實(shí)驗(yàn)一紙層析法分離氨基酸

1、氨基酸的分離鑒定氨基酸的分離鑒定紙層析法紙層析法指導(dǎo)老師：鄭永良一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊弧?shí)驗(yàn)?zāi)康膌掌握氨基酸紙層析的方法和原理，學(xué)會(huì)分析待掌握氨基酸紙層析的方法和原理，學(xué)會(huì)分析待 測(cè)樣品的氨基酸成分。測(cè)樣品的氨基酸成分。 二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理l紙層析是以濾紙為惰性支持物的分配層析。濾紙纖維紙層析是以濾紙為惰性支持物的分配層析。濾紙纖維上的羥基具有親水性，吸附一層水作為固定相，有機(jī)上的羥基具有親水性，吸附一層水作為固定相，有機(jī)溶劑為流動(dòng)相。當(dāng)有機(jī)相流經(jīng)固定相時(shí)，物質(zhì)在兩相溶劑為流動(dòng)相。當(dāng)有機(jī)相流經(jīng)固定相時(shí)，物質(zhì)在兩相間不斷分配而得到分離。間不斷分配而得到分離。 l溶質(zhì)在濾紙上的移動(dòng)速度用溶質(zhì)在濾紙上

2、的移動(dòng)速度用RfRf值表示：值表示： lRfRf= =原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)中心的距離原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)中心的距離/ /原點(diǎn)到溶劑前沿的距原點(diǎn)到溶劑前沿的距離離 l在一定的條件下某種物質(zhì)的在一定的條件下某種物質(zhì)的RfRf值是常數(shù)。值是常數(shù)。RfRf值的大小值的大小與物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)、層析濾紙的質(zhì)量和與物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)、層析濾紙的質(zhì)量和層析溫度等因素有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)利用紙層析法分離氨基層析溫度等因素有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)利用紙層析法分離氨基酸。酸。 三、實(shí)驗(yàn)器材三、實(shí)驗(yàn)器材l（1 1）大燒杯（）大燒杯（5000mL5000mL）：）：1 1只只/ /組組 l（2 2）毛細(xì)管。）毛細(xì)管。 l（3 3）噴

3、霧器：公用。）噴霧器：公用。 l（4 4）培養(yǎng)皿：）培養(yǎng)皿：1 1只只/ /組。組。 l（5 5）層析濾紙（長(zhǎng)）層析濾紙（長(zhǎng)22cm22cm、寬、寬14cm14cm的的新華一號(hào)濾紙）：新華一號(hào)濾紙）：1 1張張/ /組。組。 l（6 6）直尺、鉛筆：自備。）直尺、鉛筆：自備。 l（7 7）電吹風(fēng)：）電吹風(fēng)：1 1只只/ /組。組。 l（8 8）托盤(pán)、針、白線(xiàn)：）托盤(pán)、針、白線(xiàn)：1 1套套/ /組。組。 l（9 9）手套：）手套：1 1雙雙/ /組。組。 l（1010）塑料薄膜：公用。）塑料薄膜：公用。 l（1111）小燒杯：）小燒杯：50mL50mL，1 1只只/ /組。組。 四、實(shí)驗(yàn)試劑四、

4、實(shí)驗(yàn)試劑l（1 1）擴(kuò)展劑：將）擴(kuò)展劑：將4 4體積正丁醇和體積正丁醇和1 1體積冰醋酸體積冰醋酸放入分液漏斗中，與放入分液漏斗中，與5 5體積水混合，充分振蕩，體積水混合，充分振蕩，靜置后分層，棄去下層水層。靜置后分層，棄去下層水層。 l（2 2）氨基酸溶液：）氨基酸溶液：0.5%0.5%的已知氨基酸溶液的已知氨基酸溶液3 3種種（亮氨酸、賴(lài)氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸，脯氨（亮氨酸、賴(lài)氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸，脯氨酸氨酸），酸氨酸），0.5%0.5%的待測(cè)氨基酸液的待測(cè)氨基酸液1 1種。種。 l（3 3）顯色劑：）顯色劑：0.1%0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。水合茚三酮正丁醇溶液。 實(shí)驗(yàn)試劑實(shí)驗(yàn)試

5、劑 五、實(shí)驗(yàn)操作五、實(shí)驗(yàn)操作l檢查培養(yǎng)皿是否干燥、潔凈；若否，將其洗凈并置于檢查培養(yǎng)皿是否干燥、潔凈；若否，將其洗凈并置于干燥箱內(nèi)干燥箱內(nèi)120120烘干。烘干。 l（1 1）平衡：剪一大塊塑料薄膜鋪在桌面上，將層析）平衡：剪一大塊塑料薄膜鋪在桌面上，將層析缸或大燒杯到置于塑料薄膜上，再把盛有約缸或大燒杯到置于塑料薄膜上，再把盛有約20mL20mL展層展層溶液的小燒杯置于倒置的層析缸或大燒杯中，用塑料溶液的小燒杯置于倒置的層析缸或大燒杯中，用塑料薄膜密封起來(lái)，平衡薄膜密封起來(lái)，平衡20min20min。（2）規(guī)劃：帶上手套，取寬約）規(guī)劃：帶上手套，取寬約14cm、高約、高約22cm的層析濾的層

6、析濾紙一張。在紙的下端距邊緣紙一張。在紙的下端距邊緣2cm處輕輕用鉛筆劃一條平處輕輕用鉛筆劃一條平行于底邊的直線(xiàn)行于底邊的直線(xiàn)A，在直線(xiàn)上，在直線(xiàn)上做做4個(gè)記號(hào)，記號(hào)之間間隔個(gè)記號(hào)，記號(hào)之間間隔2cm，這就是原點(diǎn)的位置。，這就是原點(diǎn)的位置。另在距左邊緣另在距左邊緣1cm處畫(huà)一條處畫(huà)一條平行于左邊緣的直線(xiàn)平行于左邊緣的直線(xiàn)B，在，在B線(xiàn)上以線(xiàn)上以A、B兩線(xiàn)的交點(diǎn)為原兩線(xiàn)的交點(diǎn)為原點(diǎn)標(biāo)明刻度（以厘米為單點(diǎn)標(biāo)明刻度（以厘米為單位），參見(jiàn)左圖。位），參見(jiàn)左圖。 （3 3）點(diǎn)樣：用毛細(xì)管浸液取樣，點(diǎn)在這四個(gè)位置上。同）點(diǎn)樣：用毛細(xì)管浸液取樣，點(diǎn)在這四個(gè)位置上。同一位置上需點(diǎn)一位置上需點(diǎn)2 23 3次，每

7、點(diǎn)完一點(diǎn)，立刻用電吹風(fēng)熱風(fēng)次，每點(diǎn)完一點(diǎn)，立刻用電吹風(fēng)熱風(fēng)吹干后再點(diǎn)，以保證每點(diǎn)在紙上擴(kuò)散的直徑最大不超過(guò)吹干后再點(diǎn)，以保證每點(diǎn)在紙上擴(kuò)散的直徑最大不超過(guò)3mm3mm。每人須點(diǎn)。每人須點(diǎn)4 4個(gè)樣，其中個(gè)樣，其中3 3個(gè)是已知樣，個(gè)是已知樣，1 1個(gè)是待測(cè)樣個(gè)是待測(cè)樣品。品。 （4 4）層析：用針、線(xiàn)將濾紙縫成筒狀，紙的兩側(cè)）層析：用針、線(xiàn)將濾紙縫成筒狀，紙的兩側(cè) 邊緣不能接觸且要保持平行，參見(jiàn)圖邊緣不能接觸且要保持平行，參見(jiàn)圖3-33-3。向培養(yǎng)。向培養(yǎng)皿中加入擴(kuò)展劑，使其液面高度達(dá)到皿中加入擴(kuò)展劑，使其液面高度達(dá)到1cm1cm左右，左右，將點(diǎn)好樣的濾紙筒直立于培養(yǎng)皿中（點(diǎn)樣的一端將點(diǎn)好樣的

8、濾紙筒直立于培養(yǎng)皿中（點(diǎn)樣的一端在下，擴(kuò)展劑的液面在在下，擴(kuò)展劑的液面在A A線(xiàn)下約線(xiàn)下約1cm1cm），罩上大燒），罩上大燒杯，仍用塑料薄膜密封。當(dāng)上升到杯，仍用塑料薄膜密封。當(dāng)上升到121215cm15cm，取，取出濾紙，剪斷連線(xiàn)，立即用鉛筆描出溶劑前沿線(xiàn)，出濾紙，剪斷連線(xiàn)，立即用鉛筆描出溶劑前沿線(xiàn)，迅速用電吹風(fēng)熱風(fēng)吹干。迅速用電吹風(fēng)熱風(fēng)吹干。l（5 5）顯色：用噴霧器在）顯色：用噴霧器在通風(fēng)廚中向?yàn)V紙上均勻噴通風(fēng)廚中向?yàn)V紙上均勻噴上上0.1%0.1%茚三酮正丁醇溶液，茚三酮正丁醇溶液，然后立即用熱風(fēng)吹干，即然后立即用熱風(fēng)吹干，即可顯出各層析斑點(diǎn)，參見(jiàn)可顯出各層析斑點(diǎn)，參見(jiàn)左圖。左圖。l（6 6）計(jì)算各種氨基酸的）計(jì)算各種氨基酸的RfRf值，并判斷混合樣品中都有哪值，并判斷混合樣品中都有哪些氨基酸，各人將自己的實(shí)驗(yàn)結(jié)果貼在實(shí)驗(yàn)報(bào)告上，見(jiàn)些氨基酸，各人將自己的實(shí)驗(yàn)結(jié)果貼在實(shí)驗(yàn)報(bào)告上，見(jiàn)表表3-23-2。 l（7 7）實(shí)驗(yàn)完畢，倒掉用過(guò)的展層液和平衡液，將培養(yǎng)皿）實(shí)驗(yàn)完畢，倒掉用過(guò)的展層液和平衡液，將培養(yǎng)皿洗凈，整理好桌面上的儀器和試劑，并注意清潔自己的洗凈，整理好桌面上的儀器和試劑，并注意清潔自己的操作臺(tái)，請(qǐng)老師驗(yàn)收，實(shí)驗(yàn)報(bào)告當(dāng)場(chǎng)交給老師。操作臺(tái)，請(qǐng)老師驗(yàn)收，實(shí)驗(yàn)報(bào)告當(dāng)場(chǎng)交給老師。l計(jì)算計(jì)算 RfRf= = 原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)中心的距離原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)中心的距離