試驗(yàn)常用培養(yǎng)基和基本特性

1、常用培養(yǎng)基及基本特性1、RPMI-1640MediumRPMI-1640廣泛應(yīng)用于哺乳動物、特殊造血細(xì)胞、正?；驉盒栽錾陌准?xì)胞，雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)，是目前應(yīng)用十分廣泛的培養(yǎng)基。主要用于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。其它像K-562、HL-60、Jurkat、Daudi、IM-9等成淋巴細(xì)胞、T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞以及HCT-15上皮細(xì)胞等均可參考使用。2、MinimumEssentialMedium（MEM也稱最低必需培養(yǎng)基，它僅含有12種必需氨基酸、谷氨酰胺和8種維生素。成分簡單，可廣泛適應(yīng)各種已建成細(xì)胞系和不同地方的哺乳動物細(xì)胞類型的培養(yǎng)。MEM-Alpha-般用于培養(yǎng)一些難培養(yǎng)細(xì)胞類型,而其它沒有特殊之處的細(xì)

2、胞株則幾乎均可采用MEMft培養(yǎng)。3、DMEM-糖（標(biāo)準(zhǔn)型）是一種應(yīng)用十分廣泛的培養(yǎng)基，可用于許多哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)，更適合高密度懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。適用于附著性較差，但又不希望它脫離原來生長點(diǎn)的克隆培養(yǎng)，也可用于雜交瘤中骨髓瘤細(xì)胞和DNA專染的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)。4、DMEM氐糖（標(biāo)準(zhǔn)型）是一種應(yīng)用十分廣泛的培養(yǎng)基，可用于許多哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)。低糖適于依賴性貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，特別適用于生長速度快、附著性較差的月中瘤細(xì)胞培養(yǎng)。5、DMEM/F12DMEM/F1將養(yǎng)基適于克隆密度的培養(yǎng)。F12培養(yǎng)基成分復(fù)雜，含有多種微量元素，和DMEMX1:1結(jié)合，稱為DMEM/F1結(jié)養(yǎng)基（DME/F12medium,作為開發(fā)

3、無血清配方的基礎(chǔ)，以利用F12含有較豐富的成分和DME欣有較高濃度的營養(yǎng)成分為優(yōu)點(diǎn)。該培養(yǎng)基適用于血清含量較低條件下哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)。為了增強(qiáng)該培養(yǎng)基的緩沖能力，改良之一是在DMEM/F121:1）中加入15mMHEPES中液。6、McCoys5AMcCoys5AMedium主要為肉瘤細(xì)胞的培養(yǎng)所設(shè)計(jì)，可支持多種（如骨髓、皮膚、肺和脾臟等）的原代移植物的生長，除適于一般的原代細(xì)胞培養(yǎng)外，主要用于作組織活檢培養(yǎng)、一些淋巴細(xì)胞培養(yǎng)以及一些難培養(yǎng)細(xì)胞的生長支持。例如Jensen大鼠肉瘤成纖維細(xì)月6、人淋巴細(xì)胞、HT-29、BHL-100等上皮細(xì)胞。7、IscovesModifiedDulbeccoM

4、edium(IMDM)Guilber和Iscove將DulbeccoMedium改良為IscovesMedium用于培養(yǎng)紅細(xì)胞和巨噬細(xì)胞前體。此種培養(yǎng)液含有硒、額外的氨基酸和維生素、丙酮酸鈉和HEPES并用硝酸鉀取代了硝酸鐵。IMDM能夠促進(jìn)小鼠B淋巴細(xì)胞，LPS刺激的B細(xì)胞，骨髓造血細(xì)胞，T細(xì)胞和淋巴瘤細(xì)胞的生長。IMDM營養(yǎng)非常豐富的培養(yǎng)液，因此可以用于高密度細(xì)胞的快速增殖培養(yǎng)。8、M-199Medium1950年，Morgan成功研制出具有確定化學(xué)成分的細(xì)胞培養(yǎng)液，即M-199,主要用于雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)。此培養(yǎng)液必須輔以血清才能支持長期培養(yǎng)。M-199可用于培養(yǎng)多種種屬來源的細(xì)胞，并能

5、培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。9、LeibovitzMedium(L-15)L-15培養(yǎng)液適用于快速增殖瘤細(xì)胞的培養(yǎng)，用于在CO2缺乏的情況下培養(yǎng)月中瘤細(xì)胞株。此培養(yǎng)液采用磷酸鹽緩沖體系，氨基酸組成進(jìn)一步改良，并由半乳糖替代了葡萄糖。10、HamsF-10培養(yǎng)基：適應(yīng)小鼠細(xì)胞、人類二倍體的培養(yǎng)。11、HamsF-12培養(yǎng)基：可以在加入很少血清的情況下應(yīng)用，特別適合單細(xì)胞培養(yǎng)和克隆化培養(yǎng)，是無血清培養(yǎng)中常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)液。12、WilliamsMediumE：用于大鼠肝上皮細(xì)胞的長期細(xì)胞培養(yǎng)。13、MCDB131培養(yǎng)液：用于培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞。14、Opti-MEMIReducedSerumMedia:用于培養(yǎng)造血細(xì)

6、胞。15、植物血凝素(PHA：增加細(xì)胞轉(zhuǎn)化和DNA成。如何正確選擇細(xì)胞培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng)是實(shí)驗(yàn)室里最常見和最基本的實(shí)驗(yàn)了，但卻不是最簡單的。別小看細(xì)胞培養(yǎng)，這里可蘊(yùn)含著大學(xué)問。有時候細(xì)胞狀態(tài)不好，轉(zhuǎn)染、藥篩這些實(shí)驗(yàn)根本就沒辦法做。影響細(xì)胞培養(yǎng)的因素很多，讓我們先從培養(yǎng)基和血清說起。經(jīng)典的培養(yǎng)基有很多種，Inv讓rogen（G舊CO）、thermofisher（HyClone）、Sigma等公司都可以提供。其中DMEMRPMI1640MEMDMEM/F1都是應(yīng)用最廣泛的培養(yǎng)基。其他如M199IMDML15培養(yǎng)基等也用于某些細(xì)胞的培養(yǎng)。 MEM是由Eagles基礎(chǔ)培養(yǎng)基（BME）發(fā)展而來的，其中增加了

7、組分的范圍及濃度。 Dulbecco改良的BEM（DMEM1養(yǎng)基是為小鼠成纖維細(xì)胞設(shè)計(jì)的，現(xiàn)在常用于貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)。DMEMJ氨基酸濃度是MEM勺兩倍，維生素濃度是MEM勺4倍，采用雙倍的HCO劑CO2&度起到更好的緩沖作用。最初的配方中葡萄糖含量為1000mg/L,后來為了某些細(xì)胞的生長需要，將葡萄糖含量又調(diào)整為4500mg/L,這就是大家常說的低糖和高糖了。 aMEM&有附加的氨基酸、維生素以及核甘和脂肪酸，它可廣泛應(yīng)用于各種細(xì)胞類型，包括對營養(yǎng)成分要求苛刻的細(xì)胞。 HamsF12是為在低血清濃度下克隆CHCffl胞而設(shè)計(jì)的，現(xiàn)在也廣泛應(yīng)用于克隆形成率的分析及原代培養(yǎng)。F12還可以與DME

8、雕體積混合使用，得到一種高濃度與成分多樣化相結(jié)合的產(chǎn)物，這種培養(yǎng)基已應(yīng)用于許多原代培養(yǎng)及更難養(yǎng)的細(xì)胞系的培養(yǎng)。 RPMI1640培養(yǎng)基是專為淋巴細(xì)胞培養(yǎng)而設(shè)計(jì)的，現(xiàn)在已廣泛應(yīng)用于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)。以前經(jīng)常聽到有人問，這種細(xì)胞該用哪一種培養(yǎng)基呢？其實(shí)這個問題的答案可以很簡單，也可以好復(fù)雜。此話怎講？如果這種細(xì)胞是購自ATCCE其他的細(xì)胞庫，那很簡單，問供應(yīng)商就行了?；蛘哒业较嚓P(guān)的文獻(xiàn)，作為參考。Invitrogen網(wǎng)站上有一個CellLineDatabase的工具，也很好用。選擇你感興趣的細(xì)胞類型，它就會彈出推薦的培養(yǎng)基、血清和轉(zhuǎn)染試劑等，有時還有優(yōu)化好的轉(zhuǎn)染步驟，很方便。Sigma網(wǎng)站上也有一個

9、MediaExpert,包括了培養(yǎng)基所有成分的功能描述、使用推介和參考文獻(xiàn)等，它還是一個解決問題能手，對于細(xì)胞培養(yǎng)中的常見問題，如細(xì)胞貼壁不好、培養(yǎng)基變色等，它都會列出可能的原因，并提供補(bǔ)救辦法。這個Expert果然不簡單！但如果你是著手建立一種全新細(xì)胞的培養(yǎng)體系，根本找不到任何參考，那你就得花點(diǎn)時間自己試驗(yàn)了。萬事開頭難嘛。因?yàn)闆]有一個標(biāo)準(zhǔn)答案。在MEW培養(yǎng)的細(xì)胞，很可能在DME喊M199中同樣很容易生長?？傊?，首選MEMK貼壁細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)會是一個好的開始。你也可以購買幾種培養(yǎng)基來，然后花大約兩周的時間做一個簡單的細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)，來選擇其中最適合的。有時候你會驚訝地

10、發(fā)現(xiàn)你的最佳培養(yǎng)條件與文獻(xiàn)報(bào)道的不同，就算是同一種培養(yǎng)條件，細(xì)胞的生長狀態(tài)也時好時壞，這是很正常的。因?yàn)樵噭?、水、不同批號的血清之間都存在著差異。要提高培養(yǎng)基的穩(wěn)定性，可以從培養(yǎng)基和血清兩方面入手。以前大部分實(shí)驗(yàn)室都是用干粉培養(yǎng)基，但配制過程就較為繁瑣，要溶解、調(diào)pH值，過濾，過程中可能會產(chǎn)生一些濃度誤差，而且有些實(shí)驗(yàn)室的水質(zhì)并不理想，所以培養(yǎng)的效果會有差異。如果使用液體培養(yǎng)基，這種人為的誤差會減少，因?yàn)楫吘故谴笈抗I(yè)化生產(chǎn)的，批問差會很小。大家是不是感覺液體培養(yǎng)基會貴很多，以前是這樣，但現(xiàn)在非也。HyClone和Invitrogen都在國內(nèi)建立了液體培養(yǎng)基的生產(chǎn)基地，生產(chǎn)和運(yùn)輸成本大幅降低

11、，所以現(xiàn)在的價格也只是50-60元/500ml,比干粉培養(yǎng)基貴不了多少，而且還幫你省了過濾器和時間。血清含有生長因子可促進(jìn)細(xì)胞的繁殖，含有附著因子可促進(jìn)細(xì)胞的貼壁，同時還具有抗胰酶活性。血清同時也是礦物質(zhì)、脂類及激素的來源。最常用的血清有小牛血清、新生牛血清、胎牛血清和馬血清等。牛血清是按照采血時間的早晚來分類的。采血時間越早，營養(yǎng)物質(zhì)越豐富，所含抗體也越少，因而胎牛血清適合要求高的細(xì)胞系和克隆化培養(yǎng)。由于瘋牛病的原因，到目前為止，我國政府仍然禁止從北美洲、歐洲和日本等地區(qū)進(jìn)口牛血清，因此市面上的牛血清大多來自澳洲、南美洲，或是國產(chǎn)的。而血清批次間的差別就是不可避免的，這種差異來源于不同的制備

12、方法和除菌方法、動物的年齡差別及血清的儲存條件等，而且與取血動物的來源關(guān)系密切。不同的牧場、不同的氣候天氣及其他環(huán)境因素都可能影響血清的質(zhì)量。因此選好了一種血清就要盡可能長期使用它。在需要更換時，也要盡量保持與原有的一批血清相似?，F(xiàn)在很多公司都提供血清預(yù)留,你一旦選定了某個批次的血清，最好備足一年的量，這樣可以避免很多麻煩。血清固然是細(xì)胞培養(yǎng)中不可或缺的成分，但正如上文所說，血清的批問差異大，更換血清時需要做大量的測試以取保替換的血清與原來的相似。而血清的供應(yīng)也是必須要考慮的因素。由于氣候或瘋牛病的影響，說不定哪天血清就突然沒得賣了，那對實(shí)驗(yàn)的影響可非同小可。另外，血清的價格也很昂貴，雖說現(xiàn)在

13、也有便宜的國產(chǎn)血清，但是高品質(zhì)的澳洲血清價格仍舊高企。因此，也有一些實(shí)驗(yàn)室開始換用無血清培養(yǎng)基。無血清培養(yǎng)基(Serum-FreeMedia),通常以SFMfe示，顧名思義，就是在細(xì)胞培養(yǎng)中不需要添加血清，但是在某些應(yīng)用中可能要添加生長因子或細(xì)胞因子。無血清培養(yǎng)基中添加了血清的主要成分：粘附因子、生長因子、必需的營養(yǎng)物質(zhì)和激素等，能減少上述血清帶來的不利因素，使細(xì)胞培養(yǎng)的條件更穩(wěn)定。但它也不是完美的，從有血清培養(yǎng)過渡到無血清培養(yǎng)的條件并不像想象中那么直截了當(dāng)。處于發(fā)育的不同分化階段的細(xì)胞(例如干細(xì)胞與定向前體細(xì)胞相比)需要不同的配方，對生長因子和細(xì)胞因子的選擇尤為重要。而且在去除血清的同時，也

14、去除了一些血清蛋白具有的保護(hù)、解毒作用，因此對試劑、水的純度和儀器清潔度的要求更高。另外，它的價格也比普通的培養(yǎng)基貴很多?，F(xiàn)在有很多廠家生產(chǎn)無血清培養(yǎng)基。G舊CO&個細(xì)胞培養(yǎng)的金字招牌當(dāng)然少不了，它也是最早研制無血清培養(yǎng)基的。目前已經(jīng)開發(fā)了ES細(xì)胞、雜交瘤、CHO293、昆蟲細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞的無血精培養(yǎng)基。上個月還推出了首個間充質(zhì)干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，能使MSC持未分化狀態(tài)超過9代。HyClone公司也有CHO293、雜交瘤細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、病毒疫苗細(xì)胞的多種無血清培養(yǎng)基。Sigma則剛剛收購了澳大利亞JRH司，有了JRH的EX-CELL系列，無血清培養(yǎng)基的

15、選擇也更多了。這么多種，要選擇起來也是個頭疼的事情。除了部分培養(yǎng)基是公開配方的，如用于培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞的MCDB131(Sigma),大部分液體培養(yǎng)基都是專利配方的，也就是說其中的成分是保密的。那么你只能是檢索文獻(xiàn)、讓供應(yīng)商推薦，然后用自己的細(xì)胞做幾次傳代培養(yǎng)來選出最合適的培養(yǎng)基。畢竟實(shí)踐出真知嘛。P.S.附上一些細(xì)胞培養(yǎng)中的小Tip,可能會對您有所啟發(fā)。（部分摘自Invitrogen的中文Focus）?切記，細(xì)胞培養(yǎng)基的儲存條件是2-8攝氏度。如果細(xì)胞培養(yǎng)基不小心被凍，您應(yīng)該融化培養(yǎng)基并觀察是否有沉淀產(chǎn)生。如果沒有沉淀產(chǎn)生，培養(yǎng)基可以正常使用，如果出現(xiàn)沉淀，只能丟棄這些培養(yǎng)基。?貯存在冰箱中的瓶

16、口已開的培養(yǎng)基，可能在放置幾天后顏色變紫。這主要是由于在暴露到周圍的CO27K平時，碳酸氫納導(dǎo)致了pH值的上升。您可以在使用前松開瓶口，在CO加養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)基10-15分鐘，來校正溶液的pH值（確定松開瓶口以保證氣體交換）。?當(dāng)在無血清培養(yǎng)基中添加抗生素時，降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的50%血清蛋白會結(jié)合和滅活一些抗生素。在無血清培養(yǎng)條件下，抗生素不被滅活，可能對于細(xì)胞達(dá)到毒性水平。?一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時，您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。因?yàn)橐恍┛股睾脱逯械幕境煞衷诮鈨龊缶烷_始降解。?總之，大部分添加物和試劑最多可以凍融3次，如果次數(shù)更多都會在包含蛋白的溶液引起一定

17、水平的降解和沉淀，將會影響它的性能。?血清的熱滅活在免疫分析時可以滅活補(bǔ)體系統(tǒng)。在免疫學(xué)研究，培養(yǎng)ES細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時，推薦使用熱滅活血清。熱滅活是以往公認(rèn)的操作步驟，并沒有確鑿的證據(jù)說明這樣做是有益的。相反，對大部分細(xì)胞而言，GIBCO和HyClone都不推薦熱滅活血清。因?yàn)榧訜峥赡苁寡逯械某恋碓黾?，使您誤以為污染。?如何避免血清中沉淀物的產(chǎn)生？1 .解凍血清時，請按照所建議的逐步解凍法（-20C至4c至室溫），若血清解凍時改變的溫度太大（如-20C至37c）,實(shí)驗(yàn)顯示非常容易產(chǎn)生沉淀物。并隨時將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。2 .請勿將血清置于37c太久。若在

18、37c放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會因此受到損害，而影響血清的質(zhì)量。3 .血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無須做此步驟。4,若必須做血清的熱滅活，請遵守56C,30分鐘的原則，并且隨時搖晃均勻。溫度過高，時間過久或搖晃不均勻，都會造成沉淀物的增多。?在進(jìn)行傳代培養(yǎng)時，我們強(qiáng)烈推薦進(jìn)行臺盼蘭活性記數(shù)。研究者常常通過一個簡單的稀釋(1：4或1：2)進(jìn)行傳代，不進(jìn)行活性檢測，您可能接種比你認(rèn)為的低的多的濃度的細(xì)胞，這常?？赡軐?dǎo)致生長緩慢或培養(yǎng)物根本不生長。?貯存在4c冰箱中的液體胰蛋白酶溶液只能使用一周。胰蛋白酶在4c就可能開始降解，如果在室溫下放置超過30分鐘，就會變得不穩(wěn)定。?在訂購的細(xì)胞到達(dá)后，應(yīng)立即復(fù)蘇，如果培養(yǎng)基還沒有準(zhǔn)備好，可將其放入液氮中，盡快復(fù)蘇。千萬不能放置在-20或-80C的冰箱內(nèi)。?細(xì)胞復(fù)蘇往往是比較容易出問題的步驟。請?jiān)谟嗁徏?xì)胞時就向供應(yīng)商索取詳細(xì)的復(fù)蘇步驟，并仔細(xì)閱讀。有些供應(yīng)商就不推薦在復(fù)蘇時離心，對此類細(xì)節(jié)，應(yīng)特別