第二章-3 蛋白質(zhì)化學(xué)

1、第五節(jié)第五節(jié) 蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)n一、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)一、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)n 真溶液的溶質(zhì)分子的顆粒大小1nm；n 膠體溶液中溶質(zhì)分子的顆粒大小在1-100nm；n 蛋白質(zhì)分子的相對分子量在1-100萬，其顆粒大小(2-20nm)屬于膠體粒子的范圍。n n另外，蛋白質(zhì)分子表面有許多極性基團，親水性極強，易溶與水形成穩(wěn)定的親水膠體溶液。n1 1、穩(wěn)定蛋白質(zhì)膠體溶液的兩個因素、穩(wěn)定蛋白質(zhì)膠體溶液的兩個因素 (1) 表面電荷(在非等電點時)與雙電層； (2) 水化膜蛋白質(zhì)膠體溶液具有一般膠體溶液的性質(zhì)蛋白質(zhì)膠體溶液具有一般膠體溶液的性質(zhì) 丁道爾現(xiàn)象、布朗運動丁道爾現(xiàn)象、布朗運動、半透膜

2、不透性半透膜不透性、吸附性、膠凝性、粘性。吸附性、膠凝性、粘性。n2 2、蛋白質(zhì)的膜分離技術(shù)、蛋白質(zhì)的膜分離技術(shù)（Membrane Separation Technique ）n 利用蛋白質(zhì)的半透膜不透性，將蛋白質(zhì)中所含的、可以通過半透膜將低分子物質(zhì)(如鹽等小分子)分離的技術(shù)稱為膜分離技術(shù)(或膜過濾技術(shù))。n 膜分離技術(shù)可分為膜分離技術(shù)可分為透析（透析（dialysis ）n 超濾（超濾（ultrafiltration ）超濾膜孔徑與截留蛋白質(zhì)分子量的對應(yīng)關(guān)系超濾膜孔徑與截留蛋白質(zhì)分子量的對應(yīng)關(guān)系膜孔平均直徑（108cm） 分子量截留值 膜孔平均直徑（108cm） 分子量截留值10 500 2

3、2 310412 1000 30 510415 1104 55 1010418 2104 140 30104n 二、蛋白質(zhì)的兩性解離與等電點二、蛋白質(zhì)的兩性解離與等電點n蛋白質(zhì)中可解離的酸性基團nGlu的-COOHnAsp的-COOHnTyr的酚羥基nCys的-SHn 堿性基團nLys的-NH2nHis的咪唑基nArg的-胍基n蛋白質(zhì)分子的總解離可用下式表示蛋白質(zhì)分子的總解離可用下式表示 n NH+3-P-COOH (P+)n NH+3-P-COO- (P+-)n n NH2-P-COO- (P-)n n蛋白質(zhì)的等電點蛋白質(zhì)的等電點蛋白質(zhì)溶液在特定的蛋白質(zhì)溶液在特定的pHpH下，下，其分子所帶

4、的正、負電荷相等，凈電荷為零，這其分子所帶的正、負電荷相等，凈電荷為零，這一一pHpH稱為稱為 ( (用用pIpI表示表示) )。n n蛋白質(zhì)的等電點不是一個恒定值，它受溶液的離子種類和離子強度的影響。n蛋白質(zhì)在純水中的帶電狀態(tài)不受其它離子的干擾，完全由H+的解離和結(jié)合來決定，這種條件下的等電點稱為蛋白質(zhì)的等離子點蛋白質(zhì)的等離子點(isoionic point) 。n 蛋白質(zhì)的等離子點是特性常數(shù)。蛋白質(zhì)的等離子點是特性常數(shù)。n 蛋白質(zhì)等電點的大小與其氨基酸組成有關(guān)。蛋白質(zhì)等電點的大小與其氨基酸組成有關(guān)。n 對于對于變性的蛋白質(zhì)變性的蛋白質(zhì)，可由其酸性氨基酸與堿，可由其酸性氨基酸與堿性氨基酸的比

5、例來判斷。性氨基酸的比例來判斷。n 對于對于天然蛋白質(zhì)天然蛋白質(zhì)，由于其，由于其R R基團不能完全暴基團不能完全暴露在外，故不易判斷。露在外，故不易判斷。幾種蛋白質(zhì)的等電點蛋白質(zhì) 等電點 蛋白質(zhì) 等電點胃蛋白酶 1.0 卵清蛋白 4.6血清蛋白 4.7 -乳球蛋白 5.2胰島素 5.3 血紅蛋白 6.7-胰凝乳蛋白酶 8.3 核糖核酸酶 9.5細胞色素C 10.7 溶菌酶 11.0在等電狀態(tài)下，在等電狀態(tài)下，蛋白質(zhì)分子物理性質(zhì)有所改變，蛋白質(zhì)分子物理性質(zhì)有所改變，最顯著的是溶解度最小。最顯著的是溶解度最小。 （a）高pH：蛋白質(zhì)溶解（去質(zhì)子化）；（b）等電點：蛋白質(zhì)絮凝 （靜電排斥最?。╟）

6、低pH：蛋白質(zhì)溶解（質(zhì)子化）；（d）-乳清蛋白的溶解度與pH的關(guān)系n 根據(jù)蛋白質(zhì)兩性解離和等電點兩性解離和等電點的性質(zhì)發(fā)展起來的蛋白質(zhì)純化方法有 n蛋白質(zhì)電泳蛋白質(zhì)電泳n離子交換法離子交換法n等電點沉淀法等電點沉淀法nn三、蛋白質(zhì)的變性作用三、蛋白質(zhì)的變性作用n（ protein denaturation ）n1 1、概念、概念n天然的蛋白質(zhì)在受到某些物理或化學(xué)因素的作用，有序的空間結(jié)構(gòu)被破壞空間結(jié)構(gòu)被破壞，致使生物活性喪失，并伴隨發(fā)生一些理化性質(zhì)的異常變化，但一級結(jié)構(gòu)并未破壞，但一級結(jié)構(gòu)并未破壞，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的變性作用這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的變性作用。2 2、蛋白質(zhì)變性的可逆性、蛋白質(zhì)變性

7、的可逆性可逆變性可逆變性 是指使蛋白質(zhì)變性的條件解除 后，能恢復(fù)其原有性質(zhì)。不可逆變性不可逆變性 是指使蛋白質(zhì)變性的條件解除 后，仍不能恢復(fù)其原有性質(zhì)。蛋白質(zhì)復(fù)性蛋白質(zhì)復(fù)性（renaturation）n去除變性因素后，可逆變性的蛋白恢復(fù)原來的空去除變性因素后，可逆變性的蛋白恢復(fù)原來的空間結(jié)構(gòu)，恢復(fù)生物活性的現(xiàn)象為間結(jié)構(gòu)，恢復(fù)生物活性的現(xiàn)象為復(fù)性復(fù)性3 3、蛋白質(zhì)的變性因素及其作用機理、蛋白質(zhì)的變性因素及其作用機理n物理因素n熱、UV、超聲波、X-射線、高壓、表面張力、攪拌、劇烈振蕩、研磨。n例如 皮膚粗糙、白內(nèi)障、殺菌皮膚粗糙、白內(nèi)障、殺菌n化學(xué)因素n酸、堿、有機溶劑、重金屬鹽、脲、胍、表面活

8、性劑、生物堿 。n作用機理 n重金屬重金屬與與-SH-SH生成不溶性的硫化物生成不溶性的硫化物n濃乙醇、去污劑濃乙醇、去污劑破壞疏水作用力破壞疏水作用力 4 4、變性蛋白質(zhì)的性質(zhì)、變性蛋白質(zhì)的性質(zhì)變性蛋白質(zhì)與天然蛋白質(zhì)性質(zhì)的差別主要表現(xiàn)變性蛋白質(zhì)與天然蛋白質(zhì)性質(zhì)的差別主要表現(xiàn) (1)(1)理化性質(zhì)的變化理化性質(zhì)的變化如：旋光性改變、粘度增加粘度增加、光吸收性質(zhì)增加光吸收性質(zhì)增加、失去結(jié)晶能力、溶解度下降溶解度下降、易發(fā)生凝聚和沉淀易發(fā)生凝聚和沉淀。(2) (2) 生化性質(zhì)的變化生化性質(zhì)的變化變性后的蛋白質(zhì)易被酶水解。(3) (3) 生物活性喪失生物活性喪失這是蛋白質(zhì)變性的重要標(biāo)志。n 四、蛋白

9、質(zhì)的變構(gòu)作用四、蛋白質(zhì)的變構(gòu)作用n （protein allosteric effect )n對于具有四級結(jié)構(gòu)、含有亞基的蛋白質(zhì)來講，對于具有四級結(jié)構(gòu)、含有亞基的蛋白質(zhì)來講，當(dāng)當(dāng)一個亞基的構(gòu)象發(fā)生變化，而引起其余亞基和整一個亞基的構(gòu)象發(fā)生變化，而引起其余亞基和整個蛋白質(zhì)分子構(gòu)象、性質(zhì)和功能發(fā)生改變的作用個蛋白質(zhì)分子構(gòu)象、性質(zhì)和功能發(fā)生改變的作用稱為蛋白質(zhì)的變構(gòu)作用稱為蛋白質(zhì)的變構(gòu)作用( (或稱別構(gòu)作用）?；蚍Q別構(gòu)作用）。n 如如血紅蛋白的變構(gòu)作用n五、蛋白質(zhì)的沉淀作用五、蛋白質(zhì)的沉淀作用（precipitation） n1 1、概念、概念n蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性是有條件的、相對的，若改變環(huán)境條

10、件，破壞其水化膜和表面電荷，蛋白質(zhì)親水膠體便失去穩(wěn)定性，發(fā)生絮凝沉淀的現(xiàn)象，就稱為就稱為蛋白質(zhì)的沉淀作用蛋白質(zhì)的沉淀作用。蛋白質(zhì)的沉淀可分為蛋白質(zhì)的沉淀可分為 不變性沉淀不變性沉淀 用于分離活性的天然蛋白質(zhì)產(chǎn)品。如： 酶、抗體等。 變性沉淀變性沉淀 用于生物制品中除去蛋白質(zhì)。n2 2、沉淀的方法、沉淀的方法n(1) (1) 等電點沉淀等電點沉淀n蛋白質(zhì)分子在其等電點時，容易相互吸引，聚合成沉淀蛋白質(zhì)分子在其等電點時，容易相互吸引，聚合成沉淀n(2) (2) 中性鹽沉淀中性鹽沉淀n鹽析（鹽析（salting out) salting out) 在蛋白質(zhì)溶液中加入在蛋白質(zhì)溶液中加入高濃度高濃度的中

11、性鹽的中性鹽后，它與蛋白質(zhì)膠體粒子競爭水份，使蛋白質(zhì)膠體粒子表面后，它與蛋白質(zhì)膠體粒子競爭水份，使蛋白質(zhì)膠體粒子表面的水化層破壞而失去穩(wěn)定性，同時降低了蛋白質(zhì)與水的親和的水化層破壞而失去穩(wěn)定性，同時降低了蛋白質(zhì)與水的親和力而使蛋白質(zhì)沉淀的現(xiàn)象。力而使蛋白質(zhì)沉淀的現(xiàn)象。n鹽溶（鹽溶（salting in)salting in)在鹽濃度很低時在鹽濃度很低時，大多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解，大多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨著鹽濃度的增加而增加，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的鹽溶。度隨著鹽濃度的增加而增加，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的鹽溶。 n 低濃度的鹽可增加蛋白質(zhì)表面的低濃度的鹽可增加蛋白質(zhì)表面的電荷數(shù)量電荷數(shù)量和與和與水分子的相互作用

12、水分子的相互作用。鹽析鹽濃度高鹽濃度高時，中和了蛋白質(zhì)分子表面的電荷、時，中和了蛋白質(zhì)分子表面的電荷、破壞破壞了水化層，了水化層，使使疏水區(qū)域疏水區(qū)域暴露暴露，疏水基團發(fā)生相互作疏水基團發(fā)生相互作用用而沉淀。而沉淀。不同的蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、分子量不同，不同的蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、分子量不同，水膜厚度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不同。水膜厚度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不同。分級鹽析分級鹽析一般來講，分子量越大的蛋白質(zhì)分子，越容易鹽析，所需鹽濃度也越低。因此，對于不同分子大小的蛋白質(zhì)，可采用不同的鹽濃度進分級沉淀。常用的鹽是常用的鹽是(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4n(3) (3) 有機溶劑

13、沉淀有機溶劑沉淀n一些極性的有機溶劑極性的有機溶劑(如乙醇、丙酮等)能破壞蛋白質(zhì)膠粒的水化層，使疏水基團暴露使蛋白質(zhì)沉淀。n(4) (4) 重金屬鹽沉淀重金屬鹽沉淀n蛋白質(zhì)在堿性溶液中帶負電，可與重金屬離子如Zn+2、Cu+2、Hg+2、Pb+2、Fe+3等作用，產(chǎn)生重金屬蛋白鹽沉淀。n(5) (5) 熱變性沉淀熱變性沉淀n(6) (6) 生物堿試劑沉淀生物堿試劑沉淀n生物堿試劑（如單寧酸、鉬酸、鎢酸、三氯醋酸等）具有酸性，而蛋白質(zhì)在酸性溶液中帶正電荷，故能與帶負電的酸根相結(jié)合，成為溶解度很小的鹽類。六、蛋白質(zhì)的沉降作用六、蛋白質(zhì)的沉降作用（sedimentation) 1 1、概念、概念蛋白

14、質(zhì)由于其比重大于水，而水中下沉，這就是蛋蛋白質(zhì)由于其比重大于水，而水中下沉，這就是蛋白質(zhì)的沉降作用。白質(zhì)的沉降作用。 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)膠體粒子在靜止溶液中膠體粒子在靜止溶液中，因重力，因重力F=mg F=mg 很小，很小，沉降沉降1 1cmcm需需幾年幾年的時間。為了便于觀察和利用這一現(xiàn)象，的時間。為了便于觀察和利用這一現(xiàn)象，通常外加一定的力（如通常外加一定的力（如離心力離心力），來加速沉降過程。，來加速沉降過程。 蛋白質(zhì)的沉降速度與蛋白質(zhì)的沉降速度與分子大小分子大小和和密度密度有關(guān)。有關(guān)。 蛋白質(zhì)的沉降性能通常用蛋白質(zhì)的沉降性能通常用單位離心力場中的沉降速度單位離心力場中的沉降速度沉降系數(shù)沉降系

15、數(shù)來表示來表示 （沉降系數(shù)的測定詳見后面的蛋白質(zhì)分子量測定）n七、蛋白質(zhì)的水解反應(yīng)七、蛋白質(zhì)的水解反應(yīng) n可分為 完全水解完全水解，產(chǎn)物是氨基酸。n 不完全水解不完全水解，產(chǎn)物可以是胨、小肽、n 二肽和氨基酸。n八、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)八、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng) n（1 1）一般顏色反應(yīng)：）一般顏色反應(yīng)：n氨基酸所具有的顏色反應(yīng)一般情況下蛋白質(zhì)都有。n一些氨基酸地一些氨基酸地R R基團具有特殊地顏色反應(yīng)：基團具有特殊地顏色反應(yīng)：n米倫反應(yīng)米倫反應(yīng) 紅色 酚基n黃色反應(yīng)黃色反應(yīng) 黃色 苯基n酚試劑反應(yīng)酚試劑反應(yīng) 藍色 酚基、吲哚基n坂口反應(yīng)坂口反應(yīng) 紅色 胍基（2 2）特殊顏色反應(yīng)）特殊顏色反應(yīng)雙縮脲反應(yīng)

16、兩個以上肽鍵兩個以上肽鍵（雙縮脲）在堿性溶液中與硫酸銅結(jié)合。生成紫紅色或紅色物質(zhì)。九、蛋白質(zhì)的紫外吸收性質(zhì)九、蛋白質(zhì)的紫外吸收性質(zhì) 一般蛋白質(zhì)在280nm波長具有最大吸收，這是由于蛋白質(zhì)分子中的Trp、Tyr和Phe存在共軛雙鍵的緣故。十、蛋白質(zhì)的免疫學(xué)性質(zhì) 抗原Ag：刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異免疫反應(yīng)的物質(zhì)，特點是異物性、大分子性和特異性抗體。Ab：抗原刺激機體產(chǎn)生能與抗原特異結(jié)合的蛋白質(zhì)，存在于電泳-區(qū)（ -、免疫球蛋白Ig）,抗體的特異性決定于抗原的表面基團，免疫產(chǎn)生抗體多種，多克隆抗體免疫反應(yīng)：抗原與抗體結(jié)合引起的反應(yīng)，是人類對疾病具有抵抗力的重要標(biāo)志正常免疫反應(yīng)：機體保護作用；異常免疫

17、反應(yīng)：機體有害的病理性免疫反應(yīng)半抗原：不具抗原性的小分子物質(zhì)，與蛋白結(jié)合后具有抗原性，這里小分子為半抗原此性質(zhì)在食品加工中也具有重要應(yīng)用n蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量一般在蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量一般在60006000至至100100萬萬n常用的測定方法有常用的測定方法有: :n1 1、根據(jù)化學(xué)組成測定最低相對分子質(zhì)量、根據(jù)化學(xué)組成測定最低相對分子質(zhì)量n2 2、滲透壓法測定相對分子質(zhì)最、滲透壓法測定相對分子質(zhì)最n3 3、凝膠過濾法測定相對分子質(zhì)量、凝膠過濾法測定相對分子質(zhì)量n4 4、凝膠電泳法測定相對分子質(zhì)量、凝膠電泳法測定相對分子質(zhì)量n5 5、沉降法測定相對分子質(zhì)量、沉降法測定相對分子質(zhì)量第六節(jié)第六節(jié)

18、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定1 1、凝膠過濾法、凝膠過濾法原理：原理：將具網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的葡聚糖凝膠裝柱，將具網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的葡聚糖凝膠裝柱，對分子量不同的蛋白質(zhì)，由于進入多孔性對分子量不同的蛋白質(zhì)，由于進入多孔性凝膠顆粒的能力不同而在流動相流動過程凝膠顆粒的能力不同而在流動相流動過程中所走路徑不同，從而有不同的洗脫體積，中所走路徑不同，從而有不同的洗脫體積，來達到分離。來達到分離。凝膠法只適于測定球狀蛋白分子的相對質(zhì)量凝膠法只適于測定球狀蛋白分子的相對質(zhì)量洗脫體積與相對分子質(zhì)量的關(guān)系洗脫體積與相對分子質(zhì)量的關(guān)系 相對分子質(zhì)量的對數(shù)洗脫體積（mL）聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠具網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)

19、，作為電泳介質(zhì)電泳介質(zhì) SDS十二烷基硫酸鈉十二烷基硫酸鈉【CH3(CH2)11OSO3Na】 它是一種陰離子表面活性劑，也是一種有它是一種陰離子表面活性劑，也是一種有 效的蛋白變性劑效的蛋白變性劑 通常在待測分子量的蛋白質(zhì)樣品中加入通常在待測分子量的蛋白質(zhì)樣品中加入巰基乙醇和巰基乙醇和SDS。巰基乙醇巰基乙醇打開蛋白質(zhì)分子二硫鍵；打開蛋白質(zhì)分子二硫鍵； SDS破壞蛋白質(zhì)分子的氫鍵和疏水鍵，并與之形成破壞蛋白質(zhì)分子的氫鍵和疏水鍵，并與之形成Pr-SDS復(fù)合物復(fù)合物2 2、SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳十二烷基硫酸鈉十二烷基硫酸鈉原態(tài)蛋白質(zhì)變性？磺酸基磺酸基 極性親水極性親

20、水烷基烷基 親油親油（蛋白質(zhì)疏水區(qū)）（蛋白質(zhì)疏水區(qū)）nSDS-Pr復(fù)合物的特點：n復(fù)合物帶大量負電，使得不同Pr電荷密度相同n使球狀Pr變成雪茄狀，長軸MWn電泳時遷移率僅與蛋白質(zhì)分子量（MW或分子的長軸）有關(guān)，而與分子形狀和帶電狀態(tài)無關(guān)。原理：原理：不同分子量的不同分子量的PrPr顆粒會以不同的速度沉降下顆粒會以不同的速度沉降下來。用特殊的光學(xué)系統(tǒng)可觀察到沉降界面，從而得來。用特殊的光學(xué)系統(tǒng)可觀察到沉降界面，從而得prpr沉降速度。沉降速度。3、超離心沉降法超離心沉降法n蛋白質(zhì)的沉降常數(shù)蛋白質(zhì)的沉降常數(shù)(沉降系數(shù), Svedberg Unite)n不同的蛋白質(zhì)由于其分子大小不同，在一定的離心

21、力場中沉降的速度也不同。n沉降的速度是蛋白質(zhì)在單位時間內(nèi)下沉的距離沉降的速度是蛋白質(zhì)在單位時間內(nèi)下沉的距離，即即v=dx/dtv=dx/dt。n沉降常數(shù)沉降常數(shù)(s(s小寫小寫)單位引力場中沉降分子的下沉速度。它表示沉降分子的大小特性。ns=v（沉降速度）/2（角速度）x（顆粒距中心距離）n沉降常數(shù)沉降常數(shù)是蛋白質(zhì)的特征性常數(shù)，它反應(yīng)蛋白質(zhì)是蛋白質(zhì)的特征性常數(shù)，它反應(yīng)蛋白質(zhì)分子的大小。分子的大小。nn由于已知的蛋白質(zhì)分子的沉降常數(shù)在110-1320010-13秒之間，把110-13s這一沉降系數(shù)值定為一個斯維德伯(Svedberg)氏單位(s)，沉降常數(shù)為110-13 ( (簡寫為簡寫為1S1

22、S，大寫，大寫) )。nn蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量：Ms 斯維德貝格公式（Svedberg )M = RTs / D(1-）其中：其中：M：蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量：蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量 s：為沉降系數(shù)，單位：為沉降系數(shù)，單位秒秒或或“S”一般一般Pr的的“s”在在120010-13 秒秒 范圍內(nèi)，為方便將范圍內(nèi)，為方便將10-13 秒秒 作一個作一個單位單位漂浮單位漂浮單位“S” D：擴散系數(shù)；：擴散系數(shù)； ：蛋白質(zhì)的偏微比容（：蛋白質(zhì)的偏微比容（0.74cm3/g）；）；：溶劑的密度；：溶劑的密度；R：氣體常數(shù)；：氣體常數(shù)；T：絕對溫度：絕對溫度一些蛋白質(zhì)的物理常數(shù)一些蛋白質(zhì)的物理常數(shù)蛋白質(zhì) 相對分子量 擴散系數(shù) 沉降系數(shù) 摩擦比 （D20，w107）cm2s1 （s020，w1013）s （f/f0）核糖核酸酶A（牛） 12600 11.9 1.85 1.14細胞色素C（牛心?。?13370 11.4 1.71 1.19肌紅蛋白（馬心?。?16900 11.3 2.04 1.11胰凝乳蛋白酶原（牛胰） 23240 9.50 2.54 1.19血清清蛋白（人） 68500 6.10 4.6 1.29血紅蛋白（人） 64500 6.90 4.46 1.16過氧化氫酶（馬肝） 247500 4.10 11.3