第三章第二節(jié) 脫毒苗培養(yǎng)

1、第二節(jié)第二節(jié) 脫毒種苗生產(chǎn)及病毒檢測(cè)技術(shù)脫毒種苗生產(chǎn)及病毒檢測(cè)技術(shù)一、脫毒的意義：一、脫毒的意義： 無(wú)性繁殖作物長(zhǎng)期營(yíng)養(yǎng)繁殖，易受病毒侵染，而使病無(wú)性繁殖作物長(zhǎng)期營(yíng)養(yǎng)繁殖，易受病毒侵染，而使病毒在體內(nèi)積累，導(dǎo)致種性退化，造成產(chǎn)量下降或品質(zhì)降低毒在體內(nèi)積累，導(dǎo)致種性退化，造成產(chǎn)量下降或品質(zhì)降低甚至死亡，給農(nóng)業(yè)造成巨大損失。甚至死亡，給農(nóng)業(yè)造成巨大損失。 通過(guò)莖尖培養(yǎng)獲得無(wú)病毒種苗，對(duì)退化品種進(jìn)行提純復(fù)通過(guò)莖尖培養(yǎng)獲得無(wú)病毒種苗，對(duì)退化品種進(jìn)行提純復(fù)壯。提高產(chǎn)量和品質(zhì)，如馬鈴薯脫毒可提高產(chǎn)量壯。提高產(chǎn)量和品質(zhì)，如馬鈴薯脫毒可提高產(chǎn)量30-60%,30-60%,提提高了經(jīng)濟(jì)效益。此外，由于減少農(nóng)藥使

2、用，可以保護(hù)生態(tài)高了經(jīng)濟(jì)效益。此外，由于減少農(nóng)藥使用，可以保護(hù)生態(tài)環(huán)境。環(huán)境。 脫毒技術(shù)主要應(yīng)用于各種無(wú)性繁殖植物，如草莓、馬脫毒技術(shù)主要應(yīng)用于各種無(wú)性繁殖植物，如草莓、馬鈴薯、甘薯、蘋(píng)果、香蕉、甘蔗等。鈴薯、甘薯、蘋(píng)果、香蕉、甘蔗等。二、脫毒方法：二、脫毒方法：（一）莖尖分生組織培養(yǎng)脫毒：（一）莖尖分生組織培養(yǎng)脫毒：1. 脫毒原理：脫毒原理：病毒在植物體內(nèi)的分布不均勻，越靠近病毒在植物體內(nèi)的分布不均勻，越靠近頂端區(qū)域，帶毒越少，頂端分生組織（頂端區(qū)域，帶毒越少，頂端分生組織（0.2-0.5 mm）不帶）不帶病毒或含病毒量極低。因此，分離分生組織細(xì)胞進(jìn)行培病毒或含病毒量極低。因此，分離分生組織

3、細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，可以獲得無(wú)病毒種苗。養(yǎng)，可以獲得無(wú)病毒種苗。2. 莖尖分生組織培養(yǎng)脫毒的基本程序：莖尖分生組織培養(yǎng)脫毒的基本程序： 一般包括培養(yǎng)基選擇和制備、帶脫毒材料的表面、滅一般包括培養(yǎng)基選擇和制備、帶脫毒材料的表面、滅菌、莖尖分生組織分離、接種和培養(yǎng)、誘導(dǎo)芽分化和小菌、莖尖分生組織分離、接種和培養(yǎng)、誘導(dǎo)芽分化和小植株增殖、誘導(dǎo)生根、馴化移栽等環(huán)節(jié)。植株增殖、誘導(dǎo)生根、馴化移栽等環(huán)節(jié)。 莖尖分生組織的分離需要在超凈工作臺(tái)上借助體視顯莖尖分生組織的分離需要在超凈工作臺(tái)上借助體視顯微鏡進(jìn)行。莖尖放在培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行解剖，一只手用鑷子微鏡進(jìn)行。莖尖放在培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行解剖，一只手用鑷子固定，另一手用解剖針

4、將葉片和葉原基層層剝掉，當(dāng)露固定，另一手用解剖針將葉片和葉原基層層剝掉，當(dāng)露出半圓形頂端分生組織時(shí)，將分生組織切下，接種與培出半圓形頂端分生組織時(shí)，將分生組織切下，接種與培養(yǎng)基上。養(yǎng)基上。virus-virus-freefreetissuetissuevirus particlesvirus particlesfound herefound here3. 脫毒效果與莖尖大小的關(guān)系：脫毒效果與莖尖大小的關(guān)系： 脫毒效果和莖尖分生組織大小直接相關(guān)，莖尖分生組脫毒效果和莖尖分生組織大小直接相關(guān)，莖尖分生組織越小，脫毒率越高，但生長(zhǎng)速度慢。如草莓莖尖切取織越小，脫毒率越高，但生長(zhǎng)速度慢。如草莓莖尖切取

5、0.2-0.3mm時(shí)，脫毒率達(dá)到時(shí)，脫毒率達(dá)到100%，而切取，而切取1.0mm時(shí)，脫時(shí)，脫毒率為毒率為50%。因此，脫毒培養(yǎng)時(shí)，需要兼顧脫毒率、成。因此，脫毒培養(yǎng)時(shí)，需要兼顧脫毒率、成活率及莖尖發(fā)育成完整植株的能力。既要脫除病毒，也活率及莖尖發(fā)育成完整植株的能力。既要脫除病毒，也要使莖尖分生組織迅速生長(zhǎng)發(fā)育。一般莖尖分生組織大要使莖尖分生組織迅速生長(zhǎng)發(fā)育。一般莖尖分生組織大小以小以0.2-0.5mm為適宜。為適宜。（二）微體嫁接脫毒：（二）微體嫁接脫毒： 微體嫁接是在無(wú)菌條件下，將極小微體嫁接是在無(wú)菌條件下，將極小(0.2mm）的莖尖嫁）的莖尖嫁接到試管內(nèi)的無(wú)菌實(shí)生苗砧木上，經(jīng)培養(yǎng)，待接口愈

6、合發(fā)接到試管內(nèi)的無(wú)菌實(shí)生苗砧木上，經(jīng)培養(yǎng)，待接口愈合發(fā)育為完整植株而達(dá)到脫毒的效果。該方法已在柑橘、蘋(píng)果、育為完整植株而達(dá)到脫毒的效果。該方法已在柑橘、蘋(píng)果、葡萄、山茶等園藝植物中應(yīng)用。葡萄、山茶等園藝植物中應(yīng)用。微體嫁接微體嫁接微體嫁接的方法：微體嫁接的方法：（1）試管砧木的準(zhǔn)備）試管砧木的準(zhǔn)備:將無(wú)病毒種子表面滅菌后接種與將無(wú)病毒種子表面滅菌后接種與MS培養(yǎng)基，黑暗條件下培養(yǎng)培養(yǎng)基，黑暗條件下培養(yǎng)15d使其發(fā)芽。使其發(fā)芽。（2）莖尖嫁接：在超凈工作臺(tái)上，將幼苗的上胚軸和子葉）莖尖嫁接：在超凈工作臺(tái)上，將幼苗的上胚軸和子葉去掉，根系截短，在離上胚軸頂端越去掉，根系截短，在離上胚軸頂端越0.5

7、cm處斜向下切一深處斜向下切一深達(dá)木質(zhì)部，長(zhǎng)達(dá)木質(zhì)部，長(zhǎng)2-3cm的切口，在斜切口末端橫切一刀，用去的切口，在斜切口末端橫切一刀，用去掉切下部分。在體視顯微鏡下，從待脫毒樣品上切取掉切下部分。在體視顯微鏡下，從待脫毒樣品上切取0.2mm的莖尖分生組織，小心放于切口的水平面上，切面向下并與的莖尖分生組織，小心放于切口的水平面上，切面向下并與砧木切口形成層組織緊密貼合，然后接于培養(yǎng)基上。砧木切口形成層組織緊密貼合，然后接于培養(yǎng)基上。（3）嫁接苗培養(yǎng)：將嫁接苗置于光下培養(yǎng)，光照時(shí)數(shù)）嫁接苗培養(yǎng)：將嫁接苗置于光下培養(yǎng)，光照時(shí)數(shù)16h，嫁接嫁接1周后形成愈傷組織，周后形成愈傷組織，2-3周愈合，周愈合，

8、5-6周后接穗發(fā)育為周后接穗發(fā)育為新梢。新梢。2. 微體嫁接脫毒的關(guān)鍵：微體嫁接脫毒的關(guān)鍵： 影響微體嫁接成活率的主要因素為影響微體嫁接成活率的主要因素為接穗大小和取樣時(shí)間接穗大小和取樣時(shí)間。與接穗大小呈正相關(guān)，而無(wú)病毒植株獲得與接穗莖尖的大與接穗大小呈正相關(guān)，而無(wú)病毒植株獲得與接穗莖尖的大小呈負(fù)相關(guān)。莖尖分生組織小于小呈負(fù)相關(guān)。莖尖分生組織小于0.2mm可以脫除多數(shù)病毒，可以脫除多數(shù)病毒，春季取材嫁接的成活率高于其他季節(jié)。春季取材嫁接的成活率高于其他季節(jié)。（3）熱處理脫毒：）熱處理脫毒： 通過(guò)熱處理可以由受病毒侵染的個(gè)體得到無(wú)病毒植株，通過(guò)熱處理可以由受病毒侵染的個(gè)體得到無(wú)病毒植株，其原理是

9、利用病毒與植物的耐熱性不同，在高于常溫的環(huán)其原理是利用病毒與植物的耐熱性不同，在高于常溫的環(huán)境下，植物組織中的病毒受熱后可被部分或全部鈍化或失境下，植物組織中的病毒受熱后可被部分或全部鈍化或失去活性，而寄主植物組織很少或不會(huì)受到傷害?；蚋邷叵氯セ钚裕闹髦参锝M織很少或不會(huì)受到傷害。或高溫下植物生長(zhǎng)快，而病毒增殖慢而使植物新生部分不帶病毒。植物生長(zhǎng)快，而病毒增殖慢而使植物新生部分不帶病毒。 1.熱處理脫毒方法：熱處理脫毒方法： 可以通過(guò)溫可以通過(guò)溫湯浸漬湯浸漬或或熱空氣處理法熱空氣處理法脫毒，前者對(duì)休眠芽脫毒，前者對(duì)休眠芽效果較好，后者對(duì)活躍生長(zhǎng)的莖尖效果較好，后者對(duì)活躍生長(zhǎng)的莖尖效果較好。效

10、果較好。 熱空氣處理即把旺盛生長(zhǎng)的植物移入熱療室，在熱空氣處理即把旺盛生長(zhǎng)的植物移入熱療室，在35-35-4040下處理一定時(shí)間（幾分鐘到數(shù)周）熱處理后將莖尖切下處理一定時(shí)間（幾分鐘到數(shù)周）熱處理后將莖尖切下嫁接于無(wú)病毒砧木或進(jìn)行組織培養(yǎng)。熱處理溫度應(yīng)逐步下嫁接于無(wú)病毒砧木或進(jìn)行組織培養(yǎng)。熱處理溫度應(yīng)逐步升高，直到要求溫度。升高，直到要求溫度。 溫湯浸漬的材料常用溫湯浸漬的材料常用50-55 50-55 處理處理10-50min10-50min或或35 35 溫溫水處理水處理30-40min30-40min。2. 熱處理脫毒條件：熱處理脫毒條件：（1）溫度和持續(xù)時(shí)間：因）溫度和持續(xù)時(shí)間：因病毒

11、種類而異，有些病毒種類而異，有些33-3433-34處處理理28-33d28-33d即可脫毒，而有些必須在即可脫毒，而有些必須在39-42 39-42 處理處理50-60d50-60d，耐熱桿狀病毒熱處理脫毒效果差。在植物的耐熱范圍內(nèi)，耐熱桿狀病毒熱處理脫毒效果差。在植物的耐熱范圍內(nèi)，溫度越高，脫毒效果越好。一般采用溫度越高，脫毒效果越好。一般采用35-38 .35-38 .尤其尤其3737恒溫處理恒溫處理30302 2天為普遍。也可采用高低溫處理減少對(duì)植物天為普遍。也可采用高低溫處理減少對(duì)植物的損傷。如馬鈴薯的損傷。如馬鈴薯40 40 （4h4h）+16-20 +16-20 （20h20h）

12、。）。（2）濕度和光照：濕度以）濕度和光照：濕度以70-80%為適宜。光照以自然光為適宜。光照以自然光最好。最好。（3）前處理：）前處理：27-35 1-2 1-2周。周。（四）其他脫毒方法：（四）其他脫毒方法：花器官培養(yǎng)脫毒：由植物的花器官培養(yǎng)脫分化形成愈傷花器官培養(yǎng)脫毒：由植物的花器官培養(yǎng)脫分化形成愈傷組織，然后再分化不定芽，可以獲得無(wú)毒苗。如草莓花組織，然后再分化不定芽，可以獲得無(wú)毒苗。如草莓花藥培養(yǎng)。藥培養(yǎng)。2. 珠心胚培養(yǎng)脫毒：柑橘類珠心胚與微管組織沒(méi)有聯(lián)系，珠心胚培養(yǎng)脫毒：柑橘類珠心胚與微管組織沒(méi)有聯(lián)系，一般不帶毒，可以利用珠心胚進(jìn)行培養(yǎng)獲得。一般不帶毒，可以利用珠心胚進(jìn)行培養(yǎng)獲得

13、。3.化學(xué)脫毒化學(xué)脫毒:采用病毒唑等試劑處理材料或添加到培養(yǎng)基采用病毒唑等試劑處理材料或添加到培養(yǎng)基中可以鈍化病毒，達(dá)到一定的脫毒效果。中可以鈍化病毒，達(dá)到一定的脫毒效果。4. 超低溫處理脫毒超低溫處理脫毒:經(jīng)過(guò)冷凍保護(hù)劑處理過(guò)的莖尖材料，經(jīng)過(guò)冷凍保護(hù)劑處理過(guò)的莖尖材料，采用液氮處理（采用液氮處理（-196）可以鈍化病毒，達(dá)到脫毒效果，）可以鈍化病毒，達(dá)到脫毒效果，該方法已在香蕉等果樹(shù)中成功應(yīng)用。該方法已在香蕉等果樹(shù)中成功應(yīng)用。1. 5. 合并熱處理、莖尖培養(yǎng)或微嫁接脫毒：采用多種方法合并熱處理、莖尖培養(yǎng)或微嫁接脫毒：采用多種方法同時(shí)處理可以達(dá)到更好的脫毒效果。同時(shí)處理可以達(dá)到更好的脫毒效果。

14、二、病毒檢測(cè)方法：二、病毒檢測(cè)方法： 1、形態(tài)鑒定：、形態(tài)鑒定： 根據(jù)植株的生長(zhǎng)狀態(tài)鑒定是否根據(jù)植株的生長(zhǎng)狀態(tài)鑒定是否脫毒，但不準(zhǔn)確。脫毒，但不準(zhǔn)確。 2、指示植物鑒定法：利用特定的易于感染某些、指示植物鑒定法：利用特定的易于感染某些病毒的指示植物的特征進(jìn)行病毒鑒定。病毒的指示植物的特征進(jìn)行病毒鑒定。 指示植物指示植物CMV病毒感染的植株葉片病毒感染的植株葉片3、抗血清鑒定法：利用抗原和抗體的特異性反應(yīng)原理、抗血清鑒定法：利用抗原和抗體的特異性反應(yīng)原理進(jìn)行病毒鑒定。用已知病毒的抗血清（進(jìn)行病毒鑒定。用已知病毒的抗血清（antiserum）鑒）鑒定未知病毒。定未知病毒。 近年來(lái)又在此基礎(chǔ)上發(fā)展出

15、酶聯(lián)免疫法（近年來(lái)又在此基礎(chǔ)上發(fā)展出酶聯(lián)免疫法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA），方法是將抗），方法是將抗原固定在支持物上，加入待檢血清，然后加入酶（過(guò)氧原固定在支持物上，加入待檢血清，然后加入酶（過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶）標(biāo)記的抗體，使待檢血清與對(duì)應(yīng)化物酶或堿性磷酸酶）標(biāo)記的抗體，使待檢血清與對(duì)應(yīng)抗原的特異性抗體結(jié)合，最后用分光光度計(jì)進(jìn)行診斷?？乖奶禺愋钥贵w結(jié)合，最后用分光光度計(jì)進(jìn)行診斷。酶聯(lián)免疫法進(jìn)行病毒鑒定酶聯(lián)免疫法進(jìn)行病毒鑒定4、電子顯微鏡檢測(cè)（、電子顯微鏡檢測(cè)（Electronmicroscope）：采用電）：采用電子顯微鏡對(duì)病毒的薄樣

16、品（約子顯微鏡對(duì)病毒的薄樣品（約1100um）或純化的）或純化的病毒懸液中進(jìn)行病毒的直接觀察。病毒懸液中進(jìn)行病毒的直接觀察。5、RTPCR檢測(cè)（檢測(cè)（Reverse TranscriptionPolymerase Chain Reaction）：）：RT-PCRRT-PCR是將是將RNARNA模板的模板的反轉(zhuǎn)錄（反轉(zhuǎn)錄（RTRT）, ,和和cDNAcDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCRPCR）相結(jié)）相結(jié)合的技術(shù)。合的技術(shù)。RT-PCRRT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣，可用于檢測(cè)技術(shù)靈敏而且用途廣，可用于檢測(cè)病毒病毒DNADNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，分析表達(dá)的水平。該方法已用于的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，分析表達(dá)的水平。該方法已用于大蒜脫毒苗檢測(cè)。大蒜脫毒苗檢測(cè)。四、無(wú)毒苗的保存與繁殖：四、無(wú)毒苗的保存與繁殖：（一）無(wú)毒苗的保存：（一）無(wú)毒苗的保存： 無(wú)毒苗木需在隔離條件下保存以防止再度感染病毒，一無(wú)毒苗木需在隔離條件下保存以防止再度感染病毒，一般在專用的防蟲(chóng)網(wǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)，或者在離體條件下保存。般在專用的防蟲(chóng)網(wǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)，或者在離