食品中脂肪蛋白的測(cè)定乳制品中非脂的測(cè)定教學(xué)教材

1、食品中脂肪蛋白的測(cè)定乳制品中非脂的測(cè)定半微量凱氏定氮 裝置 凱氏定氮法方法提要?jiǎng)P氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量分四步：即消化、蒸餾與吸收、滴定、計(jì)算。 (1)消化 消化反應(yīng) 消化裝置(3-16,3-19)2）蒸餾與吸收（3）滴定 指示劑：溴甲酚綠甲基紅（5：1），酒紅（酸式色）灰色（變色點(diǎn)）蘭色（堿式色）； 次甲基藍(lán)甲基紅（1：2），紫紅（酸式色）蘭紫色（變色點(diǎn)）綠色（堿式色）。（4）計(jì)算其中：0.0141亳摩爾鹽酸相當(dāng)于氮的克數(shù) M：標(biāo)準(zhǔn)鹽酸的摩爾濃度。 W：每份樣品的克數(shù)。F：蛋白質(zhì)換算系數(shù)，又稱氮-蛋白質(zhì)換算系數(shù)。 多數(shù)蛋白質(zhì)換算系為數(shù)6.25。 不同的食品采用不同的換算系數(shù)。見下表：4、凱氏定

2、氮法的特點(diǎn)及適用范圍（1）費(fèi)時(shí)，操作復(fù)雜；測(cè)定食品蛋白質(zhì)的最準(zhǔn)確的方法，作標(biāo)準(zhǔn)方法；半自動(dòng)化、全自動(dòng)化階段。（2）本法測(cè)定的為粗蛋白 非蛋白氮 純蛋白質(zhì)的定量（3）消化用H2SO4，不用HNO3和HClO4 。食品脂肪的測(cè)定20130809方法 （一）（一） *索氏提取法索氏提取法 （二）（二）酸水解法酸水解法 （三）（三）*羅紫羅紫-哥特里法哥特里法（堿性乙醚提取法）（堿性乙醚提取法） （四）（四） 巴布科克法和蓋勃法巴布科克法和蓋勃法 （五）（五）氯仿氯仿甲醇提取法甲醇提取法 過去測(cè)定脂肪普遍采用的是索式提取法，這種方法至今仍被認(rèn)為是測(cè)定多種食品脂類含量的代表性的方法，但對(duì)于某些樣品測(cè)定結(jié)

3、果往往偏低，而巴布科克法、益勒式法、羅斯-哥特里法主要用于乳、及乳制品中脂類的測(cè)定，而酸水解法測(cè)出的脂肪為游離態(tài)脂和結(jié)合脂全部脂類。適用范圍與特點(diǎn) 索氏提取法適用于脂類含量較高，結(jié)合態(tài)的脂類含量較少，能烘干磨細(xì)，不宜吸濕結(jié)塊的樣品的測(cè)定。 此法只能測(cè)定游離態(tài)脂肪，而結(jié)合態(tài)脂肪無法測(cè)出，要想測(cè)出結(jié)合態(tài)脂肪需在一定條件下水解后變成為游離態(tài)的脂肪方能測(cè)出。 另外此法是經(jīng)典方法，對(duì)大多數(shù)樣品結(jié)果比較可靠，但需要周期長(zhǎng)，溶劑量大。提取常用試劑及其特點(diǎn)提取常用試劑及其特點(diǎn) 乙醚：乙醚：溶解能力強(qiáng)，沸點(diǎn)低（溶解能力強(qiáng)，沸點(diǎn)低（34.6），易燃，），易燃，可含約可含約2%的水分。因含水乙醚會(huì)同時(shí)抽出糖分等成的

4、水分。因含水乙醚會(huì)同時(shí)抽出糖分等成分，所使用時(shí)，必須采用無水乙醚作提取劑，且待分，所使用時(shí)，必須采用無水乙醚作提取劑，且待測(cè)樣品應(yīng)無水分。測(cè)樣品應(yīng)無水分。乙醚不能溶解結(jié)合態(tài)脂肪。乙醚不能溶解結(jié)合態(tài)脂肪。 石油醚：石油醚：溶解能力比乙醚弱，沸程溶解能力比乙醚弱，沸程3545，無，無乙醚易燃，吸水比乙醚少，乙醚易燃，吸水比乙醚少，也不能提取結(jié)合態(tài)脂肪。也不能提取結(jié)合態(tài)脂肪。 氯仿甲醇混合液：氯仿甲醇混合液：價(jià)格高、毒性強(qiáng)、對(duì)脂蛋白、價(jià)格高、毒性強(qiáng)、對(duì)脂蛋白、磷脂提取效率高。磷脂提取效率高。羅紫羅紫哥特里法哥特里法GB5413.3第一法第一法此法為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織（此法為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO），聯(lián)合

5、國(guó)糧農(nóng)組織），聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織/世界世界衛(wèi)生組織（衛(wèi)生組織（FAO/WHO）等采用，為乳）等采用，為乳、煉乳煉乳、奶粉奶粉、奶油等脂類定量的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)法。奶油等脂類定量的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)法。它適用于各種液狀乳它適用于各種液狀乳（生乳（生乳、加工乳加工乳、部分脫脂乳部分脫脂乳、脫脂乳等）脫脂乳等）、各種煉乳各種煉乳、奶粉奶粉、奶油及奶油及冰淇淋冰淇淋。除乳制品外，也。除乳制品外，也適適用于豆乳或加用于豆乳或加工成乳狀的食品。工成乳狀的食品。 本法適用于能在堿性溶液中溶解或至少能形成均勻混本法適用于能在堿性溶液中溶解或至少能形成均勻混懸膠體的樣品，是乳品脂肪測(cè)定公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)方法懸膠體的樣品，是乳品脂肪測(cè)定公認(rèn)的

6、標(biāo)準(zhǔn)方法 乳是多種物質(zhì)組成的混合物，它不是簡(jiǎn)單乳是多種物質(zhì)組成的混合物，它不是簡(jiǎn)單的分散體系，而是具有膠體特性的多種分的分散體系，而是具有膠體特性的多種分散體系。故在乳脂類測(cè)定中，用有機(jī)溶劑散體系。故在乳脂類測(cè)定中，用有機(jī)溶劑不能直接提取不能直接提取，而必須，而必須先行破壞膠體狀態(tài)先行破壞膠體狀態(tài)進(jìn)而進(jìn)而破壞脂肪球膜破壞脂肪球膜，使，使脂肪游離脂肪游離，再用有，再用有機(jī)溶劑進(jìn)行提取、定量。機(jī)溶劑進(jìn)行提取、定量。1、原理原理羅紫羅紫哥特里法的原理是利用破壞乳的膠體性狀及脂肪球膜，使非脂成分溶解哥特里法的原理是利用破壞乳的膠體性狀及脂肪球膜，使非脂成分溶解于氨于氨-乙醇溶液中而脂肪游離出來，再用乙

7、醚乙醇溶液中而脂肪游離出來，再用乙醚-石油醚提取出脂肪，蒸餾去除石油醚提取出脂肪，蒸餾去除溶劑后，殘留物即為乳脂。溶劑后，殘留物即為乳脂。2、儀器儀器恒溫水浴恒溫水?。?0-700C和和1000C）毛氏抽脂瓶毛氏抽脂瓶電熱恒溫烘箱（電熱恒溫烘箱（80-120）3、 試劑試劑 250g/L氨水（相對(duì)密度氨水（相對(duì)密度0.91） 95%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇（體積分?jǐn)?shù)）乙醇 乙醚：不含過氧化物乙醚：不含過氧化物 石油醚石油醚4、操作步驟 氨-乙醇處理 乙醚-石油醚提取 回收溶劑 （1）儀器準(zhǔn)備）儀器準(zhǔn)備 恒重三角瓶，恒重三角瓶， （2）抽提）抽提 稱取乳粉稱取乳粉1克左右（或牛奶克左右（或牛奶10克），

8、放入毛氏抽脂瓶克），放入毛氏抽脂瓶中，乳粉加入中，乳粉加入10ml 50-550C的水的水，混勻。加入，混勻。加入2ml 氨水氨水，充分混合后立即放入充分混合后立即放入65 50C的水浴的水浴中，加熱中，加熱15-20分鐘分鐘。取出毛氏抽脂瓶，冷卻至室溫。加入取出毛氏抽脂瓶，冷卻至室溫。加入10ml乙醇乙醇，緩和并，緩和并徹底混合，加入兩滴剛果紅，再加入徹底混合，加入兩滴剛果紅，再加入25ml乙醚乙醚振搖振搖1min，再加入再加入25ml石油醚石油醚，震蕩，震蕩30秒秒.靜至靜至30min，待分層清晰，待分層清晰后，將有機(jī)層倒入至已恒重的接受瓶中。再加乙醚、石油后，將有機(jī)層倒入至已恒重的接受瓶

9、中。再加乙醚、石油醚（醚（2-3次）的次）的重復(fù)提取重復(fù)提?。看斡茫看斡?5ml），將），將有機(jī)層合并有機(jī)層合并于同一接受瓶中。于同一接受瓶中。（3）蒸發(fā)溶劑、烘干、稱重）蒸發(fā)溶劑、烘干、稱重 將接受瓶放置將接受瓶放置1000C水浴中蒸去醚液后，置于水浴中蒸去醚液后，置于100-1050C烘箱干燥烘箱干燥2小時(shí)，取出置干燥器中，冷卻室溫后稱量，反復(fù)小時(shí)，取出置干燥器中，冷卻室溫后稱量，反復(fù)操作直至恒重。操作直至恒重。m2 5、結(jié)果計(jì)算、結(jié)果計(jì)算 m2m1 粗脂肪（粗脂肪（%）= x 100 m樣樣 m2接受瓶和脂肪的質(zhì)量，接受瓶和脂肪的質(zhì)量，g m1接受瓶質(zhì)量，接受瓶質(zhì)量，g m樣樣樣品質(zhì)

10、量，樣品質(zhì)量，g巴布科克法和蓋勃法1、原理、原理用濃硫酸溶解乳中的用濃硫酸溶解乳中的乳糖和蛋白質(zhì)等非脂成乳糖和蛋白質(zhì)等非脂成分，將牛奶中的酪蛋白鈣分，將牛奶中的酪蛋白鈣鹽轉(zhuǎn)變成可溶性的重硫酸鹽轉(zhuǎn)變成可溶性的重硫酸酪蛋白，使脂肪球膜被破酪蛋白，使脂肪球膜被破壞，脂肪游離出來，再利壞，脂肪游離出來，再利用加熱離心，使脂肪完全用加熱離心，使脂肪完全迅速分離，直接讀取脂肪迅速分離，直接讀取脂肪層的數(shù)值，便可知被測(cè)乳層的數(shù)值，便可知被測(cè)乳的含脂率。的含脂率。 2、適應(yīng)范圍與特點(diǎn)、適應(yīng)范圍與特點(diǎn)這兩種方法都是這兩種方法都是測(cè)定乳脂肪的標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定乳脂肪的標(biāo)準(zhǔn)方法，適用于鮮乳及乳制品脂肪的測(cè)定。對(duì)含糖多適用

11、于鮮乳及乳制品脂肪的測(cè)定。對(duì)含糖多的乳品（如甜煉乳、加糖乳粉等），采用此的乳品（如甜煉乳、加糖乳粉等），采用此方法時(shí)糖易焦化，使結(jié)果誤差較大，故不適方法時(shí)糖易焦化，使結(jié)果誤差較大，故不適宜。宜。此法操作簡(jiǎn)便，迅速。對(duì)大多數(shù)樣品來說此法操作簡(jiǎn)便，迅速。對(duì)大多數(shù)樣品來說測(cè)定精度可滿足要求，但不如重量法準(zhǔn)確。測(cè)定精度可滿足要求，但不如重量法準(zhǔn)確。 3、儀器、儀器 巴布科克氏乳脂瓶：頸部刻度有0.08.0%，0.010.0%兩種，最小刻度值為0.1%， 蓋勃氏乳脂計(jì)：頸部刻度為0.08.0%，最小刻度為0.1% 乳脂離心機(jī) 蓋勃氏離心機(jī) 標(biāo)準(zhǔn)移乳管4、試劑、試劑硫酸：相對(duì)密度1.8160.003（20

12、C），相當(dāng)于9091%硫酸 異戊醇：相對(duì)密度0.8110.002（20C），沸程128132C。 精密吸取精密吸取17.6mL樣品，倒入巴布科克氏乳脂瓶中，再取樣品，倒入巴布科克氏乳脂瓶中，再取17.5mL硫酸，沿瓶硫酸，沿瓶頸緩緩注入瓶中，將瓶頸回旋，使液體充分混合，至無凝塊并呈均勻棕色。頸緩緩注入瓶中，將瓶頸回旋，使液體充分混合，至無凝塊并呈均勻棕色。置乳脂離心機(jī)上，以約置乳脂離心機(jī)上，以約1000r/min的速度離心的速度離心5min，取出，加入，取出，加入80C以上的以上的水至瓶頸基部，再置離心機(jī)中離心水至瓶頸基部，再置離心機(jī)中離心2min，取出后再加入，取出后再加入80C以上的水至脂

13、肪以上的水至脂肪浮到浮到2或或3刻度處，再置離心機(jī)中離心刻度處，再置離心機(jī)中離心1min，取出后置，取出后置5560C水溶中，水溶中，5min后立即讀取脂肪層最高與最低點(diǎn)所占的格數(shù)，即為樣品含脂肪的百分?jǐn)?shù)。后立即讀取脂肪層最高與最低點(diǎn)所占的格數(shù)，即為樣品含脂肪的百分?jǐn)?shù)。6、說明及討論、說明及討論 硫酸的濃度要嚴(yán)格遵守規(guī)定的要求，如過濃會(huì)使乳硫酸的濃度要嚴(yán)格遵守規(guī)定的要求，如過濃會(huì)使乳炭化呈黑色溶液而影響讀數(shù)；過稀則不能使酪蛋白完全溶炭化呈黑色溶液而影響讀數(shù)；過稀則不能使酪蛋白完全溶解，會(huì)使測(cè)定值偏低或使脂肪層混濁。解，會(huì)使測(cè)定值偏低或使脂肪層混濁。 硫酸硫酸除可除可 破壞脂肪球膜，使脂肪游離出

14、來外，還可破壞脂肪球膜，使脂肪游離出來外，還可增加液體相對(duì)密度，使脂肪容易浮出。增加液體相對(duì)密度，使脂肪容易浮出。 蓋勃法中所用蓋勃法中所用異戊醇異戊醇的作用是的作用是促使脂肪析出促使脂肪析出，并能，并能降低脂肪球的表面張力，以利于形成連續(xù)的脂肪層。降低脂肪球的表面張力，以利于形成連續(xù)的脂肪層。 加熱加熱（6570C水浴中）和水浴中）和離心離心的目的是的目的是促使脂肪促使脂肪離析。離析。 巴布科克法中采用巴布科克法中采用17.6ml標(biāo)準(zhǔn)吸管取樣標(biāo)準(zhǔn)吸管取樣，實(shí)際上注入巴，實(shí)際上注入巴氏瓶中的樣品只有氏瓶中的樣品只有17.5ml，牛乳的相對(duì)密度為，牛乳的相對(duì)密度為1.03，故樣品重，故樣品重量為

15、量為17.51.03=18g。巴氏瓶頸的刻度（。巴氏瓶頸的刻度（010%）共）共10個(gè)大個(gè)大格，每大格容積為格，每大格容積為0.2ml，在，在60C左右，脂肪的平均相對(duì)密度左右，脂肪的平均相對(duì)密度為為0.9，故當(dāng)整個(gè)刻度部分充滿脂肪時(shí)，其脂肪重量為，故當(dāng)整個(gè)刻度部分充滿脂肪時(shí)，其脂肪重量為0.2100.9=1.8g。18g樣品中含有樣品中含有1.8g脂肪，即瓶頸全部刻度脂肪，即瓶頸全部刻度表示為脂肪含量表示為脂肪含量10%，每一大格代表每一大格代表1%的脂肪。的脂肪。故瓶頸刻度故瓶頸刻度讀數(shù)即為樣品中脂肪百分含量。讀數(shù)即為樣品中脂肪百分含量。 每組樣品只取兩格乳脂瓶進(jìn)行測(cè)定。放入離心機(jī)時(shí)，必每

16、組樣品只取兩格乳脂瓶進(jìn)行測(cè)定。放入離心機(jī)時(shí)，必須對(duì)稱放置。須對(duì)稱放置。 硫酸的濃度和用量必須嚴(yán)格按照規(guī)定硫酸的濃度和用量必須嚴(yán)格按照規(guī)定，沿瓶壁緩慢加，沿瓶壁緩慢加入，回旋搖動(dòng)，使充分混合入，回旋搖動(dòng)，使充分混合 ，否則易時(shí)脂肪層產(chǎn)生黑色塊粒。，否則易時(shí)脂肪層產(chǎn)生黑色塊粒。氯仿氯仿-甲醇提取法甲醇提取法索氏提取法對(duì)包含在組織內(nèi)部的脂肪等不能完全提取出來，酸索氏提取法對(duì)包含在組織內(nèi)部的脂肪等不能完全提取出來，酸分解法常使磷脂分接而損失。而在一定的水分存在下，極性的甲醇及非極性分解法常使磷脂分接而損失。而在一定的水分存在下，極性的甲醇及非極性的氯仿混合溶液卻能有效地提取結(jié)合態(tài)脂類，如脂蛋白的氯仿混

17、合溶液卻能有效地提取結(jié)合態(tài)脂類，如脂蛋白、蛋白脂等及磷脂，蛋白脂等及磷脂，此法對(duì)于此法對(duì)于高水分生物試樣高水分生物試樣如鮮魚、蛋類等脂類的測(cè)定更為有效。如鮮魚、蛋類等脂類的測(cè)定更為有效。1、原理原理氯仿氯仿-甲醇提取法的原理是將甲醇提取法的原理是將試試樣分散于氯樣分散于氯仿仿-甲醇甲醇混合液混合液中，于水浴上輕微沸騰，中，于水浴上輕微沸騰，氯氯仿仿-甲醇混合液與一定的水分形成提取脂類的有效溶劑，在甲醇混合液與一定的水分形成提取脂類的有效溶劑，在使使試樣組織中結(jié)合試樣組織中結(jié)合態(tài)脂類態(tài)脂類游離游離出來的同時(shí)與磷脂等極性脂類的親合性增大出來的同時(shí)與磷脂等極性脂類的親合性增大，從而有效地提取出全從而

18、有效地提取出全部脂類。再經(jīng)過濾，除去非脂成分，然后回收溶劑，對(duì)于殘留脂類要用石油醚部脂類。再經(jīng)過濾，除去非脂成分，然后回收溶劑，對(duì)于殘留脂類要用石油醚提取，定量。提取，定量。 2、儀器儀器 具塞三角瓶具塞三角瓶 電熱恒溫水?。弘姛岷銣厮。?01000C 提取裝置提取裝置 布氏漏斗：布氏漏斗：11G-3，過濾板直徑，過濾板直徑40mm，容量容量60100mL 具塞離心管具塞離心管 離心機(jī)：離心機(jī)：3000r/min。 3、試劑 氯仿：氯仿：97%（體積分?jǐn)?shù)）以上。（體積分?jǐn)?shù)）以上。 甲醇：甲醇：96%（體積分?jǐn)?shù)）以上。（體積分?jǐn)?shù)）以上。 氯仿甲醇混合液：按氯仿甲醇混合液：按2：1體積比混合。體

19、積比混合。 石油醚。石油醚。 無水硫酸鈉：以無水硫酸鈉：以1201350C干燥干燥12h。 4、操作步驟操作步驟 提取提取 準(zhǔn)確稱取均勻樣品準(zhǔn)確稱取均勻樣品5g于具塞三角瓶?jī)?nèi)（高水分食品可于具塞三角瓶?jī)?nèi)（高水分食品可加適量硅藻土使其分散），加入加適量硅藻土使其分散），加入60mL氯仿氯仿-甲醇混合液（對(duì)甲醇混合液（對(duì)于干燥食品，可加入于干燥食品，可加入23mL水）。連接提取裝置，于水）。連接提取裝置，于650C水水浴中，由輕微沸騰開始，加熱浴中，由輕微沸騰開始，加熱1h進(jìn)行提取。進(jìn)行提取。 回回 收溶劑收溶劑 提取結(jié)束后，取下燒瓶用布氏漏斗過濾，并用氯仿提取結(jié)束后，取下燒瓶用布氏漏斗過濾，并用

20、氯仿-甲甲醇混合液洗滌濾器，燒瓶及濾器中試樣殘?jiān)?，濾液醇混合液洗滌濾器，燒瓶及濾器中試樣殘?jiān)?，濾液、洗滌液洗滌液一并收集于具塞三角瓶?jī)?nèi)，置一并收集于具塞三角瓶?jī)?nèi)，置65700C水浴中回收溶劑，至水浴中回收溶劑，至燒瓶?jī)?nèi)物料呈濃稠態(tài)，而不能使其干，然后冷卻。燒瓶?jī)?nèi)物料呈濃稠態(tài)，而不能使其干，然后冷卻。 石油醚萃取石油醚萃取、定量定量 用移液管加入用移液管加入25ml石油醚，然后加入石油醚，然后加入15g無水硫無水硫 酸鈉，立即加塞混搖酸鈉，立即加塞混搖1 min ，將醚層移入具塞離，將醚層移入具塞離心沉淀管進(jìn)行離心分離（心沉淀管進(jìn)行離心分離（3000r/min）5min.用用10mL移液管加入迅

21、速吸取離心管中澄清的石油移液管加入迅速吸取離心管中澄清的石油醚醚10mL,于已稱量至恒量的干燥稱量瓶?jī)?nèi)，于已稱量至恒量的干燥稱量瓶?jī)?nèi)，蒸蒸發(fā)發(fā)去除石油醚去除石油醚，于于1001050C烘箱中烘箱中烘至恒量（約烘至恒量（約30 min ）。）。 5、結(jié)果計(jì)算 （ m2m1）x 2.5總脂肪（%）= x 100 m m-試樣質(zhì)量，g; m2-稱量瓶與脂類質(zhì)量，g; m1-稱量瓶質(zhì)量，g; 2.5-從25mL乙醇中取10mL進(jìn)行干燥，故乘以系數(shù)2.5。6、本法適用范圍：、本法適用范圍：結(jié)合態(tài)脂肪類的食品（魚結(jié)合態(tài)脂肪類的食品（魚 .大豆類）大豆類）乳和乳制品中非脂乳固體的測(cè)定 GB 5413.392

22、010 1 范圍生乳、巴氏殺菌乳、滅菌乳、調(diào)制乳、發(fā)酵乳中非脂乳固體的測(cè)定方法2 原理先分別測(cè)定出乳及乳制品中的總固體含量、脂肪含量（如添加了蔗糖等非乳成分含量，也應(yīng)扣除），再用總固體減去脂肪和蔗糖等非乳成分含量，即為非脂乳固體。 試劑和材料平底皿盒：高20 mm25 mm，直徑50 mm70 mm的帶蓋不銹鋼或鋁皿盒，或玻璃稱量皿。短玻璃棒：適合于皿盒的直徑，可斜放在皿盒內(nèi)，不影響蓋蓋。 石英砂或海砂：可通過500 m孔徑的篩子，不能通過180 m孔徑的篩子，并通過下列適用性測(cè)試：將約20 g的海砂同短玻棒一起放于一皿盒中，然后敞蓋在100 2 的干燥箱中至少烘2 h。把皿盒蓋蓋后放入干燥器中冷卻至室溫后稱量，準(zhǔn)確至0.1 mg。用5 mL水將海砂潤(rùn)濕，用短玻棒混合海砂和水，將其再次放入干燥箱中干燥4 h。把皿盒蓋蓋后放入干燥器中冷卻至室溫后稱量，精確至0.1 mg,兩次稱量的差不應(yīng)超過0.5 mg。如果兩次稱量的質(zhì)量差超過了0.5 mg，則需對(duì)海砂進(jìn)行下面的處理后，