋白質(zhì)合成需要l癌細(xì)胞：缺少活無(wú)癌細(xì)胞：缺少活無(wú)L-AsnL-Asn合成酶，合成酶， AsnAsn被消耗，被消耗，影響蛋白質(zhì)合成，細(xì)胞影響蛋白質(zhì)合成，細(xì)胞“餓死餓死”用固定

58、化的用固定化的天冬酰胺酶天冬酰胺酶治療治療白血病白血病l利用尼龍或尿素聚合物半透膜制備成微囊型利用尼龍或尿素聚合物半透膜制備成微囊型L-L-天冬酰胺酶天冬酰胺酶, ,用于白血病治療。用于白血病治療。l改變了酶的最適改變了酶的最適pHpH；l微囊型酶對(duì)蛋白酶穩(wěn)定；微囊型酶對(duì)蛋白酶穩(wěn)定；l注射到大白鼠腹腔內(nèi)，急性毒性很低、也不會(huì)產(chǎn)生抗體；注射到大白鼠腹腔內(nèi)，急性毒性很低、也不會(huì)產(chǎn)生抗體；l除制成微囊型外，還有人采用酶管或酶板形式進(jìn)行體外循除制成微囊型外，還有人采用酶管或酶板形式進(jìn)行體外循環(huán)治療，也達(dá)到了預(yù)期的療效。環(huán)治療，也達(dá)到了預(yù)期的療效。 微囊型固定化酶微囊型固定化酶將酶包埋在半透膜性質(zhì)的聚合

59、物內(nèi)，制成所謂的將酶包埋在半透膜性質(zhì)的聚合物內(nèi)，制成所謂的微囊型固定化酶微囊型固定化酶。小分子底物或產(chǎn)物可自由地透過(guò)。小分子底物或產(chǎn)物可自由地透過(guò)膠囊的半透膜，而酶作為大分子則不能透過(guò)膠囊；膠囊的半透膜，而酶作為大分子則不能透過(guò)膠囊；此外，膠囊外的一些蛋白質(zhì)、酶、抗體等高分子物此外，膠囊外的一些蛋白質(zhì)、酶、抗體等高分子物質(zhì)也不能進(jìn)入膠囊內(nèi)部，這就避免了發(fā)生過(guò)敏性反質(zhì)也不能進(jìn)入膠囊內(nèi)部，這就避免了發(fā)生過(guò)敏性反應(yīng)。應(yīng)。 膠囊型固定化膠囊型固定化 酶的另一大酶的另一大優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)是，是，膠囊內(nèi)的酶仍以膠囊內(nèi)的酶仍以溶解狀態(tài)作用于底物溶解狀態(tài)作用于底物。因此突破了狹義的固定化酶的。因此突破了狹義的固定化酶

60、的定義，也為固定化酶應(yīng)用于臨床提供了可能性。定義，也為固定化酶應(yīng)用于臨床提供了可能性。 與此同時(shí)，人們采用人血清白蛋白替代尼龍、硝酸與此同時(shí)，人們采用人血清白蛋白替代尼龍、硝酸纖維等作為制造膠囊的材料，使包裝材料更具有安全、纖維等作為制造膠囊的材料，使包裝材料更具有安全、穩(wěn)定和體內(nèi)易代謝等特點(diǎn)。穩(wěn)定和體內(nèi)易代謝等特點(diǎn)。 是一種與是一種與x x染色體連鎖染色體連鎖的遺傳代謝病的遺傳代謝病 患者由于先天性缺患者由于先天性缺乏乏HGPRTHGPRT，導(dǎo)致體內(nèi)次，導(dǎo)致體內(nèi)次黃嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤補(bǔ)救途黃嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤補(bǔ)救途徑的障礙，并進(jìn)而引起徑的障礙，并進(jìn)而引起腎結(jié)石、痛風(fēng)。腎結(jié)石、痛風(fēng)。 Lesch-NyhanLesch-Nyhan綜合癥