AB7500熒光定量PCR儀使用、維護(hù)、校準(zhǔn)實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

1、實(shí)用文件名稱AB7500熒光定量PCR儀使用、維護(hù)、校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程頒發(fā)部門制訂人：復(fù)核人：批準(zhǔn)人：質(zhì)保部制訂日期：復(fù)核日期：批準(zhǔn)日期：執(zhí)行日期版本1.0編號(hào)SOP04006制作份數(shù)份發(fā)送部門修訂記錄修訂人修訂原因修訂容版本修訂日期1 .目的：確保熒光定量PCR儀能夠正確和正常的使用，保證擴(kuò)增及結(jié)果分析的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)化。2 .圍：適用于AB7500熒光定量PCR儀的使用及維護(hù)。3 .定義：無4 .職責(zé)：熒光定量PCR儀使用人員負(fù)責(zé)本規(guī)程的實(shí)施。質(zhì)保部對(duì)本規(guī)定的有效執(zhí)行承擔(dān)監(jiān)督檢查責(zé)任。5 .容：5.1 室溫度控制在 1530C,相對(duì)濕度 4575%。5.2 儀器操作5.2.1 依次打開電腦顯示器

2、和電腦主機(jī)的電源開關(guān)，進(jìn)入 Windows界面。5.2.2 接著打開AB7500儀器電源開關(guān)，預(yù)熱 10分鐘。5.2.3 點(diǎn)擊7500 Software v2.3圖標(biāo)，打開軟件。5.2.4 按壓儀器托盤上的按壓位，待托盤彈出后，將所需檢測的8聯(lián)PCR反應(yīng)管或者96孔PCR反應(yīng)板放入檢測孔位，記下放置位置。檢測 8聯(lián)PCR反應(yīng)管用*反應(yīng)孔模塊，檢測 96孔PCR反應(yīng)板用* 反應(yīng)孔模塊。（檢測8聯(lián)PCR反應(yīng)管需放入蓋緊管蓋的空8聯(lián)PCR反應(yīng)管配平，檢測 96孔PCR反應(yīng)板無需配平）5.2.5 再次按壓托盤使其滑入儀器。5.2.6 新建擴(kuò)增參數(shù)模板：例如新建一個(gè) UG-63-62的模板，擴(kuò)增參數(shù)是9

3、5° , 10' ; （95° , 10 ； 63° ,45" ) X5 cycles； (95° , 10" ; 62° , 35" ) X 40 cycles,在 62° 時(shí)收集熒光信號(hào)(HEX、FAM信號(hào)），206反應(yīng)體系。5.2.6.1 在 Setup-Plate Setup-Define Targets and Samples 中，將 Target Name 下的 Targetl 改成 FAM ;點(diǎn)擊 Add New Target,將新增的 Target1改成HEX ,點(diǎn)擊 Report

4、ee下拉菜單，選擇 VIC。5.2.6.2 在 Setup-Run Method-Graphical View 中的 Reaction Volume Per Well 后面輸入 20（20 W l 反應(yīng)體系）。 選中第一個(gè) Holding Stage,點(diǎn)擊 Delete Selected 刪除;在 Cycling Stage 中的 Number of Cycles 后輸入5,在Step1中輸入時(shí)間10秒，在Step2中輸入溫度63度，輸入時(shí)間45秒，將63度下 面收集熒光圖標(biāo)點(diǎn)掉；點(diǎn)擊Add Stage下拉菜單選擇 Cycling ,在Cycling Stage中的Number ofCycle

5、s后輸入40,在Step1中輸入時(shí)間10秒，在Step2中輸入溫度62度，輸入時(shí)間35秒，在 62度下面點(diǎn)擊圖標(biāo)收集熒光。5.2.6.3 點(diǎn) 擊 Save下拉菜單下 的 Save As Tamplate ,文件 名輸入 UG-63-62 ,保存 在默認(rèn) ab7500-config-tamplates文件夾，關(guān)閉設(shè)置界面。5.2.7 已有擴(kuò)增參數(shù)模板：在軟件Home界面中點(diǎn)擊Template,選擇需要的模板，點(diǎn)擊打開。例如：UG-63-62 , 其擴(kuò)增參數(shù)就是 95° , 10' ; （95° , 10" ; 63° , 45" ） X

6、5 cycles； （95° , 10" ; 62° , 35"） X40 cycles,在 62° 時(shí)收集熒光信號(hào)（HEX、FAM 信號(hào)），Reaction Volume Per Well:20 6 （20 l 反應(yīng)體系）。5.2.8 在 Setup-Plate Setup-Assign Targets and Samples 中選擇 8 聯(lián)管擺放的位置，全部勾選Sample 1;UGT1A1*6 勾選 HEX , UGT1A1*28 勾選 FAM。5.2.9 在Run-Amplification Plot中點(diǎn)擊START RUN，命名為20

7、140101-1 （當(dāng)日日期+當(dāng)日上機(jī)次數(shù),例:2014 年1月1日第1次上機(jī)編號(hào)為20140101-1）,保存在默認(rèn)文件夾中，開始運(yùn)行。5.2.10 結(jié)果分析5.2.10.1 PCR反應(yīng)結(jié)束后自動(dòng)保存結(jié)果，對(duì)擴(kuò)增曲線進(jìn)行分析。5.2.10.2 也可根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的Start值、End值以（用戶可根據(jù)實(shí)際情況自行調(diào)整，Start值可以在 315、End值可設(shè)在 520）, Threshold值（Rn）推薦設(shè)定為 500015000,點(diǎn)擊 Analyze進(jìn)行分析，然后到 Plate窗口下記錄每個(gè)反應(yīng)的Ct值。5.2.11 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取出反應(yīng)管（切勿打開管蓋） ，順序關(guān)閉AB7

8、500軟件、定量PCR儀電源，關(guān)閉電腦。5.3 儀器維護(hù)5.3.1 每周維護(hù)5.3.1.1 檢查計(jì)算機(jī)磁盤空間。如需要，將實(shí)驗(yàn)文件歸檔或備份。?至少每周檢查一次計(jì)算機(jī)磁盤空間。?如果硬盤的可用空間不足其總?cè)萘康?0%,應(yīng)將較舊的數(shù)據(jù)傳輸?shù)絺浞荽鎯?chǔ)設(shè)備上保存。5.3.1.2 關(guān)閉控制7500 Instrument的計(jì)算機(jī)，30秒后再次開啟計(jì)算機(jī)。5.3.1.3 用無絨布?jí)K（不脫毛）蘸取75%酒精清潔7500 Instrument的表面。（注：切勿使用有機(jī)溶劑清潔7500 Instrument。）5.3.1.4 使用75%酒精浸泡反應(yīng)管托架（晾干后放回儀器）。5.3.2 每月維護(hù)5.3.2.1 執(zhí)

9、行背景校準(zhǔn)。（可執(zhí)行一次背景校準(zhǔn)以檢查是否存在污染物）5.3.2.2 運(yùn)行磁盤清理和磁盤碎片整理。?至少每月一次。?當(dāng)Windows?操作系統(tǒng)顯示消息提示執(zhí)行碎片整理時(shí)。?切勿同時(shí)運(yùn)行磁盤管理實(shí)用工具和7500 Real-Time PCR Software。5.3.3 每半年（6個(gè)月）維護(hù)5.3.3.1 檢查燈具狀態(tài)。在 7500 Software 中，選擇 Instrument fLamp Status/Replacement 以確定鹵素?zé)舻臓顟B(tài)。顯示 Lamp Status/Replacement 對(duì)話框：? Condition -表示以下其中一種狀況：- Good -燈具工作良好，不需要

10、更換。單擊 Close。- Failed -必須更換燈具。單擊 Close,然后按照5.3.4.3步驟更換鹵素?zé)簟? Change Soon -燈具使用超過 2000小時(shí)；生產(chǎn)商建議將其更換。單擊 Close,然后決定是否更換燈具。如果決定更換，請(qǐng)按照 5.3.4.3步驟更換鹵素?zé)簟? Usage （Hours）-燈具已照明的總小時(shí)數(shù)。? Lamp Current -燈具的輸出電流，以安培為單位（A）。低電流意味著燈具可能將要失效。? Date Last Replaced -上次更換燈具的日期。Lamp Status J ReplacementXCurent Lamp StatusCondit

11、l or:GoodUsage (Hours):0Lamp Current:UnknownDate Last Replaced: 10/01J2007Replace Lam|)You mustresetthe lamp timer前即 repiacins ffie lamp.| 皿臼2NOTE: The lamp timer can only be resertwhenttie instrument is idle Close在執(zhí)行一次運(yùn)行之前或期間,7500 Software可能顯示以下警告:消息描述Warning - Cannot detect sufficientcurrent from在

12、運(yùn)行開始時(shí)，燈具電流低于可接受水平。在lamp. Either lamp is notinstalled properly or needs to | bereplaced.按攵5.3.4.3步驟更換鹵素?zé)艟咧?，無法繼續(xù)該運(yùn)行。Warning - Cannot detect sufficientcurrent from7500 Software停止了該次運(yùn)行，因?yàn)樵谶\(yùn)行中l(wèi)amp. Either lamp is notinstalled properly or needs to燈具電流下降到可接受水平之下。在按照bereplaced.5.3.4.3步驟更換鹵素?zé)艟咧?，無法繼續(xù)該運(yùn)行。在消息

13、中S中單擊 OK,檢查儀器日志，然后更換燈具。Warning - The lamp usage hasexceeded 2000 hr. We在運(yùn)行開始時(shí)，燈具使用時(shí)間超過 2000小時(shí)。recommendreplacing thelamp soon to ensure單擊Cancel Run,然后更換燈具，或者單擊optimal assay performance.Continue Run 。重新運(yùn)行 ROI、背景、光學(xué)和染料校準(zhǔn)。5.3.3.2 執(zhí)行目標(biāo)區(qū)（ROI）校正。5.3.3.3 執(zhí)行背景校準(zhǔn)。5.3.3.4 執(zhí)行光學(xué)校準(zhǔn)。5.3.3.5 執(zhí)行染料校準(zhǔn)。5.3.3.6 執(zhí)行RNase

14、 P儀器驗(yàn)證試驗(yàn)。5.3.4 其它維護(hù)任務(wù)（需要時(shí)執(zhí)行）5.3.4.1 樣本塊污染清除。執(zhí)行以下程序，去除 7500 Instrument樣本塊的熒光污染。熒光污染是導(dǎo)致背景運(yùn)行失敗的常見原 因，在此情況下，一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)孔會(huì)持續(xù)表現(xiàn)出異常的高信號(hào)。注意！切勿移去設(shè)備上的蓋板。7500 Instrument中沒有用戶可安全維修的組件。如果懷疑存在問題，請(qǐng)聯(lián)系生產(chǎn)商服務(wù)代表。全程戴上一次性無粉手套操作。找到樣本塊中受污染的反應(yīng)孔（參閱5.4.2.13 “如何確定污染”）。從7500 Real-Time PCR Instrument中取出反應(yīng)板和托盤支架。a.按壓托盤門，將其打開。b.取出反應(yīng)板和

15、托盤支架。c.關(guān)閉托盤門。以一定角度向托盤右側(cè)施加壓力。文檔手動(dòng)降低樣本塊：a.在 7500 Software 中，選擇 InstrumentfInstrument Maintenance Manager。b.在 Instrument Maintenance Manager 的 ROI 選項(xiàng)卡中,單擊 Start Manual Calibration 。c .在 ROI Inspector 對(duì)話框中，單擊 Move Block。d.當(dāng) ROI Inspector 對(duì)話框顯示"Block Down ”時(shí)，單擊 Done。關(guān)閉7500 Real-Time PCR Instrument ,

16、然后拔下其電源電纜。允許儀器冷卻15分鐘。打開 7500 Real-Time PCR Instrument 的檢查門。a.將薄型螺絲刀插入檢查門邊緣處的鍵銷孔，然后推動(dòng)以解開門栓。b.打開儀器前門。抬起門栓，然后將受熱的護(hù)蓋門推到儀器的背面。使用少量的雙蒸水，清潔樣本塊中被污染的反應(yīng)孔:a.用移液管吸取少量雙蒸水并滴入每個(gè)受污染的反應(yīng)孔中。b.抽吸并滴入反應(yīng)孔中的雙蒸水?dāng)?shù)次，以沖洗反應(yīng)孔。c.將用過的雙蒸水水吸入廢液瓶中。d.使用棉花拭子，擦試每個(gè)被污染的反應(yīng)孔的壁。e.使用無絨布料，吸出殘余的雙蒸水。7500 Real-Time PCR Instrument將受熱的護(hù)蓋門拉到儀器的正面。抬起

17、門栓，然后將受熱的護(hù) 蓋門緊固到交叉桿。打開 7500 Real-Time PCR Instrument 的檢查門。?插上電源插頭并開啟7500 Instrument。?通過執(zhí)行背景校準(zhǔn)運(yùn)行確認(rèn)已消除污染（參閱 5.4.2 “背景校準(zhǔn)”）。?如果污染仍然存在，重復(fù)步驟至，然后使用95%乙醇溶液清潔樣本塊中受污染的反應(yīng)孔:a.用移液管吸取少量 95%乙醇溶液并滴入每個(gè)受污染的反應(yīng)孔中。b.抽吸并滴入反應(yīng)孔中的溶液數(shù)次，以沖洗反應(yīng)孔。c.將用過的乙醇溶液吸入廢液瓶中。重要！使用漂白劑溶液或乙醇溶液清潔反應(yīng)孔之后，應(yīng)始終使用雙蒸水沖洗反應(yīng)孔。?重復(fù)步驟至？，以沖洗樣本塊的反應(yīng)孔，并驗(yàn)證已清除掉污染物

18、。?如果污染仍然存在，重復(fù)步驟至，然后使用10%漂白劑溶液清潔樣本塊中受污染的反應(yīng)孔：a.用移液管吸取少量10%漂白劑溶液并滴入每個(gè)受污染的反應(yīng)孔中。b.抽吸并滴入反應(yīng)孔中的溶液數(shù)次，以沖洗反應(yīng)孔。c.將用過的漂白劑溶液吸入廢液瓶中。重要！使用漂白劑溶液或乙醇溶液清潔反應(yīng)孔之后，應(yīng)始終使用去離子水沖洗反應(yīng)孔。?重復(fù)步驟至？，以沖洗樣本塊的反應(yīng)孔，并驗(yàn)證已清除掉污染物。如果仍有污染，請(qǐng)與生 產(chǎn)商技術(shù)支持聯(lián)系。?確保受熱蓋門完全關(guān)閉并上閂。如果沒有，則7500 Software顯示錯(cuò)誤消息。5.3.4.2 移動(dòng)PCR儀。（更換或移動(dòng)光學(xué)器件的任何部件后，必須執(zhí)行ROI校準(zhǔn)、背景校準(zhǔn)、光學(xué)校準(zhǔn)、染料

19、校準(zhǔn)以及 RNase P儀器驗(yàn)證。）5.3.4.3 更換鹵素?zé)?。全程戴上一次性無粉手套操作。關(guān)閉7500 Instrument,然后拔下其電源電纜。允許儀器冷卻15分鐘。a.注意！灼熱。7500 Instrument和燈具灼熱！燈具在使用中會(huì)變得非常灼熱。在處理燈具之前,應(yīng)允許燈具冷卻15分鐘，并戴上無粉防護(hù)手套。b.重要！為避免灼傷及縮短新燈具的使用壽命，處理燈具時(shí)請(qǐng)戴上一次性無粉手套。c.注意！ 7500 Instrument按設(shè)計(jì)僅可使用12V、75W的鹵素?zé)簟４蜷_7500 Instrument的檢查門。a.將薄型螺絲刀插入檢查門邊緣處的鍵銷孔，然后推動(dòng)以解開門栓。b.打開儀器前門。從儀

20、器中取出燈具：a.向下滑動(dòng)燈具釋放桿。b.用手緊緊地抓住鹵素?zé)舨⑾蛏咸幔篃艟邚陌惭b槽口中脫出。查看燈具并確定有無故障跡象（有故障的燈具壁上通常有碳黑層）將新燈具安裝至儀器上:a.向上滑動(dòng)燈具釋放桿。b.用手緊緊地握住燈具， 將燈具放入帶槽口的安裝座， 然后小心地向下滑動(dòng)燈具， 使其到位。關(guān)閉儀器前門。插上電源插頭并開啟7500 Instrument。打開ROI Inspector對(duì)話框:a.在 7500 Software 中，選擇 InstrumentfInstrument Maintenance Manager。b.在 Instrument Maintenance Manager 的 RO

21、I 選項(xiàng)卡中,單擊 Start Manual Calibration 。在 ROI Inspector 對(duì)話框中，選擇 Lamp Control f Idle。?當(dāng)儀器運(yùn)行時(shí)，通過檢查門上的縫隙觀察，確保燈具發(fā)光，然后單擊Done。應(yīng)看到燈九如果燈具發(fā)光，在 7500 Software 中選擇 InstrumentfLamp Status/Replacement,單擊 Reset LampTimer,然后單擊OK。如果燈具不發(fā)光，則替換的鹵素?zé)艨赡苡腥毕?。重新更換燈具。如果再 次更換燈具后仍不發(fā)光，檢查儀器的保險(xiǎn)絲是否存在故障（參閱第71頁）。?更換燈具后，按順序執(zhí)行以下校準(zhǔn)。請(qǐng)參閱：? 5.

22、4.1目標(biāo)區(qū)（ROI）校準(zhǔn)? 5.4.2背景校準(zhǔn)? 5.4.3光學(xué)校準(zhǔn)? 5.4.4染料校準(zhǔn)? 5.4.5驗(yàn)證儀器性能5.3.4.4 更換 7500 Instrument 保險(xiǎn)絲。保險(xiǎn)絲損壞時(shí)，更換 7500 Real-Time PCR Instrument保險(xiǎn)絲。（注意！為在長時(shí)間防止火災(zāi), 更換保險(xiǎn)絲時(shí)請(qǐng)使用類型和額定值與儀器原始保險(xiǎn)絲相同的經(jīng)認(rèn)可的保險(xiǎn)絲。）全程戴上一次性無粉手套操作。關(guān)閉儀器電源，并拔下電源插頭。將每一個(gè)保險(xiǎn)絲從其保險(xiǎn)絲座中取出，然后檢查是否損壞。損壞的保險(xiǎn)絲部通常有炭黑覆蓋。使用12.5A、250V、5X 20mm保險(xiǎn)絲更換損壞的保險(xiǎn)絲。注：電壓和電流額定值見保險(xiǎn)絲座

23、。安裝保險(xiǎn)絲座。插上電源插頭，然后開啟儀器。如果儀器接通了電源，說明保險(xiǎn)絲已安裝成功。注：保險(xiǎn)絲損壞可能是由儀器供電電源波動(dòng)導(dǎo)致。為了防止繼續(xù)出現(xiàn)故障，可以考慮安裝電氣保護(hù)設(shè)備，例如 UPS或其他電涌保護(hù)器。5.3.4.5 更新 Windows?操作系統(tǒng)。5.3.4.6 更新 7500 Software。5.3.4.7 監(jiān)控儀器狀態(tài)（使用 Function Test對(duì)話框又主要7500 Instrument組件執(zhí)行高級(jí)診斷。一般情況下 不需要執(zhí)行功能測試，除非懷疑有硬件故障，或者 Life Technologies代表指示這樣做。） 在 7500 Software 中，選擇 Instrumen

24、t fFunction-Test。根據(jù)需要執(zhí)行功能測試。要測試：所有組件-單擊 All Tests ,然后等候軟件執(zhí)行所有功能測試。一個(gè)或多個(gè)特定組件-單擊以下其中一項(xiàng)或多項(xiàng)。? USB-測試 7500 Real-Time PCR Instrument和計(jì)算機(jī)之間的通用串行總線（USB）連接。如果7500 Software能夠和7500 Real-Time PCR Instrument建立通信，則表示測試通過。? CCD -測試7500 Real-Time PCR Instrument的CCD攝像機(jī)。如果攝像機(jī)能夠拍攝圖像， 則表示測試通過。? Filter Wheel -測試7500 Rea

25、l-Time PCR Instrument的過濾輪。如果過濾輪控制器運(yùn)行正 確版本的固件，則表示測試通過。? Shutter-測試7500 Real-Time PCR Instrument的光學(xué)快門。如果快門控制器運(yùn)行正確版 本的固件，則表示測試通過。? Lamp-測試7500 Real-Time PCR Instrument的鹵素?zé)?。如果燈具控制器運(yùn)行正確版本的 固件，則表示測試通過。? Thermal Cycler -測試7500 Real-Time PCR Instrument的熱循環(huán)儀樣本塊。如果熱循環(huán)儀 的控制器運(yùn)行正確版本的固件，則表示測試通過。當(dāng)7500 Software完成一項(xiàng)

26、測試時(shí)，軟件報(bào)告該測試的通過/失敗狀態(tài)，并提供結(jié)果描述。rFunction TestTestPass/FaiiDescriptionUSB _-1Pass|USB check passed.CCDPass|CCD check passedFiler VWioolPass|Filter Wheel check passelShutterPass|Sh utter passed.LaiTipPass|Lamp check passed.Thermo Cycler禺:PassPassThermo CyclercheckpassedClose結(jié)束測試時(shí)，單擊Close。5.4 儀器校準(zhǔn)5.4.1 目標(biāo)

27、區(qū)（ROI）校準(zhǔn)5.4.1.1 全程戴上一次性無粉手套操作。5.4.1.2 從貯存在冷凍柜的光譜校準(zhǔn)套件中取出ROI校準(zhǔn)反應(yīng)板。5.4.1.3 讓ROI校準(zhǔn)反應(yīng)板溫度上升至室溫度（約需 5分鐘）。在立即運(yùn)行反應(yīng)板之前，不要從包裝袋取 出ROI校準(zhǔn)反應(yīng)板。反應(yīng)孔中的熒光染料具有光敏感特性。長時(shí)間曝光可降低染料在反應(yīng)板中 的熒光。5.4.1.4 從包裝袋中取出 ROI校準(zhǔn)反應(yīng)板。將光學(xué)薄膜留在反應(yīng)板上。不要丟棄存放 ROI校準(zhǔn)反應(yīng)板的包裝袋。若貯存于原始包袋中，反應(yīng)板最多可重復(fù)使用三次。5.4.1.5 振蕩ROI校準(zhǔn)反應(yīng)板5秒鐘。5.4.1.6 用板式離心機(jī)將反應(yīng)板離心2分鐘。ROI校準(zhǔn)反應(yīng)板必須

28、充分混合并離心。5.4.1.7 確認(rèn)ROI校準(zhǔn)反應(yīng)板每個(gè)反應(yīng)孔中的液體均位于反應(yīng)孔底部。如果不是，則以更高的轉(zhuǎn)速及更長的時(shí)間離心反應(yīng)板。5.4.1.8 按壓托盤門，將其打開。將反應(yīng)板裝入儀器中的反應(yīng)板架。確保放置時(shí)反應(yīng)板在反應(yīng)孔板適配器 中被正確對(duì)齊。（裝入標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)板，使 A12凹口位置位于托盤的右上角。）5.4.1.9 以一定角度向托盤右側(cè)施加壓力，從而關(guān)閉托盤門。5.4.1.10 執(zhí)行自動(dòng)ROI校準(zhǔn)在 7500 Software 中，選擇 Instrument fInstrument Maintenance Manager。在 Instrument Maintenance Manager

29、的 ROI 選項(xiàng)卡中，單擊 Start Calibration o按照向?qū)У闹甘荆瓿尚?zhǔn)。ROI Calibration對(duì)話框顯示三個(gè)選項(xiàng)卡：? Setup-顯示ROI校準(zhǔn)設(shè)置說明。單擊 Next提示可以打開 Run選項(xiàng)卡。? Run-單擊START RUN可以開始校準(zhǔn)流程并顯示處理消息。單擊 Next提示可以打開Analysis選項(xiàng)卡。? Analysis 一指明校準(zhǔn)狀態(tài)（Passed/Failed）。如果校準(zhǔn)失敗，請(qǐng)參閱5.4.1.13 "排除ROI校準(zhǔn)故障”。5.4.1.11 執(zhí)行手動(dòng)ROI校準(zhǔn)在 7500 Software 中，選擇 Instrument fInstrume

30、nt Maintenance Manager。在 Instrument Maintenance Manager 的 ROI 選項(xiàng)卡中,單擊 Start Manual Calibration 。在ROI Inspector對(duì)話框中（如圖 1）:a.在 Exposure Time 字段中，輸入 2048。b.選才i Filter A （濾光器1）。圖1單擊Snapshot,生成一 ROI圖像。確定ROI圖像是否可接受（下圖所示為未飽和以及過飽和的圖像）?？山邮軋D像中的反應(yīng)孔:?在不過飽和的前提下，必須盡可能明亮。（生成ROI校準(zhǔn)時(shí)，如果反應(yīng)孔過飽和，則顯小余口。）?可以含有但不是必須含有紅色像素（

31、表示飽和）。未飽和正常飽和過度飽和如果ROI圖像可接受，轉(zhuǎn)至步驟。如果 ROI圖像過飽和，將 Exposure Time降低一半，然后單擊Snapshot。重復(fù)執(zhí)行，直至獲得可接受的ROI圖像。如果無法獲得可接受的圖像，請(qǐng)參閱5.4.1.13 "排除ROI校準(zhǔn)故障”。單擊Generate Calibration。7500 Software采集一截圖，然后顯示一個(gè)消息框或ROI圖像:如果軟件顯示:7500 *2.0The iroage is over exposed and cannot be used to calbrate the instrumertt. Ple-ase redu

32、ce the exposure tine arwd try wgmin.執(zhí)行：a.單擊OK。b.將 Exposure Time 降低一半（參閱5.4.1.11步驟a）。c.重復(fù)步驟和。7500 v2.0Inage ejcpceure 旭 too low for valid calibration, poFble caiKes!(1) Low expose e(2) Missing cjlibrfltiori pl趾性(3) Lamp is off or burned out(4) Shutter Is closedThe calibration process willi not contin

33、ue with the current imge.Pltase increase the exposure time end try again.注：在所有反應(yīng)孔周圍出現(xiàn)綠色圓圈，表示反應(yīng)孔成功校準(zhǔn)。注：綠色圓圈表示反應(yīng)孔位置的目標(biāo)區(qū)已足夠亮。為96。ROI圖像非常模糊或者無法成功校準(zhǔn)。請(qǐng)參閱5.4.1.13 "排除ROI校準(zhǔn)故障”。驗(yàn)證以下各項(xiàng):可接受的校準(zhǔn)圖像? Wells Found 值為 96。|加1，七1第IEFl'er Af cuI聲闌Ie明則 1理Wsk 向51fd共Enapdbar自3自 CtidliLiri箏iW 甯 Calbigt'cn成功校準(zhǔn)-W

34、ells Found必須?在ROI圖像上每個(gè)反應(yīng)孔區(qū)的周圍顯示綠色圓圈。單擊 Save Calibration。軟件保存濾光器 1新產(chǎn)生的 ROI校準(zhǔn)。在 ROI Inspector的Filter Masks Loaded區(qū)域，"OK" 出現(xiàn)在濾光器1旁邊。當(dāng)所有濾光器的對(duì)其余濾光器重復(fù)步驟至，對(duì)每個(gè)濾光器執(zhí)行校準(zhǔn)之前，將 Exposure Time重置為2048。 當(dāng)所有濾光器的 Filter Masks Loaded都顯示 OK時(shí)，ROI校準(zhǔn)完成。Filter Masks Loaded都是 OK時(shí),校準(zhǔn)完成。點(diǎn)擊Done。5.4.1.12拆卸反應(yīng)板（注意！灼熱。儀器工作

35、期間，樣本塊溫度可能超過100。Co若剛使用過儀器，在樣本塊恢復(fù)至室溫之前，請(qǐng)勿觸摸樣本塊。）取出校準(zhǔn)反應(yīng)板：a.按壓托盤門，將其打開。b.取出校準(zhǔn)反應(yīng)板。c.按壓托盤門，將其關(guān)閉。將校準(zhǔn)反應(yīng)板放入其包裝套中。如果要執(zhí)行背景和光學(xué)校準(zhǔn)：a.在接下來的8小時(shí)，將ROI校準(zhǔn)反應(yīng)板置于室溫下。光學(xué)校準(zhǔn)使用ROI校準(zhǔn)反應(yīng)板。b.第二天將放入包裝套的反應(yīng)板放回貯存在冷凍柜的光譜校準(zhǔn)套件中。c.重要！不要丟棄校準(zhǔn)反應(yīng)板。如果將反應(yīng)板裝在其原始包裝套貯存，在打開其包裝后最多可重復(fù)使用反應(yīng)板 3次。d.重要！執(zhí)行ROI校準(zhǔn)后，也必須執(zhí)行背景校準(zhǔn)、光學(xué)校準(zhǔn)、染料校準(zhǔn)以及儀器驗(yàn)證。5.4.1.13排除ROI校準(zhǔn)故

36、障問題/癥狀可能原因行動(dòng)ROI校準(zhǔn)失敗樣本塊可能位于降1 .如果 ROI Inspector 的 CCD Control/Settings 顯示“Block Up ",ROI圖像模糊低的位置。則單擊Block Up將樣本塊升高單擊2 .檢查確認(rèn)受熱的蓋組件已被全程向前拉出，以確保托盤可以被正確推入。如果7500 Instrument安裝了受熱蓋栓， 檢查確認(rèn)蓋栓處于鎖定位置。3.如果ROI校準(zhǔn)仍然失敗，檢查7500 Instrument的鹵素?zé)魻顟B(tài)（參閱5.3.3.1 “監(jiān)控?zé)艟郀顟B(tài)”），然后，如果需要時(shí)，更換燈具（參閱5.3.4.3 “更換鹵素?zé)簟保?.4.2背景校準(zhǔn)1.1.1.

37、1 全程戴上一次性無粉手套操作。1.1.1.2 從貯存在冷凍柜的光譜校準(zhǔn)套件中取出準(zhǔn)備好的背景反應(yīng)板。1.1.1.3 讓背景反應(yīng)板溫度上升至室溫（至少需要5分鐘）。1.1.1.4 從包裝袋中取出背景反應(yīng)板。（重要！不要丟棄存放反應(yīng)板的包裝袋。若將背景反應(yīng)板貯存在其原始包裝套，背景反應(yīng)板最多可重復(fù)使用三次。）1.1.1.5 振蕩反應(yīng)板5秒鐘。1.1.1.6 用板式離心機(jī)將反應(yīng)板離心2分鐘。反應(yīng)板必須充分混合并離心。確認(rèn)反應(yīng)板每個(gè)背景反應(yīng)孔中的液體均位于反應(yīng)孔底部。如果不是，則以更長的時(shí)間離心反應(yīng)板。1.1.1.7 按壓托盤門，將其打開。將反應(yīng)板裝入儀器中的反應(yīng)板架。確保放置時(shí)反應(yīng)板在反應(yīng)孔板適配

38、器中被正確對(duì)齊。以一定角度向托盤右側(cè)施加壓力，從而關(guān)閉托盤門。（注：如果無法打開托盤，樣本塊可能位于其“升高”位置，鎖定了托盤門位置。要降低樣本塊，選才i Instrument-Calibrate, 然后退出 ROI Inspector。）1.1.1.8 在 7500 Software 中，選擇 InstrumentfInstrument Maintenance Manager。在 Instrument Maintenance Manager 中，選擇 Background 選項(xiàng)卡。在 Background 選項(xiàng)卡中，單擊 Start Calibration o1.1.1.9 按照向?qū)У闹甘荆?/p>

39、完成校準(zhǔn)。 Background Calibration對(duì)話框顯示四個(gè)選項(xiàng)卡：? Overview -顯示校準(zhǔn)相關(guān)信息。? Setup-顯示背景校準(zhǔn)設(shè)置說明。單擊Next提示可以打開 Run選項(xiàng)卡。? Run-單擊START RUN可以開始校準(zhǔn)流程并顯示處理消息。單擊Next提示可以打開 Analysis選項(xiàng)卡。? Analysis -指明校準(zhǔn)狀態(tài)（Passed/Failed）。如果校準(zhǔn)失敗，請(qǐng)參閱5.4.2.12 “排除背景校準(zhǔn)故障”。注：開始校準(zhǔn)之前，儀器可能暫停一段時(shí)間（最多可達(dá)10分鐘），以允許受熱的護(hù)蓋達(dá)到正確溫度。1.1.1.10 校準(zhǔn)完成后，取出校準(zhǔn)反應(yīng)板：按壓托盤門，將其打開。

40、取出校準(zhǔn)反應(yīng)板。按壓托盤門，使其滑入儀器。1.1.1.11 將校準(zhǔn)反應(yīng)板放入其包裝套，并將包裝好的反應(yīng)板放回冷凍柜的光譜校準(zhǔn)套件中。（重要！不要丟棄校準(zhǔn)反應(yīng)板。如果將反應(yīng)板裝在其原始包裝套貯存，在初次打開其包裝后最多可重復(fù)使用反應(yīng)板3次。）1.1.1.12 排除背景校準(zhǔn)故障問題/癥狀可能原因行動(dòng)背景校準(zhǔn)失敗1背景反應(yīng)板上的一個(gè)或多1.使用相同的背景反應(yīng)板重復(fù)執(zhí)行校準(zhǔn)。個(gè)反應(yīng)孔產(chǎn)生的光譜超過2.若校準(zhǔn)再次失敗，請(qǐng)使用另一不同的背景反二|1儀器的最高限度。1應(yīng)板重復(fù)執(zhí)行校準(zhǔn)。3.若校準(zhǔn)再次失敗，請(qǐng)按下文“如何確定污染” 的說明，確定污染源。J1.1.1.13 如何確定污染若信號(hào)超過正常背景熒光的限

41、度，則表明校準(zhǔn)反應(yīng)板或樣本塊上存在熒光污染物。常見污染物包括記號(hào)筆中殘存的油墨、一次性手套灑落的粉末及灰塵。欲確定污染來源和位置： 在查看原始數(shù)據(jù)時(shí)，選擇反應(yīng)板布局中數(shù)塊連續(xù)的較小區(qū)域，以找出受污染反應(yīng)孔 的位置。將背景反應(yīng)板旋轉(zhuǎn)180。，然后再次執(zhí)行背景校準(zhǔn)。重復(fù)步驟以找出污染物的位置。如果步驟和中找到的包含污染物的反應(yīng)孔位置：?相同-則表明樣本塊中含有污染物。請(qǐng)按照“5.3.4.1樣本塊污染清除”的說明，除去樣本塊中的污染物。?相反-則表明背景反應(yīng)板中含有污染物。丟棄當(dāng)前使用的背景反應(yīng)板，并使用新背景反應(yīng) 板執(zhí)行背景校準(zhǔn)程序。如果更換背景反應(yīng)板并且取出樣本塊的污染后校準(zhǔn)失敗：將用黑紙覆蓋白

42、反應(yīng)板裝入7500 Instrument。按照本章的說明，執(zhí)行背景校準(zhǔn)程序。校準(zhǔn)完成后，選擇反應(yīng)板布局中的所有反應(yīng)孔。查看光譜圖譜中的峰值。如果峰值：?可見-則表明7500 Instrument的光學(xué)部件可能已被污染。請(qǐng)與生產(chǎn)商聯(lián)系。?不存在-則表明樣本塊已被污染。請(qǐng)按照“5.3.4.1樣本塊污染清除”的說明，除去樣本塊中的污染物。5.4.3 光學(xué)校準(zhǔn)5.4.3.1 全程戴上一次性無粉手套操作。5.4.3.2 從貯存在冷凍柜的光譜校準(zhǔn)套件中取出ROI校準(zhǔn)反應(yīng)板。5.4.3.3 讓ROI校準(zhǔn)反應(yīng)板溫度上升至室溫（至少需要5分鐘）。5.4.3.4 從包裝袋中取出 ROI校準(zhǔn)反應(yīng)板，振蕩反應(yīng)板5秒鐘

43、。（重要！不要丟棄存放反應(yīng)板的包裝袋。若將ROI校準(zhǔn)反應(yīng)板貯存在其原始包裝套，ROI校準(zhǔn)反應(yīng)板最多可重復(fù)使用三次。）（如果執(zhí)行ROI校準(zhǔn)后，將ROI校準(zhǔn)反應(yīng)板保持在室溫，則跳到步驟5.435,以減少在反應(yīng)板在室溫時(shí)形成的冷凝。如果ROI校準(zhǔn)反應(yīng)板位于冷凍柜中，轉(zhuǎn)至步驟5.432。5.4.3.5 用板式離心機(jī)將反應(yīng)板離心2分鐘。ROI校準(zhǔn)反應(yīng)板必須充分混合并離心。確認(rèn) ROI校準(zhǔn)反應(yīng)板每個(gè)反應(yīng)孔中的液體均位于反應(yīng)孔底部。如果不是，則以更長的時(shí)間離心反應(yīng)板。5.4.3.6 按壓托盤門，將其打開。將反應(yīng)板裝入儀器中的反應(yīng)板架。確保放置時(shí)反應(yīng)板在反應(yīng)孔板適配器 中被正確對(duì)齊。以一定角度向托盤右側(cè)施加壓

44、力，從而關(guān)閉托盤門。5.4.3.7 在 7500 Software 中，選擇 InstrumentfInstrument Maintenance Manager。在 Instrument Maintenance Manager 中，選擇 Optical 選項(xiàng)卡。在 Optical 選項(xiàng)卡中，單擊 Start Calibration o5.4.3.8 按照向?qū)У闹甘荆瓿尚?zhǔn)。Optical Calibration對(duì)話框顯示四個(gè)選項(xiàng)卡：? Overview -顯示校準(zhǔn)相關(guān)信息。? Setup -顯示光學(xué)校準(zhǔn)設(shè)置說明。單擊 Next提示可以打開 Run選項(xiàng)卡。? Run-單擊START RUN可以

45、開始校準(zhǔn)流程并顯示處理消息。單擊Next提示可以打開 Analysis選項(xiàng)卡。? Analysis -指明校準(zhǔn)狀態(tài)（Passed/Failed）。如果校準(zhǔn)失敗，請(qǐng)參閱 5.4.2.12 “排除背景校準(zhǔn)故障”。注：開始校準(zhǔn)之前，儀器可能暫停一段時(shí)間（最多可達(dá)10分鐘），以允許受熱的護(hù)蓋達(dá)到正確溫度。5.4.3.9 取出校準(zhǔn)反應(yīng)板：按壓托盤門，將其打開。取出校準(zhǔn)反應(yīng)板。按壓托盤門，使其滑入儀器。5.4.3.10 將校準(zhǔn)反應(yīng)板放入其包裝套中。將放入包裝套的反應(yīng)板放回貯存在冷凍柜的光譜校準(zhǔn)套件中。（重要！不要丟棄校準(zhǔn)反應(yīng)板。如果將反應(yīng)板裝在其原始包裝套貯存，在打開其包裝后最多可重復(fù)使用反應(yīng)板3次。）5

46、.4.4 染料校準(zhǔn)5.4.4.1 全程戴上一次性無粉手套操作。5.4.4.2 從冷凍柜中取出光譜校準(zhǔn)套件，并從套件取出所有染料反應(yīng)板。5.4.4.3 將光譜校準(zhǔn)套件放回冷凍柜貯藏。5.4.4.4 讓染料反應(yīng)板溫度上升至室溫度（約需 5分鐘）。（重要！在立即運(yùn)行之前，請(qǐng)勿從包裝袋取出染料反應(yīng)板。在每個(gè)染料反應(yīng)板上，反應(yīng)孔中的熒光染料具有光敏感特性。長時(shí)間暴露在光線中會(huì)降低反應(yīng)板的熒光信號(hào)強(qiáng)度。）注：如果將7500 Real-Time PCR Instrument染料反應(yīng)板貯存在其原始包裝并放在冷凍柜中，則在打開包裝后 6個(gè)月可以校準(zhǔn) 7500 Real-Time PCR Instrument最多

47、3次。5.4.4.5 在 7500 Software 中，選擇 InstrumentfInstrument Maintenance Manager。在 Instrument Maintenance Manager 中，選擇 Dye 選項(xiàng)卡。在 Dye 屏幕上，選擇 System Dye Calibration。單擊 Start Calibration。5.4.4.6 按照向?qū)У闹甘荆瓿擅總€(gè)反應(yīng)板的校準(zhǔn)。（重要！在每個(gè)校準(zhǔn)中，向?qū)为?dú)指示。必須獨(dú)立設(shè)置、運(yùn)行和分析每個(gè)染料反應(yīng)板。）Dye Calibration對(duì)話框顯示四個(gè)選項(xiàng)卡：? Overview -顯示校準(zhǔn)相關(guān)信息。當(dāng)軟件提示獲取需要

48、的材料時(shí)，選擇要校準(zhǔn)的染料。? Setup-顯示染料校準(zhǔn)設(shè)置說明。單擊Next提示可以打開 Run選項(xiàng)卡。當(dāng)軟件提示裝入染料反應(yīng)板時(shí)，按照步驟 5.4.4.10所述準(zhǔn)備并裝載反應(yīng)板。? Run-單擊START RUN可以開始校準(zhǔn)流程并顯示處理消息。單擊Next提示可以打開 Analysis 選項(xiàng)卡。? Analysis -指明校準(zhǔn)狀態(tài)（Passed/Failed）。當(dāng)軟件提示分析從每個(gè)染料反應(yīng)板采集的光譜時(shí)， 核實(shí)校準(zhǔn)的狀態(tài)：? Passed 7500 Instrument 校準(zhǔn)通過。轉(zhuǎn)到步驟 5.4.4.11 的。? Failed - 7500 Instrument校準(zhǔn)失敗。請(qǐng)參閱 5.4.

49、4.15 “排除染料校準(zhǔn)故障”。注：開始校準(zhǔn)之前，儀器可能暫停一段時(shí)間（最多可達(dá)10分鐘），以允許受熱的護(hù)蓋達(dá)到正確溫度。5.4.4.7 將軟件所需的染料反應(yīng)板從其包裝中取出。振蕩反應(yīng)板5秒鐘。（重要！不要丟棄存放反應(yīng)板的包裝袋。若貯存于原包袋中，反應(yīng)板最多可重復(fù)使用3次。5.4.4.8 用板式離心機(jī)將反應(yīng)板離心2分鐘。反應(yīng)板必須充分混合并離心。確認(rèn)反應(yīng)板每個(gè)背景反應(yīng)孔中的液體均位于反應(yīng)孔底部。如果不是，則以更長的時(shí)間離心反應(yīng)板。5.4.4.9 檢查并確保要裝入的染料反應(yīng)板與在7500 Software中選取的熒光匹配。5.4.4.10 按壓托盤門，將其打開。將反應(yīng)板裝入儀器中的反應(yīng)板架。確保

50、放置時(shí)反應(yīng)板在反應(yīng)孔板適配器中被正確對(duì)齊。關(guān)閉托盤門。以一定角度向托盤右側(cè)施加壓力。（注：如果無法打開托盤，樣本塊可能位于其“升高”位置，鎖定了托盤位置。要降低樣本塊，選才i Instrument-Calibrate, 然后退出 ROI Inspector o）5.4.4.11 因?yàn)橄驅(qū)?duì)每個(gè)染料校準(zhǔn)單獨(dú)提供指示，所以請(qǐng)對(duì)校準(zhǔn)的每個(gè)染料執(zhí)行以下程序。驗(yàn)證校準(zhǔn)狀態(tài)：? Passed- 7500 Instrument 校準(zhǔn)通過。轉(zhuǎn)至U b）。? Failed - 7500 Instrument校準(zhǔn)失敗。請(qǐng)參閱 5.4.4.15 “排除染料校準(zhǔn)故障”核實(shí)染料光譜的分組：a.在反應(yīng)板布局中，選擇反應(yīng)板

51、的孔。b.檢查原始數(shù)據(jù)。對(duì)于每個(gè)光譜，請(qǐng)確認(rèn)峰值：? 位于7500 Instrument的可檢測圍。?無不規(guī)格光譜峰值。?出現(xiàn)在染料的正確通道上。如果某光譜不符合上述標(biāo)準(zhǔn)，請(qǐng)參閱5.4.4.15 “排除染料校準(zhǔn)故障”。注：在含有相同染料的各反應(yīng)孔中，光譜位置和峰值位置的差異是由于不同反應(yīng)孔之間的光學(xué)屬性及激發(fā)能存在細(xì)微差異而引起的。若所有光譜均可接受，則單擊 Next。5.4.4.12 取出校準(zhǔn)反應(yīng)板：（注意！ 灼熱。儀器工作期間，樣本塊溫度可能超過100。Co若剛使用過儀器，在樣本塊恢復(fù)至室溫之前，請(qǐng)勿觸摸樣本塊。）按壓托盤門，將其打開。取出校準(zhǔn)反應(yīng)板。按壓托盤門，將其關(guān)閉。將校準(zhǔn)反應(yīng)板放入

52、其包裝套中。將放入包裝套的反應(yīng)板放回貯存在冷凍柜的光譜校準(zhǔn)套件中。（注：如果將7500 Real-Time PCR Instrument染料反應(yīng)板貯存在其原始包裝并放在冷凍柜中，則在打開包裝后 6個(gè)月可以校準(zhǔn) 7500 Real-Time PCR Instrument最多3次。）5.4.4.13 在按照指示將染料反應(yīng)板取出后，單擊 Finish。5.4.4.14 按照5.4.4.1開始操作，準(zhǔn)備并運(yùn)行下一個(gè)反應(yīng)板。染料/光譜濾光器 峰值（nm）-550JOE染料VIC染料5.4.4.15排除染料校準(zhǔn)故障問題/癥狀可能原因行動(dòng)1個(gè)或多個(gè)原始光1 譜達(dá)到或低于校準(zhǔn)?光譜校準(zhǔn)反應(yīng)板未充分離 心。1.

53、卸載7500 Instrument并查看光譜校準(zhǔn)反應(yīng)板的反應(yīng)孔。若反應(yīng)孔中的液體不是：的可檢測閾值。J?光譜校準(zhǔn)反應(yīng)板含有舊試劑-位于反應(yīng)孔底部，請(qǐng)將反應(yīng)板離心更長時(shí)間，或試劑體積不足。然后重復(fù)執(zhí)行校準(zhǔn)。?若止運(yùn)行定制光譜校準(zhǔn)反應(yīng)-體積相等，則表明反應(yīng)板未密封致使試劑揮|板，染料可能濃度不足。汝。請(qǐng)將其丟棄，并運(yùn)行另一反應(yīng)板。2.若光譜校準(zhǔn)反應(yīng)板顯示正常，則丟棄該反應(yīng)板并運(yùn)行另一塊反應(yīng)板。3.如果問題依然存在，請(qǐng)與生產(chǎn)商聯(lián)系。二1注：若止運(yùn)行定制光譜校準(zhǔn)反應(yīng)板，請(qǐng)創(chuàng)建另一反應(yīng)板但要增加產(chǎn)生不足信號(hào)的染料的濃度。1個(gè)或多個(gè)原始光?樣本塊或光譜校準(zhǔn)反應(yīng)板含請(qǐng)按照5.4.2 “背景校準(zhǔn)”操作，以確認(rèn)

54、是否存在譜超過 7500有熒光污染物。污染物。若背景校準(zhǔn)未顯示樣本塊含有污染物，則Instrument 的最高?若止運(yùn)行定制光譜校準(zhǔn)反應(yīng)光譜校準(zhǔn)反應(yīng)板可能含有污染物。限量。板，染料可能濃度過大。光譜在一個(gè)以上的；回本塊或光譜校準(zhǔn)反應(yīng)板含注：若止運(yùn)行定制光譜校準(zhǔn)反應(yīng)板，請(qǐng)創(chuàng)建另一反濾光器中含有峰有熒光污染物。_|應(yīng)板但要降低超過可檢測限量的染料的濃度。值。5.4.5 驗(yàn)證儀器性能5.4.5.1 全程戴上一次性無粉手套操作。5.4.5.2 冷凍柜中取出 TaqMan ? RNase P 96-Well Instrument Verification Plate ,然后讓反應(yīng)板溫度上升到室溫（大約需要5分鐘）。5.4.5.3 從包裝袋中取出 RNase P反應(yīng)板。振蕩反應(yīng)板 5秒鐘。5.4.5.4 用板式離心機(jī)將反應(yīng)板離心2分鐘。反應(yīng)板必須充分混合并離心。確認(rèn)液體位于反應(yīng)板每個(gè)反應(yīng)孔底部。如果不是，則再次以更長的時(shí)間離心反應(yīng)板。（重要！注意不要讓 RNase P反應(yīng)板的底部染上塵污。反應(yīng)板底部沾上的液體和其它污染物可污染樣品區(qū)組，導(dǎo)