抗生素微生物檢定標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

1、抗生素微生物檢定標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程1 簡(jiǎn)述抗生素微生物檢定法系在適宜條件下，通過(guò)檢測(cè)抗生素對(duì)微生物的抑制作用，計(jì)算抗生素活性（效價(jià)）的方法。依試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理不同，可分為稀釋法、比濁法和瓊脂擴(kuò)散法。后二者被列為抗生素微生物檢定的國(guó)際通用方法。中國(guó)藥典也采用這兩種方法?？股匚⑸餀z定管碟測(cè)定法系瓊脂擴(kuò)散法，是利用抗生素在攤布特定試驗(yàn)菌的固體培養(yǎng)基內(nèi)成球面形擴(kuò)散，形成含一定濃度抗生素球形區(qū)，抑制了試驗(yàn)菌的繁殖而呈現(xiàn)出透明的抑菌圈。此法系根據(jù)抗生素在一定濃度范圍內(nèi)，對(duì)數(shù)劑量與抑菌圈直徑（面積）呈直線關(guān)系而設(shè)計(jì)，通過(guò)檢測(cè)抗生素對(duì)微生物的抑制作用，比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品產(chǎn)生抑菌圈的大小，計(jì)算出供試品的效價(jià)?？股匚?/p>

2、生物比濁法是將一定量的抗生素加至接種有試驗(yàn)菌的液體培養(yǎng)基內(nèi)，混均后，經(jīng)培養(yǎng)，測(cè)量培養(yǎng)基濁度。此法系根據(jù)抗生素在一定的濃度范圍內(nèi)，其濃度或濃度的數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換值與試驗(yàn)菌生長(zhǎng)產(chǎn)生的濁度（濁度與細(xì)菌群體質(zhì)量及細(xì)菌細(xì)胞容積的增加之間存在直接關(guān)系）之間存在線性關(guān)系而設(shè)計(jì)，通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)后細(xì)菌濁度值的大小，比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品對(duì)試驗(yàn)菌生長(zhǎng)抑制的程度，計(jì)算出供試品的效價(jià)?？股匦r(jià)以“單位（u）”或“微克（µg）”表示。抗生素管碟測(cè)定法2 儀器與用具2.1 操作室 光線明亮，操作室應(yīng)分為兩部分，彼此分開(kāi)，其中一部分為一般操作室，一部分為半無(wú)菌操作室。半無(wú)菌操作室應(yīng)設(shè)有紫外線滅菌燈，并附設(shè)空氣凈化（空氣凈化級(jí)

3、別為100級(jí)10，000級(jí)）及空調(diào)設(shè)備，控制室溫在2025之間，達(dá)到無(wú)菌或半無(wú)菌狀態(tài)。操作臺(tái)應(yīng)穩(wěn)固，臺(tái)面用玻璃板，并用水平儀調(diào)節(jié)至水平。注意操作，避免室內(nèi)抗生素污染。2.2 雙碟 內(nèi)徑約90mm，高1617mm硬質(zhì)玻璃或塑料培養(yǎng)平皿，碟底厚薄均勻，水平透明，無(wú)色斑氣泡。碟底平度檢查，可將雙碟放在水平臺(tái)上，下墊一張白紙，碟內(nèi)加水23ml，再滴加藍(lán)墨水，觀察藍(lán)色深淺是否一致。用過(guò)的雙碟經(jīng)高壓滅菌倒出培養(yǎng)基后，置清洗液中浸泡過(guò)夜，沖洗，瀝干，至150160干熱滅菌2小時(shí)或高壓121蒸氣滅菌30分鐘，備用。2.3 陶瓦蓋 內(nèi)徑約103mm，外徑108mm，平坦，吸水性強(qiáng)，應(yīng)定期清洗、干燥或干熱滅菌。2

4、.4 鋼管 內(nèi)徑（6.0±0.1）mm，高（10.0±0.1）mm；外徑（8.0±0.1）mm或（7.8±0.1）mm，每套鋼管重量差異不超過(guò)±0.05g，內(nèi)外壁及兩端面光潔平坦，管壁厚薄一致。每次使用后應(yīng)置1:1000新潔爾溶液內(nèi)，浸泡2小時(shí)以上，滅菌后再洗滌，先用水洗滌，超聲波超聲30分鐘或用沾有去污粉的紗布條串擦內(nèi)外壁，水沖洗，瀝干，再用蒸餾水沖洗3次后，置帶蓋的容器內(nèi)，在150160干熱滅菌2小時(shí)，備用。2.5 鋼管放置器 有6孔和4孔兩種。放置于無(wú)菌或半無(wú)菌室的操作平臺(tái)上，鋼管下落時(shí)應(yīng)垂直平穩(wěn)、位置正確。雙碟升降平穩(wěn)。應(yīng)保持清潔，防止

5、抗生素污染?？啥ㄆ谟?5%乙醇棉擦拭落管筒及儲(chǔ)管杯。置鋼管的玻璃管應(yīng)定期干烤滅菌。2.6 恒溫培養(yǎng)箱 以隔水式為宜，溫度平穩(wěn)，波動(dòng)小。設(shè)置漂移溫度為3537或2426，依各品種要求而定，箱內(nèi)網(wǎng)狀隔板上放置帶孔的玻璃板并調(diào)整水平。2.7 滅菌刻度吸管 用于吸取菌液及培養(yǎng)基。使用后應(yīng)立即置5%石炭酸或1:1000新潔爾溶液中消毒后，再按玻璃容器的常規(guī)洗滌法洗滌。洗滌瀝干后在吸口處塞入脫脂棉（松動(dòng)，透氣），置適宜容器中，在120以上干熱滅菌2小時(shí)或121蒸氣滅菌30分鐘，烘干備用。2.8 玻璃容器 包括定量移液管、刻度吸管、容量瓶等，均應(yīng)符合“常用玻璃量器國(guó)家計(jì)量檢定規(guī)程”的規(guī)定。每次使用前用清潔液

6、浸泡，水沖洗，并用蒸餾水或去離子說(shuō)沖洗3次，瀝干。2.9 稱(chēng)量瓶 重量在10g以下。用畢先用水沖洗、瀝干，置清潔液浸泡2小時(shí)以上，然后分別用水、蒸餾水或去離子說(shuō)沖洗3次，置潔凈平皿中，在120干熱滅菌3小時(shí)，待冷至6070時(shí)，取出置于干燥中備用。2.10 滴管 用玻璃管拉制，管口光滑。使用前在清潔液浸泡，分別用水、蒸餾水后去離子水沖洗3次，置適宜容器中，在120干燥3小時(shí)后備用。2.11 天平 分析天平，精密度0.1mg，經(jīng)計(jì)量檢定。2.12 抑菌圈直徑（面積）測(cè)量?jī)x 應(yīng)符合“抑菌圈測(cè)量?jī)x檢定規(guī)程”的規(guī)定。2.13 游標(biāo)卡尺 精度0.05mm，長(zhǎng)度125mm。2.14 超凈工作臺(tái) 有效工作面局

7、部 潔凈度100級(jí)。用于試驗(yàn)菌的接種傳代或菌懸液制備。超凈工作臺(tái)須置潔凈工作室或半無(wú)菌室內(nèi)。3 試液 3.1 滅菌緩沖液 制備緩沖液的試劑應(yīng)為分析純，配制后的緩沖液應(yīng)澄明，分裝于玻璃容器內(nèi)，經(jīng)121蒸氣滅菌30分鐘備用。 磷酸鹽緩沖液（pH6.0） 取磷酸氫二鉀2g與磷酸二氫鉀8g，加水使成1000ml，濾過(guò)。 磷酸鹽緩沖液（pH7.0） 取磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）9.39g與磷酸二氫鉀3.5g，加水使成1000ml，濾過(guò)。 磷酸鹽緩沖液（pH7.8） 取磷酸氫二鉀5.59g與磷酸二氫鉀0.41g，加水使成1000ml，濾過(guò)。磷酸鹽緩沖液（pH10.5） 取磷酸氫二鉀

8、35g，加氫氧化鉀液，加水使成1000ml，濾過(guò)。4 培養(yǎng)基 配制培養(yǎng)基的各成分原料質(zhì)量對(duì)抑菌圈邊緣清晰度及試驗(yàn)結(jié)果影響較大，因此應(yīng)對(duì)原材料進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，挑選適當(dāng)?shù)钠放剖褂谩Ｖ瞥傻呐囵B(yǎng)基不應(yīng)有沉淀，如產(chǎn)生沉淀，可在配制培養(yǎng)基后，于115加熱20分鐘溶化，趁熱用紙漿減壓或適宜方法過(guò)濾，調(diào)整pH值，分裝滅菌備用。中國(guó)藥典2005年版二部附錄的抗生素生物檢定法中收載了13種不同處方的培養(yǎng)基及制備方法。目前，已有市售干燥培養(yǎng)基，使用方便。臨用時(shí)按照使用說(shuō)明進(jìn)行配制，但應(yīng)注意核對(duì)培養(yǎng)基的pH，必要時(shí)需調(diào)節(jié)pH，使其符合規(guī)定。另外，市售干燥培養(yǎng)基的質(zhì)量也存在差異，注意選擇合適的產(chǎn)品。5 試驗(yàn)菌5.1 菌種的

9、復(fù)蘇 檢定用標(biāo)準(zhǔn)菌種為冷凍干燥品，由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。 取凍干菌種管、滅菌1ml毛細(xì)滴管、雙碟、鑷子、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，移入接種室操作臺(tái)或超凈工作臺(tái)。 將凍干菌種管外壁用碘酒（碘狀）擦拭消毒，稍干，用75%乙醇棉球擦凈，放在滅菌雙碟內(nèi)，待干。點(diǎn)燃酒精燈，將菌種管的封口一端在火焰上燒灼紅熱，用滅菌毛細(xì)滴管吸取營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，滴在上述灼熱的菌種管封口端，使其驟冷炸裂。 取滅菌鑷子，在酒精燈火焰上方，將炸裂的管口打開(kāi)，放入滅菌雙碟內(nèi)，另取1支滅菌毛細(xì)滴管，在火焰旁吸取營(yíng)養(yǎng)肉湯少許，加至菌種管底部，將凍干菌塊攪動(dòng)是其溶解，隨即吸出管內(nèi)菌液，分別接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面及普通肉湯內(nèi)，并將

10、毛細(xì)滴管及菌種管投入消毒液內(nèi)，將已接種的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面置3537培養(yǎng)2224小時(shí)。 取出培養(yǎng)物，仔細(xì)觀察菌苔形態(tài)、有無(wú)雜菌，涂片并進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，如呈典型菌落，則轉(zhuǎn)種3代即可使用。菌落不典型時(shí)，可進(jìn)行平板分離單菌落。5.2 菌種的接種與保存 準(zhǔn)備需用的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基應(yīng)新鮮制備，如斜面已無(wú)冷凝水者，不宜再使用。在標(biāo)簽上注明菌名及接種日期。從冷藏箱中取出菌種斜面后，應(yīng)在室溫放置約30分鐘，待溫度平衡后再移入接種室或超凈工作臺(tái)。 點(diǎn)燃酒精燈或煤氣燈等，左手握住菌種斜面，將管口靠近火焰上方，右手拿接種棒后端，將接種環(huán)燒紅約30秒種，隨后將接種棒金屬部分在火焰上燒灼，往返通過(guò)3次。右手用無(wú)名指、小指及

11、掌部夾住管塞，左手將管口在火焰上旋轉(zhuǎn)燒灼，右手再輕輕拔開(kāi)管塞，將接種環(huán)伸入管內(nèi)先在近壁的瓊脂斜面上靠一下，稍冷卻再移至菌苔上，刮取少量菌苔，隨即取出接種棒，并將菌種管口移至火焰上方。塞上管塞，左手將菌種管放下，取營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面1支，照上述操作打開(kāi)管塞，將接種環(huán)伸入管內(nèi)至瓊脂斜面的底部，由底向上，將接種環(huán)輕貼斜面的表面曲折蛇形移動(dòng)，使細(xì)菌接種在斜面的表面上。 取出接種環(huán)，在火焰上方將培養(yǎng)基管蓋上塞子，然后將接種過(guò)細(xì)菌的接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌。 將已接種的細(xì)菌管置3537培養(yǎng)2224小時(shí)，霉菌管一般置2425霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7天。培養(yǎng)后放入4冷藏箱內(nèi)保存，一般13個(gè)月轉(zhuǎn)種一次。5.3 菌懸液的制備

12、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis CMCC（B）63 501懸液 取枯草芽孢桿菌工作用菌種營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，加滅菌水12ml將菌苔洗下，制成懸液，用吸管將此懸液接種至盛有營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的扁培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，均勻攤布，在3537培養(yǎng)7天。取菌苔少許涂片，革蘭氏染色鏡檢，應(yīng)有芽孢85%以上，用滅菌水10ml將芽孢洗下，制成芽孢懸液，合并至滅菌大試管內(nèi)，在65水浴中加熱30分鐘將菌體殺死，待冷后置4冷藏箱貯藏。此菌液為濃菌液。日常試驗(yàn)用菌液 取上述濃溶液，用滅菌水1:3稀釋至滅菌試管中，冷藏箱保存?zhèn)溆谩?短小芽孢桿菌Bacillus subtilis CMCC（B）63 202懸液 取短小芽

13、孢桿菌工作用菌種營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，照上述方法制備芽孢懸液。 金黃色葡萄球菌Staphylococus aureusCMCC（B）26 003懸液 取金黃色葡萄球菌工作用菌種營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，用接種環(huán)取菌苔少許接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上，在3537培養(yǎng)2224小時(shí)，臨用時(shí)，用滅菌水將菌苔洗下，制成懸液。置4冷藏箱保存，可使用3天。 藤黃微球菌Micrococcus luteus CMCC（B）28 001懸液 取藤黃微球菌工作用菌種營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，用1ml培養(yǎng)基將菌苔洗下，用吸管移至盛有營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的扁培養(yǎng)瓶中，均勻攤布，將培養(yǎng)瓶倒置于培養(yǎng)箱中2627培養(yǎng)24小時(shí)取出，用吸管吸取培養(yǎng)基或0.

14、9%滅菌氯化鈉溶液5ml至培養(yǎng)瓶中，將菌苔洗下，合并菌液至滅菌大試管中備用。置4冰箱中保存，可使用12個(gè)月。 大腸桿菌Eschehchia coli CMCC（B）44 103懸液 取大腸桿菌工作用菌種營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，照金黃色葡萄球菌菌懸液項(xiàng)下的方法制備菌懸液，供當(dāng)日使用。 肺炎克雷伯氏菌Klebosiella pneumoniae CMCC（B）46 117懸液 取肺炎克雷伯氏菌工作用菌種營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，照金黃色葡萄球菌菌懸液項(xiàng)下的方法制備菌懸液，供當(dāng)日使用。 啤酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae9736懸液 取啤酒酵母菌的V號(hào)培養(yǎng)基瓊脂斜面培養(yǎng)物，用接種環(huán)取菌

15、苔少許接種于號(hào)培養(yǎng)基斜面上，在3235培養(yǎng)24小時(shí)，用滅菌水將菌苔洗下，放至含有滅菌玻璃珠的試管中，振搖均勻，以當(dāng)日使用為宜。試驗(yàn)菌的菌齡對(duì)抑菌圈邊緣清晰度有一定影響，應(yīng)保持菌種新鮮。對(duì)易變異的菌株如藤黃微球菌等，宜在制備菌液前進(jìn)行單菌落的分離，選擇典型菌落以保持菌懸液中菌群的一致性，以使所得的抑菌圈邊緣清晰、整齊。6 操作法6.1 稱(chēng)量 稱(chēng)量前先將標(biāo)準(zhǔn)品從冰箱中取出，使其溫度與室溫平衡。 供試品與標(biāo)準(zhǔn)品 的稱(chēng)量應(yīng)使用用一架天平；對(duì)于吸濕性較強(qiáng)的抗生素，應(yīng)在稱(chēng)量前12小時(shí)更換天平內(nèi)干燥劑。 標(biāo)準(zhǔn)品與供試品的稱(chēng)量盡量一次取樣稱(chēng)取，不得將已取出的稱(chēng)取物倒回原容器內(nèi)。標(biāo)準(zhǔn)品的稱(chēng)取量不得少于20mg，

16、取樣后立即將盛有樣品的稱(chēng)量瓶或適宜的容器用蓋蓋好，以免吸水。稱(chēng)樣量的計(jì)算： W= V·C P式中W為需稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)品或供試品的重量（mg）；V為溶解標(biāo)準(zhǔn)品或供試品制成濃溶液時(shí)用容量瓶的體積（ml）；C為標(biāo)準(zhǔn)品或供試品濃溶液的濃度（u/ml或µg/ml）；P為標(biāo)準(zhǔn)品的純度或供試品的估計(jì)效價(jià)（u/mg或µg/mg）。6.2 稀釋 稀釋操作應(yīng)遵照容量分析的操作規(guī)程進(jìn)行。 用于溶解及稀釋標(biāo)準(zhǔn)品或供試品的容量瓶和移液管等玻璃量器，應(yīng)按“常用玻璃量器國(guó)家計(jì)量檢定規(guī)程”進(jìn)行標(biāo)定，符合A級(jí)的要求。每步稀釋?zhuān)咳×坎坏蒙儆?ml，稀釋步驟一般不超過(guò)3步。舉例：量取貯備液（1000u/m

17、l），進(jìn)行以下稀釋。 50ml量瓶，稀釋至刻度第一步 精密量取5ml（1000u/ml） 100 u/ml 50ml量瓶，稀釋至刻度第一步 精密量取5ml（1000u/ml） 10 u/ml（H） 100ml量瓶，稀釋至刻度第一步 精密量取5ml（1000u/ml） 5 u/ml（L） 量取供試品溶液盡量使用刻度移液管，正式量取前要用供試液流洗23次，吸取供試溶液后，用濾紙將外壁多余液體拭去，從起始刻度開(kāi)始放溶液。 標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液應(yīng)使用同一緩沖液（溶劑）稀釋?zhuān)员苊庖騪H或濃度不同而影響測(cè)定結(jié)果。稀釋時(shí)，每次加液至接近量瓶刻度前，稍放置片刻，待瓶壁的液體完全流下，再準(zhǔn)確補(bǔ)加至刻度。 二

18、劑量（2.2）法的標(biāo)準(zhǔn)品溶液及供試品溶液高、低濃度之比為1:0.8。但所選用的濃度必須在劑量反應(yīng)直線范圍內(nèi)。6.3 雙碟制備 雙碟的制備應(yīng)在半無(wú)菌室或潔凈室內(nèi)進(jìn)行，并注意避免微生物及抗生素的污染。培養(yǎng)基應(yīng)在水浴中或微波爐內(nèi)融化，避免直火加熱。 底層 用滅菌大口20ml吸管或其他滅菌分裝器，吸取已融化的培養(yǎng)基20ml注入雙碟內(nèi)，待凝固后更換干燥的陶瓦蓋，放置于3537培養(yǎng)箱中保溫，使菌層易于攤布。 菌層 取出試驗(yàn)用菌懸液，按預(yù)試好的加菌量（2.2）法標(biāo)準(zhǔn)品溶液的高濃度所致的抑菌直徑在1822mm，（3.3）法標(biāo)準(zhǔn)品溶液的中心濃度所致的抑菌圈直徑在1518mm，用滅菌吸管吸取懸液適量，加入已融化并

19、保溫在水浴中（水浴溫度，細(xì)菌為4850。芽孢可至60）的培養(yǎng)基內(nèi)，搖勻，作為菌層培養(yǎng)基用。取出加有底層培養(yǎng)基的雙碟，用滅菌大口5ml、10ml吸管或其他適宜分裝器，吸取菌層培養(yǎng)基5ml，加于底層培養(yǎng)基上，使其均勻攤布，用干燥陶瓦蓋覆蓋，放置2030分鐘，待凝固。 放置鋼管 用鋼管放置器，將滅菌的鋼管放入貯管筒（杯）內(nèi)，按說(shuō)明書(shū)的要求操作，使鋼管平穩(wěn)地落在培養(yǎng)基上，注意使各鋼管下落的高度基本一致。如無(wú)鋼管放置器，可用小眼科鑷子夾持鋼管，輕輕地放置在培養(yǎng)基上，相應(yīng)劑量的鋼管對(duì)角均勻放置。鋼管放妥后，應(yīng)使雙碟靜置510分鐘，鋼管在瓊脂上沉穩(wěn)后，再開(kāi)始滴加抗生素溶液。6.4 滴加抗生素溶液 每批供試品

20、取不少于6個(gè)雙碟，滴加溶液用滅菌毛細(xì)滴管或微量加樣器（調(diào)節(jié)加樣量約為200300µl），在滴加之前須用溶液洗23次。 滴加標(biāo)準(zhǔn)品及供試品溶液順序，因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)方法不用而異。（2.2）法，在雙碟的4個(gè)鋼管中分別成“Z”字形滴加標(biāo)準(zhǔn)品（S）及供試品（T）高（H）、低（L）兩種濃度的溶液，即滴加溶液的順序?yàn)镾HTHTLSL；（3.3）法的6個(gè)鋼管中間隔3個(gè)鋼管中分別滴加標(biāo)準(zhǔn)品及供試品高（H）、中（M）、低（L）3種濃度溶液，并使相同濃度成對(duì)角，滴加順序?yàn)镾HTHSMTMSLTL。滴加溶液至鋼管口平滿(mǎn)，注意滴加溶液的間隔不可過(guò)長(zhǎng)，否則因鋼管內(nèi)溶液的擴(kuò)散時(shí)間不同會(huì)影響測(cè)定結(jié)果。 每份滴加的溶液為

21、同一單位，但雙碟數(shù)每次不超過(guò)5個(gè)，如果1份溶液滴加雙碟數(shù)目多，可分次滴加。每種溶液各用1支毛細(xì)滴管。 滴加完畢，用陶瓦蓋覆蓋雙碟，平穩(wěn)置于雙碟托盤(pán)內(nèi)，雙碟疊放不可超過(guò)3層，以免受熱不均，影響抑菌圈大小。將雙碟托盤(pán)水平平穩(wěn)地移入培養(yǎng)箱中間位置，在3537或該藥品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的溫度下培養(yǎng)至所需時(shí)間。6.5 抑菌圈測(cè)量 將培養(yǎng)好的雙碟取出，拿掉陶瓦蓋，將鋼管倒入盛有1:1000新潔爾滅（苯扎溴銨）溶液或其他消毒液內(nèi)滅菌，換以玻璃蓋；測(cè)量抑菌圈前，應(yīng)檢查抑菌圈是否圓整，如有破圈或圈不圓整，應(yīng)舍棄該碟，切忌主觀挑選雙碟或抑菌圈，以免造成測(cè)定結(jié)果的偏倚。 測(cè)量抑菌圈可以使用抑菌圈測(cè)量?jī)x，也可用游標(biāo)卡尺；使用的

22、抑菌圈測(cè)量?jī)x應(yīng)經(jīng)過(guò)檢定，并符合檢定規(guī)程的要求，操作時(shí)應(yīng)按儀器的操作規(guī)程進(jìn)行：使用游標(biāo)卡尺測(cè)量時(shí)，眼睛視線應(yīng)與讀數(shù)刻度垂直，用卡尺的尖端與抑菌圈直徑的切點(diǎn)成垂直方向測(cè)量。7 記錄與計(jì)算7.1 記錄 試驗(yàn)記錄應(yīng)包括抗生素藥品名稱(chēng)、規(guī)格、批號(hào)、生產(chǎn)廠、檢查編號(hào)、檢查依據(jù)、檢驗(yàn)日期、溫度、相對(duì)濕度、標(biāo)準(zhǔn)品名稱(chēng)、標(biāo)準(zhǔn)品批號(hào)、標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)源及標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)示含量、試驗(yàn)菌名稱(chēng)及菌懸液濃度、培養(yǎng)基名稱(chēng)、來(lái)源及批號(hào)、緩沖液名稱(chēng)及pH、供試品估計(jì)效價(jià)、抑菌圈測(cè)量?jī)x型號(hào)及編號(hào)、標(biāo)準(zhǔn)品與供試品的稱(chēng)量、稀釋步驟、試驗(yàn)人與校核人、抑菌圈測(cè)量及數(shù)據(jù)處理結(jié)果。當(dāng)用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑時(shí)，應(yīng)將測(cè)得數(shù)據(jù)按相應(yīng)劑量濃度以列表形式記錄。用測(cè)

23、量?jī)x測(cè)量抑菌圈面積或直徑時(shí)，應(yīng)將儀器的測(cè)量、數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計(jì)分析及計(jì)算結(jié)果打印后貼附于記錄頁(yè)上。7.2 計(jì)算 二劑量法（2.2法）效價(jià)計(jì)算公式P=log-1T2+T1S2S1 =I×100% T2+S2T1S1式中 P為供試品效價(jià)（相當(dāng)于標(biāo)示量或估計(jì)效價(jià)的百分?jǐn)?shù)）； S2為標(biāo)準(zhǔn)品高濃度溶液所致抑菌圈直徑（或面積）的總和； S1為標(biāo)準(zhǔn)品低濃度溶液所致抑菌圈直徑（或面積）的總和； T2為標(biāo)準(zhǔn)品高濃度溶液所致抑菌圈直徑（或面積）的總和； T1為標(biāo)準(zhǔn)品低濃度溶液所致抑菌圈直徑（或面積）的總和； I為高、低劑量之比的對(duì)數(shù)值，2:1時(shí)，I=0.301。4:1時(shí)，I=0.602。舉例 乳糖酸紅霉素效

24、價(jià)測(cè)定結(jié)果計(jì)算（見(jiàn)表1）表1 抑菌圈面積測(cè)量結(jié)果 抑菌圈面積碟數(shù) S1 S2 T2 T11 1571 1276 1581 12682 1481 1199 1523 11733 1523 1302 1497 12634 1518 1214 1533 12265 1573 1237 1543 12686 1546 1219 1580 12247 1495 1260 1526 12408 1530 1237 1548 12639 1605 1256 1593 129310 1649 1272 1608 1320 15491 12472 15532 12528估計(jì)效價(jià)（AT）=603u/mg劑距（I）

25、=0.301P=log-115532+12528-15491-12472 ×0.301×100%=101.1%15491+15532-12472-12528效價(jià)（PT）=P×AT=603u/mg×101.1%=609.8u/mg7.2.2 三劑量法計(jì)算公式P=log-10.1292（T3+T2+T1S3S2S1）×100% S3+T3S1T1式中 S3為標(biāo)準(zhǔn)品高濃度所致抑菌圈直徑（或面積）的總和； S2為標(biāo)準(zhǔn)品中間濃度所致抑菌圈直徑（或面積）的總和； S1為標(biāo)準(zhǔn)品低濃度所致抑菌圈直徑（或面積）的總和； T3為供試品高濃度所致抑菌圈直徑（或面積）

26、的總和； T2為標(biāo)準(zhǔn)品中間濃度所致抑菌圈直徑（或面積）的總和； T1為標(biāo)準(zhǔn)品低濃度所致抑菌圈直徑（或面積）的總和； I為高、低濃度劑量之比的對(duì)數(shù)值，1:08時(shí)，I=0.0969。舉例 新霉素效價(jià)測(cè)定結(jié)果計(jì)算（見(jiàn)表2）。表2 抑菌圈直徑測(cè)量結(jié)果 抑菌圈直徑碟數(shù) S1 S2 S3 T1 T2 T31 16.05 16.20 16.50 15.80 16.35 16.602 16.20 16.45 16.65 16.20 16.45 16.703 16.00 16.45 16.70 16.05 16.35 16.704 15.95 16.35 16.60 16.00 16.25 16.605 15.

27、70 16.25 16.60 15.85 16.25 16.606 15.55 16.20 16.55 15.70 16.20 16.607 15.65 16.20 16.40 15.80 16.15 16.408 15.90 16.10 16.45 15.80 16.10 16.509 15.60 16.00 16.30 15.70 15.95 16.30 142.60 146.20 148.75 142.90 146.05 149.00估計(jì)效價(jià)（AT）=670u/mg劑距（I）=0.0969P=log-1×100%P=101.1%效價(jià)（PT）=P×AT=101.1%&#

28、215;670u/mg =676.7u/mg8 結(jié)果判定8.1 可靠性測(cè)驗(yàn) 管碟法系根據(jù)量反應(yīng)平行線原理而設(shè)計(jì)，并要求在試驗(yàn)所用的劑量（濃度）范圍內(nèi)，對(duì)數(shù)劑量（濃度）與反應(yīng)呈直線關(guān)系?？煽啃詼y(cè)驗(yàn)即通過(guò)對(duì)劑間變異的分析，以測(cè)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品和供試品的對(duì)數(shù)劑量與反應(yīng)的關(guān)系是否顯著偏離平行直線。（2.2）法的劑間變異分析為試品間、回歸和偏離平行三項(xiàng)；（3.3）法還需再分析二次曲線和反向二次曲線，如用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，可用（2.2）法和（3.3）法的專(zhuān)用數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理和結(jié)果計(jì)算。用抑菌圈測(cè)量?jī)x測(cè)量抑菌圈時(shí)，測(cè)量與統(tǒng)計(jì)學(xué)處理一次完成，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析按藥典附錄的生物檢定統(tǒng)計(jì)法進(jìn)行F的顯著性

29、測(cè)驗(yàn)。（2.2）法要求直線回歸和劑間要非常顯著（P<0.01），偏離平行不應(yīng)顯著（P>0.05）；（3.3）法除（2.2）法的上述規(guī)定外，尚需考察二次曲線和反向二次曲線，且二者均應(yīng)不顯著（P>0.05），符合以上各項(xiàng)規(guī)定后，才能認(rèn)為試驗(yàn)結(jié)果可靠，方可進(jìn)行效價(jià)和可信限率計(jì)算。8.2 可信限率 考核試驗(yàn)的精密度。除藥典各論另有規(guī)定外，管碟法的可信限率不得超過(guò)5%。上述各項(xiàng)都能符合者，試驗(yàn)結(jié)果成立。8.3 試驗(yàn)計(jì)算所得效價(jià)低于估計(jì)效價(jià)的90%或高于估計(jì)效價(jià)的110%，則檢驗(yàn)結(jié)果僅作為初試，應(yīng)調(diào)整供試品估計(jì)效價(jià)，予以重試。8.4 原料藥效價(jià)測(cè)定一般需做雙份樣品平行試驗(yàn)，以使核對(duì)。對(duì)于

30、檢驗(yàn)結(jié)果不符合規(guī)定的樣品，應(yīng)有可靠性測(cè)驗(yàn)及可信限率均符合規(guī)定，且測(cè)定結(jié)果在估計(jì)效價(jià)（原料藥）或標(biāo)示量（制劑）±10%范圍內(nèi)的至少2個(gè)效價(jià)測(cè)定結(jié)果，必要時(shí)應(yīng)請(qǐng)其他檢驗(yàn)人員復(fù)核，才能發(fā)出檢驗(yàn)報(bào)告。8.5 效價(jià)測(cè)定結(jié)果的有效數(shù)字按藥典規(guī)定及數(shù)字的原則取舍。9 操作要點(diǎn)9.1抗生素原料藥 不含輔料的藥物制劑原料，一般其效價(jià)以純度（u/mg或µg/mg）表示。檢驗(yàn)時(shí)，可參考該品種的藥品標(biāo)準(zhǔn)純度限度規(guī)定或廠方提供的純度估計(jì)效價(jià)，取樣試驗(yàn)，如估計(jì)效價(jià)與實(shí)際效價(jià)相差較遠(yuǎn)時(shí)，即測(cè)定所得效價(jià)超出估計(jì)效價(jià)的±10%時(shí)，則重新估計(jì)效價(jià)，再做準(zhǔn)確測(cè)定。原料藥一般皆以干燥品或無(wú)水物折算效價(jià)，

31、須先測(cè)其含水或未折干效價(jià)，再根據(jù)供試品的水分或干燥失重測(cè)定結(jié)果折算成無(wú)水物或干燥品的效價(jià)。干燥品或無(wú)水物效價(jià)（u/mg）= 濕品（或未折干品）效價(jià)（u/mg） 1-供試品干燥失重或水分%9.2 抗生素制劑 粉針劑 指注射用無(wú)菌粉末或凍干品，用西林瓶橡膠塞鋁蓋封裝或熔封在安瓿內(nèi)，一般測(cè)定其純度（u/mg或µg/mg）或整瓶效價(jià)。取裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容物，稱(chēng)取適量（50mg以上，根據(jù)標(biāo)示量及平均裝量折算估計(jì)效價(jià)，并按估計(jì)效價(jià)及量瓶體積計(jì)算取樣量），置量瓶中，加標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的溶劑溶解，稀釋?zhuān)瑴y(cè)定，計(jì)算出1mg的效價(jià)單位數(shù)，再根據(jù)平均裝量及標(biāo)示量計(jì)算平均每瓶的百分含量。 水針劑（注射液） 即抗生

32、素的滅菌水溶液，標(biāo)示量一般按每毫升含效價(jià)單位計(jì)。效價(jià)測(cè)定時(shí)，量取平均裝量項(xiàng)下的內(nèi)容物或510支的內(nèi)容物，混勻，用干燥的刻度吸管吸取一定量的供試品，將吸管外壁用濾紙拭凈，再棄去多余的溶液，使供試品至吸管刻度，沿量瓶頸部?jī)?nèi)壁緩緩流放入已盛有一定量溶劑（以免抗生素結(jié)晶析出）的量瓶?jī)?nèi)，混勻，繼續(xù)加溶劑至刻度，搖勻，再量取適量稀釋至規(guī)定的濃度。 片劑 包括素片、薄膜衣片、糖衣片及腸溶片。素片、薄膜衣片 稱(chēng)取20片的總量，求出平均片重，研細(xì)混勻后，精密稱(chēng)取適量（約相當(dāng)于1片的重量或根據(jù)標(biāo)示量按平均片重及所用量瓶體積折算取樣量），置量瓶中，用標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的溶劑溶解，并稀釋至刻度，搖勻。再量取適量稀釋至規(guī)定濃度

33、。注意點(diǎn)：研磨時(shí)應(yīng)注意環(huán)境干燥，可在干燥操作柜內(nèi)操作，研磨要迅速，避免吸濕，因片劑內(nèi)含輔料較多，輔料可能漂浮于溶液表面，稀釋時(shí)量取供試溶液應(yīng)讀取輔料下層的溶液切面；如沉淀較多，須待其下沉后再量取上層液；有些輔料吸附抗生素，應(yīng)加以注意。為節(jié)約供試品，可與重量差異檢查結(jié)果進(jìn)行。糖衣片、腸溶片 取標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的片數(shù)，置于乳缽中，研細(xì)，分次加入規(guī)定的溶劑，研磨使其溶解，將研磨液轉(zhuǎn)移至瓶口放有小漏斗的量瓶中，量瓶體積根據(jù)供試品標(biāo)示量、所取片數(shù)及抗生素儲(chǔ)備液濃度（一般為1000單位/ml）選定，用規(guī)定溶劑稀釋至刻度，搖勻，靜置，使輔料下沉而抗生素已溶解在溶液內(nèi)，精密吸取量瓶中的上層液適量，作進(jìn)一步稀釋。個(gè)別

34、品種標(biāo)準(zhǔn)如同時(shí)收載了糖衣片和薄膜衣片，可能規(guī)定薄膜衣片也取整片制備供試品溶液。 膠囊劑 取裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容物，混合均勻，研細(xì)，根據(jù)平均裝量，精密稱(chēng)取約相當(dāng)于1粒膠囊的量或按標(biāo)示量、量瓶體積及抗生素儲(chǔ)備液濃度等計(jì)算的取樣量，置于量瓶中，加規(guī)定的溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，如供試品含有較多的輔料，則照片劑項(xiàng)下的方法進(jìn)行。 顆粒劑、干混懸劑 取裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容物，混勻，根據(jù)平均裝量，精密稱(chēng)取約相當(dāng)于1袋（包）的量或按標(biāo)示量、量瓶體積及抗生素儲(chǔ)備液濃度等計(jì)算的取樣量，置于量瓶中，加規(guī)定的溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻。量取適量稀釋制成供試品溶液。測(cè)得效價(jià)后，再根據(jù)裝量差異項(xiàng)下的平均裝量，計(jì)算出平均每袋

35、（包）的效價(jià)，根據(jù)標(biāo)示量即可算出含量。 軟膏劑、眼膏劑 擦凈軟膏劑或眼膏劑軟管的外壁，切開(kāi)封口，置于干燥器內(nèi)約1小時(shí)，取干燥的潔凈分液漏斗，帶手套操作，將膏劑軟管連同內(nèi)容物在天平上稱(chēng)重，取出，將內(nèi)容物擠入分液漏斗，量約2g，再稱(chēng)取膏劑軟管的重量，按減重法以前后稱(chēng)量之差計(jì)算分液漏斗內(nèi)膏劑供試品的量，以不號(hào)過(guò)氧化物的乙醚或石油醚等作溶劑溶解基質(zhì)，但基質(zhì)中抗生素則應(yīng)不溶于或幾乎不溶于該有機(jī)溶劑中，以避免提取過(guò)程中抗生素的損失。按標(biāo)準(zhǔn)中的規(guī)定加提取溶劑至分液漏斗中，振搖，使基質(zhì)溶解，用規(guī)定的緩沖溶液提取抗生素至說(shuō)相中，用緩沖溶液提取3次，合并3次的提取液，置量瓶中，加緩沖溶液至刻度，搖勻，量取適量稀釋

36、至規(guī)定的濃度，滴加雙碟，培養(yǎng)，測(cè)量抑菌圈，數(shù)據(jù)處理，可靠性測(cè)驗(yàn)及可信限率判斷，計(jì)算效價(jià)?？股匚⑸锉葷岱?0 儀器與用具10.1 操作室 要求同管低法10.2 分光光度計(jì) 應(yīng)有數(shù)字顯示功能和自動(dòng)記錄裝置，數(shù)顯精度應(yīng)在小數(shù)點(diǎn)后三位。10.3 玻璃大試管 20.5mm×2.5mm或適宜的試管，應(yīng)大小一致，厚薄均勻，玻璃質(zhì)地相同，使用同一品牌和批號(hào)。使用過(guò)的試管經(jīng)滅菌后，將培養(yǎng)基傾出，用水清洗，瀝干，再用硫酸重鉻酸鉀洗液浸泡，清水沖洗干凈后，晾干，在160干烤23小時(shí)滅菌，保持潔凈，備用。注意避免污染毛點(diǎn)、纖維等，以免干擾測(cè)定結(jié)果。10.4 移液管 10ml或20ml刻度容量，管口需磨粗

37、（大），以便快速分裝培養(yǎng)基。10.5 恒溫水浴箱 工作體積600mm×300mmmm×150mm（長(zhǎng)×寬×高）。電熱恒溫水浴。10.6 電動(dòng)攪拌器 將二臺(tái)電動(dòng)攪拌器的槳葉置于恒溫水浴的大試管隨機(jī)區(qū)組培養(yǎng)方列的兩側(cè)，于水中攪動(dòng)，以使水溫均勻。本身帶有攪拌或循環(huán)水系統(tǒng)的恒溫水浴箱，可不再配備電動(dòng)攪拌器。10.7 分光光度計(jì)用吸收池 方形玻璃吸收池或石英吸收池，透光面1cm，用硝酸硫酸混合液（取濃硫酸95ml，加濃硝酸35ml，混勻）浸泡148小時(shí)（浸泡時(shí)間視是否能去除附著污物而定），先后用水、去離子水（蒸餾水）沖洗干凈，晾干，備用。如仍不能除去附著污物，可用

38、1%2%硝酸鈉的濃硫酸溶液浸泡后，再經(jīng)水洗滌。10.8 其他 分析天平、稱(chēng)量瓶、量瓶、25ml及50ml滴定管、秒表、濾紙及鏡頭紙等。11 試管 除同管碟法的要求外，比濁法用的緩沖液應(yīng)澄清無(wú)色，緩沖液配制后用垂熔玻璃漏斗濾過(guò)，除去沉淀等不溶物，使溶液澄清。使用前滅菌。12 培養(yǎng)基 除同管碟法的要求外，比濁法使用的培養(yǎng)基應(yīng)澄清，顏色以盡量淺為佳，培養(yǎng)后培養(yǎng)基本身不得出現(xiàn)渾濁。培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后不得發(fā)生沉淀。根據(jù)這一原則，通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基原材料的預(yù)試，挑選合適品牌廠家的產(chǎn)品使用。目前，已有一些種類(lèi)的市售干燥培養(yǎng)基，如營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，改良馬丁培養(yǎng)基等，使用方便。13 試驗(yàn)用菌液13.1金黃色葡萄球菌（Sta

39、phylococus aureus）懸液 取金黃色葡萄球菌CMCC（B）26 003的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，在3537培養(yǎng)2022小時(shí)。臨用時(shí)，用滅菌水或0.9%滅菌氧化鈉溶液將菌苔洗下，備用。13.2 大腸桿菌（Eschehchia coli）懸液 取大腸桿菌CMCC（B）44 103的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，在3537培養(yǎng)2022小時(shí)。臨用時(shí)，用滅菌水將菌苔洗下，備用。13.3 白色念珠菌（Candida albicans）懸液 取白色念珠菌CMCC（F）98 001的改良馬丁瓊脂斜面的新鮮培養(yǎng)物，接種于10ml培養(yǎng)基（中國(guó)藥典2005年版

40、二部附錄 A 抗生素微生物檢定法）中，在3537培養(yǎng)8小時(shí)，再用培養(yǎng)基稀釋至適宜濃度，備用。14 操作方法14.1 稱(chēng)量 要求同管碟法。14.2 稀釋 標(biāo)準(zhǔn)品與供試品溶液的稀釋?xiě)?yīng)使用經(jīng)標(biāo)定的量瓶，每步稀釋的量取量以不少于2ml為宜，稀釋步驟一般不超過(guò)3步。14.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線法 標(biāo)準(zhǔn)品溶液 按中國(guó)藥典該品種含量測(cè)定項(xiàng)下的要求，制成一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。在該品種項(xiàng)下規(guī)定的劑量反應(yīng)線性范圍內(nèi)，以線性濃度范圍的中間值作為中間濃度，標(biāo)準(zhǔn)品溶液選擇5個(gè)劑量，劑量間的比例應(yīng)適宜（通常為1:1.25或更?。?。 供試品溶液 根據(jù)估計(jì)效價(jià)或標(biāo)示量，取供試品按標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備方法，選擇中間濃度，不少于3個(gè)試管。

41、含試驗(yàn)菌液體培養(yǎng)基的制備 臨用前，取規(guī)定的試驗(yàn)菌懸液適量（3537培養(yǎng)34小時(shí)后測(cè)定的吸光度在0.30.7之間），加入到各液體培養(yǎng)基管中，混合均勻，使在試驗(yàn)條件下能得到滿(mǎn)意的劑量反應(yīng)關(guān)系和適宜的測(cè)定濁度（吸光度）。含試驗(yàn)菌液體培養(yǎng)基在配制后應(yīng)立即使用，必要時(shí)可適當(dāng)冷卻，以防止試驗(yàn)菌在培養(yǎng)前生長(zhǎng)。 線性試驗(yàn) 取適宜的大小厚度均勻的已滅菌試管，再各個(gè)試管內(nèi)分別精密加入各個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和供試品溶液各1.0ml，再精密加入含試驗(yàn)菌的液體培養(yǎng)基9.0ml，立即混勻，按隨機(jī)區(qū)組分配將各個(gè)試驗(yàn)管放置于恒溫水浴內(nèi)，在規(guī)定的條件下培養(yǎng)（通常約4小時(shí)）至適宜測(cè)量的濁度值（吸光度值）。各濃度不少于4個(gè)試管。14.4

42、 平行線測(cè)定法（二劑量（2.2）和三劑量（3.3）法） 標(biāo)準(zhǔn)品溶液 按中國(guó)藥典該品種含量測(cè)定項(xiàng)下的要求，制成一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。在該品種項(xiàng)下規(guī)定的劑量反應(yīng)線性范圍內(nèi)，選擇2個(gè)或3個(gè)劑量，劑量間的比例應(yīng)適宜（二劑量通常為2:1或4:1，三劑量通常為1:0.8）。 供試品溶液 根據(jù)估計(jì)效價(jià)或標(biāo)示量，取供試品按標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備方法，選擇2個(gè)或3個(gè)劑量。 含試驗(yàn)菌液體培養(yǎng)基的制備 同14.3.3配制方法。 標(biāo)準(zhǔn)品及樣品測(cè)定 取適宜的大小厚度均勻的已滅菌試管，在各個(gè)試管內(nèi)分別精密加入2個(gè)或3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和供試品溶液各1.0ml，再精密加入含試驗(yàn)菌的液體培養(yǎng)基9.0ml，立即混勻，按隨機(jī)區(qū)組分配將各管在規(guī)定條件下培養(yǎng)至適宜測(cè)量的濁度值（通常約為4小時(shí)）。各濃度不少于4個(gè)試管。14.5 空