CRISPR-Cas 9

1、CRISPR-Cas 9 靶向基因操作技術(shù)名詞解釋n1 CRISPR：clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences 成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列 n2 Cas ：CRISPR-associated CRISPR相關(guān)基因 n3 靶向：對(duì)特定目標(biāo)(分子、細(xì)胞、個(gè)體等)采取的行動(dòng)。如外源基因在宿主細(xì)胞基因組DNA預(yù)期位置上的定向插入；藥物分子對(duì)效應(yīng)靶組織或細(xì)胞的定向傳送或作用 。CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)1 CRISPR-Cas是很多細(xì)菌和大部分古生菌的天然免疫系統(tǒng)，通過(guò)對(duì)入侵的病毒和核酸進(jìn)行特異性的識(shí)別

2、，利用Cas蛋白進(jìn)行切割，從而達(dá)到對(duì)自身的免疫。 2 CRISPR-Cas系統(tǒng)賦予原核細(xì)胞針對(duì)外源DNA特異性免疫, 而這種特異性是由間隔序列（spacer）決定的。在宿主防御噬菌體攻擊中，針對(duì)自然界中龐大的噬菌體種群，細(xì)菌進(jìn)化了CRISPR 介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫。這種免疫功能的發(fā)揮是由CRISPR 間隔序列的動(dòng)態(tài)性變化，即通過(guò)增加或刪除間隔序列（spacer）來(lái)實(shí)現(xiàn)的。 CRISPR-Cas概述 CRISPR-Cas：一種來(lái)源是細(xì)菌獲得性免疫的由RNA指導(dǎo)Cas蛋白對(duì)靶向基因進(jìn)行修飾的技術(shù)CRISPR-Cas概述nCRISPR-Cas主要由兩部分組成識(shí)別識(shí)別切割切割CRISPR結(jié)構(gòu)nCRISPR

3、 是一個(gè)特殊的DNA重復(fù)序列家族, 廣泛分布于細(xì)菌和古細(xì)菌基因組中。CRISPR 位點(diǎn)通常由短的高度保守的重復(fù)序列(repeats) 組成, 重復(fù)序列的長(zhǎng)度通常 2148 bp, 重復(fù)序列之間被 2672 bp 間隔序列(spacer)隔開(kāi)。CRISPR就是通過(guò)這些間隔序列（space）與靶基因進(jìn)行識(shí)別。Cas家族nCas（CRISPR associated）：n 存在于CRISPR位點(diǎn)附近，是一種雙鏈DNA核酸酶，能在guide RNA引導(dǎo)下對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行切割。它與folk酶功能類(lèi)似，但是它并不需要形成二聚體才能發(fā)揮作用。Cas分類(lèi)n因?yàn)镃as 基因多樣性異常豐富，簡(jiǎn)單的分類(lèi)很難區(qū)分那些同源但

4、功能并不相關(guān)的Cas 蛋白30多個(gè)研究小組共同提議，考慮多個(gè)因素，包括保守性的Cas 蛋白之間的進(jìn)化關(guān)系及Cas 基因操縱子的組成方式等，將CRISPR/Cas 的免疫機(jī)制分為相對(duì)獨(dú)立的層次：n第一個(gè)層次主要是對(duì)外來(lái)信息的處理和加工，形成免疫記憶，也就是新的間隔序列的獲得，主要由通用的核心蛋白Cas1 和Cas2 參與完成；n第二個(gè)層次主要為初級(jí)CRISPR RNA 成熟以及識(shí)別和降解入侵的外源遺傳物質(zhì)n按照該分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)可以將CRISPR/Cas 系統(tǒng)分為：Type、Type、Type三種不同類(lèi)型Cas 9nType系統(tǒng)的主要特征是包含一個(gè)標(biāo)志性的Cas9 蛋白(分子質(zhì)量很大的多功能蛋白)參與c

5、rRNA的成熟以及降解入侵的噬菌體DNA 或是外源質(zhì)粒。nCas9 蛋白包含兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，一個(gè)在N端，有類(lèi)似于Ruc 核酸酶的活性，一個(gè)在中部有類(lèi)似HNH 核酸酶的活性。n嗜熱性鏈球菌具有典型的Type CRISPR/Cas 系統(tǒng)，它的CRISPR/Cas 系統(tǒng)編碼tracrRNA(trans-activating crRNA)，其指導(dǎo)RNase和Cas9 完成前體crRNA 的成熟。隨后tracrRNA 還能與成熟的crRNA 的重復(fù)序列配對(duì)形成RNA 二聚體，進(jìn)而和Cas9 蛋白結(jié)合成核糖核蛋白復(fù)合體，發(fā)揮識(shí)別和降解入侵的外源DNA 功能36CRISPR-Cas9原理n此系統(tǒng)的工作原理是

6、 crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通過(guò)堿基配對(duì)與 tracrRNA （trans-activating RNA ）結(jié)合形成 tracrRNA/crRNA 復(fù)合物，此復(fù)合物引導(dǎo)核酸酶 Cas9 蛋白在與 crRNA 配對(duì)的序列靶位點(diǎn)剪切雙鏈 DNA。而通過(guò)人工設(shè)計(jì)這兩種 RNA，可以改造形成具有引導(dǎo)作用的sgRNA （short guide RNA ），足以引導(dǎo) Cas9 對(duì) DNA 的定點(diǎn)切割。n作為一種 RNA 導(dǎo)向的 dsDNA 結(jié)合蛋白，Cas9 效應(yīng)物核酸酶是已知的第一個(gè)統(tǒng)一因子（unifying factor），能夠共定位 RNA、DNA 和蛋白，從而擁有巨大的

7、改造潛力。將蛋白與無(wú)核酸酶的 Cas9（ Cas9 nuclease-null）融合，并表達(dá)適當(dāng)?shù)?sgRNA ，可靶定任何 dsDNA 序列，而 sgRNA 的末端可連接到目標(biāo)DNA，不影響 Cas9 的結(jié)合。因此，Cas9 能在任何 dsDNA 序列處帶來(lái)任何融合蛋白及 RNA，這為生物體的研究和改造帶來(lái)巨大潛力。應(yīng)用 n基因敲除動(dòng)物模型一直以來(lái)是在活體動(dòng)物上開(kāi)展基因功能研究、尋找合適藥物作用靶標(biāo)的重要工具。但是傳統(tǒng)的基因敲除方法需要通過(guò)復(fù)雜的打靶載體構(gòu)建、ES細(xì)胞篩選、嵌合體小鼠選育等一系列步驟，不僅流程繁瑣、對(duì)技術(shù)的要求很高，而且費(fèi)用大，耗時(shí)較長(zhǎng)，成功率受到多方面因素的限制。即使對(duì)于技

8、術(shù)比較成熟的實(shí)驗(yàn)室，利用傳統(tǒng)技術(shù)構(gòu)建基因敲除大、小鼠一般也需要一年以上。2 n2013 年 1 月份，美國(guó)兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室在Science雜志發(fā)表了基于 CRISPR-Cas9 技術(shù)在細(xì)胞系中進(jìn)行基因敲除的新方法，該技術(shù)與以往的技術(shù)不同，是利用靶點(diǎn)特異性的 RNA 將 Cas9 核酸酶帶到基因組上的具體靶點(diǎn)，從而對(duì)特定基因位點(diǎn)進(jìn)行切割導(dǎo)致突變。該技術(shù)迅速被運(yùn)用到基因敲除小鼠和大鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建之中。通過(guò)一系列研究，首先證明了通過(guò) RNA 注射的方式將 CRISPR-Cas 系統(tǒng)導(dǎo)入小鼠受精卵比 DNA 注射能更有效的在胚胎中產(chǎn)生定點(diǎn)突變。在此基礎(chǔ)上，又發(fā)現(xiàn)了該方法沒(méi)有小鼠遺傳品系的限制，能夠?qū)Υ笃?/p>

9、的基因組 DNA 進(jìn)行刪除，也可以通過(guò)同時(shí)注射針對(duì)不同基因的 RNA 序列達(dá)到在同一只小鼠或大鼠中產(chǎn)生多個(gè)基因突變的效果。此外，還證明了利用 CRISPR-Cas 技術(shù)構(gòu)建的基因敲除大鼠模型與傳統(tǒng)方法構(gòu)建的同一基因（肥胖相關(guān) G 蛋白偶聯(lián)受體 Mc4R）突變大鼠相比具有一致的表型。該方法構(gòu)建的基因突變動(dòng)物具有顯著高于傳統(tǒng)方法的生殖系轉(zhuǎn)移能力，是一種可靠、高效、快速的構(gòu)建敲除動(dòng)物模型的新方法。2 nCRISPR-Cas 技術(shù)是繼鋅指核酸酶（ZFN）、ES 細(xì)胞打靶和 TALEN 等技術(shù)后可用于定點(diǎn)構(gòu)建基因敲除大、小鼠動(dòng)物的第四種方法，且有效率高、速度快、生殖系轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)及簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，在動(dòng)物模型構(gòu)建的應(yīng)用前景將非常廣闊技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)n優(yōu)點(diǎn)： 1