葡萄酒在釀造過(guò)程中戊唑醇演變

1、葡萄酒在釀造過(guò)程中戊唑醇演變 1、文章摘要、文章摘要 本文對(duì)釀造葡萄酒中戊唑醇農(nóng)藥殘留變化進(jìn)行了研究，對(duì)葡萄、未發(fā)酵的葡萄汁、葡萄酒利用氣相-離子阱質(zhì)譜(GCITMS)檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，戊唑醇保存在了酒渣和酒糟以及澄清介質(zhì)上。在終酒中戊唑醇的減少量是86%。同時(shí)通過(guò)模擬實(shí)驗(yàn)對(duì)戊唑醇對(duì)釀酒酵母和酒球菌發(fā)酵活力影響進(jìn)行研究，運(yùn)用LCMS/MS來(lái)檢測(cè)模擬實(shí)驗(yàn)中未發(fā)酵葡萄汁和葡萄酒中的戊唑醇的殘留。結(jié)果農(nóng)殘對(duì)酒精發(fā)酵和蘋果酸乳酸發(fā)酵無(wú)影響，未檢出微生物對(duì)戊唑醇的降解產(chǎn)物。2試驗(yàn)的兩個(gè)目的試驗(yàn)的兩個(gè)目的：第一是第一是通過(guò)整個(gè)試驗(yàn)通過(guò)整個(gè)試驗(yàn)研究紅葡萄酒在加工過(guò)程研究紅葡萄酒在加工過(guò)程中中戊唑醇的殘留量的

2、變化。戊唑醇的殘留量的變化。第二是第二是通過(guò)模擬試驗(yàn)來(lái)研究戊唑醇?xì)埩魧?duì)酵母通過(guò)模擬試驗(yàn)來(lái)研究戊唑醇?xì)埩魧?duì)酵母菌的酒精發(fā)酵和酒球菌的蘋果酸乳酸發(fā)酵的影菌的酒精發(fā)酵和酒球菌的蘋果酸乳酸發(fā)酵的影響。檢測(cè)葡萄酒中微生物的存在是否對(duì)戊唑醇響。檢測(cè)葡萄酒中微生物的存在是否對(duì)戊唑醇?xì)埩舻臏p少有促進(jìn)作用。殘留的減少有促進(jìn)作用。 2.1 葡萄酒釀造試驗(yàn) 葡萄酒釀造試驗(yàn)A和B，各做兩個(gè)重復(fù)，用2007年九月收貨的葡萄進(jìn)行試驗(yàn)。 A組去梗破碎后不添加農(nóng)藥進(jìn)行葡萄酒釀造試驗(yàn)。 B組去梗破碎后添加農(nóng)藥進(jìn)行釀造試驗(yàn)，添加戊唑醇的標(biāo)準(zhǔn)品到達(dá)3.3 mg/kg這個(gè)水平是歐洲MRL, 2.0 mg/kg的1.6倍多。 A組和B

3、組的釀造方法相同。4、葡萄就釀造過(guò)程 成串的葡萄稱取40kg,總共四份。釀造過(guò)程如下：每份去梗破碎的葡萄放入金屬容器中進(jìn)行發(fā)酵，添加SO2 (40 mg/L)，僅對(duì)B組添加農(nóng)藥，其他不添加，24小時(shí)后添加商業(yè)酵母，酒精發(fā)酵在18-20進(jìn)行發(fā)酵，保持10天，在10-11天，酒精浸漬發(fā)酵溫度低于18-20， 期間為防止葡萄皮浮起，每天按下兩次。在發(fā)酵的最后進(jìn)行壓榨，酒和未發(fā)酵的葡萄汁轉(zhuǎn)移進(jìn)另一個(gè)金屬容器參加酒球菌進(jìn)行蘋果酸乳酸發(fā)酵，在釀酒的最后過(guò)程進(jìn)行過(guò)濾，添加SO2終止發(fā)酵，卵清蛋白進(jìn)行澄清，最后進(jìn)行灌裝。562.1.2. 取樣 根據(jù)表所述，為了研究不同釀酒步驟對(duì)戊唑醇減少的影響，酒精發(fā)酵之前對(duì)

4、破碎的葡萄取樣；在酒精發(fā)酵的最后對(duì)酒和果渣進(jìn)行取樣；在蘋果酸乳酸發(fā)酵的最后，對(duì)已過(guò)濾后的酒樣進(jìn)行取樣；經(jīng)過(guò)澄清，對(duì)瓶裝的酒進(jìn)行取樣。72.2.化學(xué)藥品 2.2.1. 戊唑醇提取和測(cè)定用試劑。 戊唑醇純度 98%,戊唑醇D6(100mg/l,溶于丙酮，作為內(nèi)標(biāo)物)，用于矯正色譜法中的進(jìn)樣誤差和質(zhì)譜檢測(cè)的響應(yīng)值。2-乙氧基-1,2-丙二醇、山梨醇、古洛糖酸-內(nèi)酯用于被分析物的保護(hù)劑，溶劑殘留量分析等級(jí)是丙酮，乙腈，蟻酸，超純水，二氯甲烷，甲醇和甲苯。Nacl，無(wú)水硫酸鈉，氨基甲酸鹽。殺菌劑的標(biāo)準(zhǔn)溶液和被分析物的保護(hù)劑在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始之前準(zhǔn)備好。82.2.2. 模擬葡萄汁試驗(yàn)用到的藥品 材料和培養(yǎng)基蛋白胨

5、，酵母提取物，瓊脂和MRS培養(yǎng)基來(lái)自Cultimed。葡萄糖，96%的乙醇，甘油，蘋果酸，NaCl，CaCl2，H2SO4 9598%，NaOH，3-5二硝基水楊酸，酒石酸鉀鈉。9 2.3. 材料和儀器 2.4 提取步驟 破碎的葡萄(5 g),未發(fā)酵的葡萄汁和葡萄酒(各5 mL)的樣本在50ml的聚丙烯做的螺旋帽的離心管中進(jìn)行稱量。25ml的二氯甲烷和丙酮(75:25, v/v)參加容器進(jìn)行超聲波浴10分鐘來(lái)完全混合均勻。NaCl3g和無(wú)水硫酸鈉12g參加后混勻5分鐘。經(jīng)過(guò)10分鐘，4000轉(zhuǎn)的離心別離后，把15ml有機(jī)物層轉(zhuǎn)入40ml的瓶中在氮?dú)饬髦锌菰?，殘留物重新溶?ml的乙腈液中。 凈

6、化 為了將雜質(zhì)去除干凈，進(jìn)行固相萃取，使用Supelclean Envi Carb-II/PSA SPE固相萃取小柱，用乙腈：甲苯3;15ml活化，將2ml的乙腈提取物上樣，被吸附的農(nóng)藥殘留用乙腈和甲苯3;120ml進(jìn)行洗脫到40ml的玻璃瓶中。洗脫液用氮?dú)獯蹈?，最后參?ml丙酮定容，丙酮中含有3種保護(hù)劑(3-ethoxy-1,2-propanediol at 10 g/L; and D-sorbitol and L-gulonic acid c-lactone at 1 g/L; respectively).三種保護(hù)劑混合的使用可以彌補(bǔ)基質(zhì)效應(yīng)。戊唑醇的D6 (0.1 mg/L)標(biāo)準(zhǔn)液作為

7、內(nèi)標(biāo)液也參加，丙酮提取物混勻。最后丙酮提取物放于350L的玻璃注射器參加2ml的小瓶，用于色譜分析。102.5. 戊唑醇的分析檢測(cè)實(shí)際體系中的樣品的測(cè)定用氣相-離子阱質(zhì)譜，其中的進(jìn)樣方式是PTV，內(nèi)標(biāo)法模擬體系中的樣品的農(nóng)藥殘留檢測(cè)用液相-三級(jí)四極質(zhì)譜儀進(jìn)行測(cè)定。外標(biāo)法糖的測(cè)定用3,5-二硝基水楊酸DNS方法，葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)物。乙醇和甘油的測(cè)定采用高效液相色譜示差折光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。單位微生物量用干重法。112.6. 模擬試驗(yàn)中微生物的培養(yǎng)和發(fā)酵 2.6.1. 微生物 2.6.1.1. (A) 酵母的培養(yǎng) 2.6.1.2. (B)細(xì)菌的培養(yǎng) 2.6.2. 酒精發(fā)酵試驗(yàn) 三組試驗(yàn)進(jìn)行：A酵母菌在

8、戊唑醇存在的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。 B酵母菌在沒(méi)有戊唑醇存在的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。 C在添加戊唑醇條件下未加酵母菌條件下進(jìn)行。12 具有主要葡萄酒特性的簡(jiǎn)單培養(yǎng)基用200 g/L葡萄糖、7 g/L蛋白胨、3.5 g/L酵母提取物，通過(guò)過(guò)濾0.22m的膜濾器來(lái)殺菌。A 、C的培養(yǎng)基中戊唑醇的含量是2 mg/L。B實(shí)驗(yàn)含有等來(lái)量的乙醇。對(duì)于三個(gè)不同條件下的試驗(yàn)，將每種配好的溶液平均分成49ml體積的各12份，對(duì)于A、B試驗(yàn)添加1ml的酵母菌液，對(duì)于C組試驗(yàn)添加1ml的滅菌水。所用的盛有樣液的燒杯在20 and 75 rpm的震蕩器上培養(yǎng)十三天。每組試驗(yàn)中的樣本兩兩一組，分別于0, 3, 4, 6, 9 和

9、13 天取出進(jìn)行單位體積的生物量、復(fù)原糖、發(fā)酵代謝物乙醇、甘油和戊唑醇的測(cè)定。13 2.6.3. 蘋果酸-乳酸發(fā)酵試驗(yàn) 三組試驗(yàn)進(jìn)行：A酒球菌在戊唑醇存在的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。 B酒球菌在沒(méi)有戊唑醇存在的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。 C在添加戊唑醇條件下未加酒球菌條件下進(jìn)行。 和酒精發(fā)酵不同的是戊唑醇的濃度從2mg/L降到0.4mg/L,培養(yǎng)基也改變1 g/L的葡萄糖、7 g/L蛋白胨、3.5g/l的酵母提取物、5g/l蘋果酸和80ml/l的乙醇。其他的和上述酵母菌的相同。 143、結(jié)果和討論 3.1. 分析性能 本實(shí)驗(yàn)中為了減少基質(zhì)效應(yīng)，在進(jìn)行農(nóng)藥殘留檢測(cè)時(shí)溶劑添加分析保護(hù)劑2-乙氧基-1,2-丙二醇、山梨

10、醇、古洛糖酸，同時(shí)在進(jìn)樣時(shí)應(yīng)用PTV的進(jìn)樣方式來(lái)減少基質(zhì)效應(yīng)。 SLE/SPE/GCITMS和SLE/SPE/LCTQMS的檢測(cè)方法的性能通過(guò)檢測(cè)的線性范圍、精確度、檢測(cè)限和定量限 繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線是戊唑醇面積/內(nèi)標(biāo)物面積的比值對(duì)戊唑醇濃度的繪制而成。15163.2.在葡萄酒加工過(guò)程中農(nóng)藥的減少 在B試驗(yàn)中，葡萄先被檢測(cè)，確定無(wú)戊唑醇的殘留， 當(dāng)葡萄去梗破碎之后，添加3.3 mg/kg的戊唑醇的標(biāo)品，本文選擇這個(gè)濃度一是為了便于檢測(cè)到戊唑醇產(chǎn)生的降解物，第二使用純品是為了防止商品農(nóng)藥中其他雜質(zhì)的影響。 參加標(biāo)準(zhǔn)戊唑醇農(nóng)藥后一天，發(fā)酵正式開(kāi)始，根據(jù)上表中的要求進(jìn)行取樣，在B試驗(yàn)中戊唑醇?xì)埩舻牧咳绫?/p>

11、2，在試驗(yàn)A組中戊唑醇的量一直未檢出。1718 根據(jù)A組和B組葡萄酒釀造過(guò)程中葡萄汁密度大小的比較，根本相同，時(shí)間周期在1015天。為此可以的出這樣的結(jié)論：酵母的發(fā)酵作用未收到農(nóng)藥戊唑醇的顯著影響。 浸泡酒精發(fā)酵階段是戊唑醇存在于酒還是酒渣的關(guān)鍵階段，從開(kāi)始的未發(fā)酵的葡萄汁到浸泡酒精發(fā)酵階段的最后，戊唑醇分布于液相局部的葡萄汁和固相局部的葡萄渣，戊唑醇沒(méi)有完全溶解于液相局部這是由于它的水溶性0.032 g/L),從表2可以看出在酒中的農(nóng)藥殘留只有12%，而葡萄酒渣中的農(nóng)藥殘留占到88%，說(shuō)明戊唑醇對(duì)懸浮于液相中的固體顆粒有很強(qiáng)的親和性。19 對(duì)于蘋果酸乳酸發(fā)酵過(guò)程中，戊唑醇對(duì)酒球菌具有抗分解的

12、性質(zhì)，和酒精發(fā)酵結(jié)束時(shí)戊唑醇0.6 mg/L)的濃度相當(dāng)。 對(duì)于澄清過(guò)程，使用卵清蛋白，它可以除去大量的多酚物質(zhì)，從使就具有較好的口感。經(jīng)過(guò)這個(gè)過(guò)程，農(nóng)殘除去大約25%。 對(duì)于物戊唑醇的降解產(chǎn)物，由于沒(méi)有降解產(chǎn)物檢出，所以降解過(guò)程沒(méi)有寫到，文章寫到為了進(jìn)一步確定戊唑醇是否產(chǎn)生降解產(chǎn)物，需要做模擬試驗(yàn)in vitro assays來(lái)確定戊唑醇是降解了還是吸附到了固體介質(zhì)上。20 從上面得出的結(jié)果可以說(shuō)明在葡萄酒的加工過(guò)程中，戊唑醇表現(xiàn)出連續(xù)的減少。 3.3. 模擬試驗(yàn)結(jié)果 盡管用實(shí)際釀造葡萄的試驗(yàn)可以有農(nóng)藥殘留濃度對(duì)微生物的影響，但是由于有固體物質(zhì)對(duì)農(nóng)藥的吸附以及在進(jìn)行單位生物量的測(cè)定，這些固體

13、物質(zhì)的存在都會(huì)影響測(cè)定結(jié)果，同時(shí)由于真正體系物質(zhì)的復(fù)雜導(dǎo)致對(duì)戊唑醇的降解產(chǎn)物的檢測(cè)定性、定量有很大影響。 模擬真正發(fā)酵體系的性質(zhì)，配置的液體培養(yǎng)基來(lái)評(píng)價(jià)戊唑醇對(duì)發(fā)酵參數(shù)的影響。213.3.1. 戊唑醇對(duì)酒精發(fā)酵的影響2223 圖標(biāo)解析：在模擬體系中2 mg/L的戊唑醇的殘留量導(dǎo)致糖消耗率的減少，酵母生長(zhǎng)緩慢，酒精產(chǎn)生緩慢，同時(shí)由于戊唑醇的存在使酵母的最大生物量也降低了。可見(jiàn)戊唑醇的存在對(duì)酵母具有毒害效果。酵母的代謝物甘油影響不大，但是酒精的產(chǎn)生速度減慢。和不添加農(nóng)藥的相比，添加農(nóng)藥的這組的酒精的最大產(chǎn)生量晚了4-5天。添加農(nóng)藥的一組最后的酒精的最大濃度高于不加農(nóng)藥的一組，這是由于添加不加農(nóng)藥這組的糖在發(fā)酵開(kāi)始階段已經(jīng)消耗了。24 雖說(shuō)戊唑醇的殘留對(duì)酵母有毒害作用，導(dǎo)致單位最大生物量和發(fā)酵速度的減緩，然而，對(duì)于真正的釀酒體系溶于葡萄汁的戊唑醇有一局部會(huì)吸附到懸浮于液相的固體顆粒上，所以溶液中真正的液體農(nóng)殘濃度很低，對(duì)酵母發(fā)酵的影響很小了 。 本試驗(yàn)為了研究農(nóng)藥的減少不僅由于固體物質(zhì)的吸附而且還有酵母菌的吸附作用，在發(fā)酵過(guò)程中不僅對(duì)游離于液體中的戊唑醇進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)對(duì)吸附于酵母上的 農(nóng)藥殘留量也進(jìn)行了檢測(cè)。 結(jié)果顯示可溶性的戊唑醇的量未發(fā)生變化，酵母菌上面吸附的戊唑醇的含量不顯著。同時(shí)戊唑醇的降解產(chǎn)物未檢出，可知酵母菌在葡萄汁發(fā)酵過(guò)程中不會(huì)對(duì)戊唑醇產(chǎn)生降解作用。25263.3.2.